Lensfree en el chip tomográfica Microscopía empleo de multi-ángulo de iluminación y píxeles de super-resolución
16 de agosto de 2012
Lensfree tomografía óptica es una técnica de microscopía tridimensional que ofrece una resolución espacial de <1 m × m <1 × menos de 3 micras x, y y z dimensiones, respectivamente, más una gran imagen-volumen de 15-100 mm 3, Que puede ser particularmente útil para la integración con laboratorio en un chip plataformas.
El objetivo general de este procedimiento es lograr imágenes tridimensionales en chip sin lentes de muestras biológicas en un gran volumen de imágenes. Esto se logra colocando primero la muestra directamente en el chip sensor y proporcionando una iluminación parcialmente coherente. El segundo paso es desplazar lateralmente la fuente de luz de diferentes posiciones para grabar.
Los subpíxeles desplazaron las imágenes holográficas de la muestra. A continuación, los subpíxeles se desplazaron. Las imágenes holográficas se registran a múltiplos de iluminación para la obtención de imágenes tomográficas.
El paso final es el procesamiento de datos, donde el conjunto de datos adquiridos se reconstruye digitalmente para obtener finalmente imágenes tomográficas tridimensionales de la muestra. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la microscopía óptica convencional, es que proporciona imágenes de alto rendimiento en una arquitectura compacta. Esto hace que nuestra plataforma sea particularmente útil para la integración con plataformas de chips del Líbano.
En este informe, se describe la configuración básica de imágenes para una implementación de sobremesa hacia la tomografía de muestras estáticas. Un monocromador con una lámpara de xenón se ajustó para proporcionar una salida con un ancho espectral de aproximadamente uno a 10 nanómetros alrededor de una longitud de onda central de 450 a 650 nanómetros. Esta salida parcialmente coherente se acopla a una fibra óptica multimodo para proporcionar luz parcialmente coherente al sistema.
La fibra óptica está montada en una etapa de rotación motorizada para cambiar el ángulo de iluminación. La etapa motorizada con la fuente de luz conectada está montada en una etapa XY lineal bidimensional, que se utiliza para lograr cambios planos de la fuente de luz en un ángulo determinado para la detección. Se utiliza un conjunto de sensores A-C-M-O-S de cinco megapíxeles con un tamaño de píxel de 2,2 micras.
El detector se utiliza para registrar el amplio campo de visión de las imágenes holográficas de las muestras. Es fundamental que el conjunto de sensores se coloque en el mismo plano axial que el eje de rotación de la fuente de luz para asegurarnos de que comprobamos si el sensor recibe suficiente luz en grandes ángulos de iluminación. Si bien la tomografía óptica sin lentes puede obtener imágenes de una variedad de objetos, como células y microorganismos, los principios básicos se demuestran aquí mediante la realización de microscopía tridimensional de una muestra de elgan marino con un bisturí o una espátula.
Tome un pequeño trozo de AGA de la placa de Petri que contiene el cultivo de órganos selladores. Una pieza cúbica de varios milímetros a lo largo de cada dimensión contendrá cientos de nematodos. Coloque el pequeño trozo de agar en un vial de polipropileno que contenga un mililitro de agua desionizada.
Realice un vórtice suave durante 30 segundos a un minuto. Después de 10 a 15 minutos, el gusano debe arrastrarse fuera del agar hacia el agua desionizada. Tenga en cuenta que los gusanos son demasiado pequeños para verlos aquí con el fin de inmovilizar temporalmente los gusanos y un mililitro de cinco a 10 milimolares Lima.
Así que solucione y espere 10 minutos. Pipetear de cinco a 10 microlitros de muestra desde el fondo del vial y colocarla entre dos cubreobjetos. Esta muestra que contiene un gran número de gusanos inmovilizados temporalmente se puede colocar en el detector para iniciar la adquisición de datos.
Con fines de demostración, los pasos de adquisición de imágenes para una tomografía óptica sin lente típica o un experimento LOT se resumen en esta sección, sin embargo, todo el proceso se ha automatizado mediante el uso de la interfaz de vista de laboratorio desarrollada a medida. Para comenzar los pasos manuales, ajuste el ángulo inicial de la etapa de rotación a menos 50 grados, donde cero grados corresponde a la posición vertical de la fuente de luz. Ajuste la posición inicial de la etapa XY a cero cero, que es la posición inicial.
Ajuste el tiempo de exposición del detector para utilizar mejor su rango dinámico, de modo que la imagen sea lo más brillante posible sin píxeles saturados, sin cambiar el ángulo de la etapa de rotación. Captura nueve imágenes para cada imagen. Mueva la etapa XY a una nueva posición en una cuadrícula cuadrada de tres por tres, de modo que cada imagen se desplace aproximadamente un cuarto de píxel en comparación con la anterior.
La adquisición de más imágenes en cada ángulo puede mejorar la resolución en función del tipo de objeto y de la relación señal-ruido. Después de recopilar nueve imágenes en el ángulo inicial, ajuste la posición de la etapa XY a la posición cero cero. A continuación, aumente el ángulo de la etapa de rotación en incrementos de dos grados hasta llegar a 50 grados positivos.
Después de cada incremento en cada nuevo ángulo, repita los pasos descritos. Los incrementos angulares pueden ser más finos o más gruesos en función de la optimización del tiempo de adquisición en comparación con la resolución de la imagen. Después de la adquisición de datos, se adquiere un conjunto de 459 imágenes, que contienen imágenes desplazadas de nueve subpíxeles para cada uno de los 51 ángulos diferentes de iluminación.
Cada conjunto de nueve imágenes se procesa digitalmente utilizando algoritmos de superresolución de píxeles para obtener una proyección de alta resolución. Holograma por ángulo de píxel super resultado se reconstruye digitalmente para obtener 51 imágenes de proyección. El procesamiento de datos se muestra aquí utilizando una computadora portátil.
La reconstrucción tomaría menos de un segundo para un campo de visión completo utilizando unidades de procesamiento gráfico. Este conjunto de 51 imágenes de proyección se proyecta posteriormente con el plugin Tom OJA. Para la imagen J, las imágenes de proyección se cargan primero en la imagen J, después de lo cual se invoca el complemento Tom OJ.
Una tabla de búsqueda que proporciona el ángulo de visión de cada imagen de proyección se carga en OJ. Utilizando el método de retroproyección ponderada, se pueden obtener imágenes tomográficas tridimensionales del espécimen. Aquí se demuestra el gran campo de visión de la tomografía óptica sin lentes, ya que la muestra se coloca directamente en la parte superior del conjunto de detectores. Las imágenes holográficas de los objetos se pueden grabar en un campo de visión de 24 milímetros cuadrados, que se puede aumentar aún más utilizando conjuntos de detectores emergentes con áreas activas más grandes.
Aunque el tamaño de píxel de la matriz de detectores limita la resolución de las imágenes holográficas grabadas, las técnicas de superresolución de píxeles mitigan este problema: aquí se muestran hologramas de superresolución de píxeles, junto con las imágenes de proyección reconstruidas que ofrecen una resolución espacial submicrométrica para tres ángulos diferentes de iluminación. Las imágenes de proyección se pueden combinar utilizando técnicas de reconstrucción de imágenes tomográficas para calcular los terrenos de TOM del espécimen. Aquí se muestran tres imágenes de corte en el plano XY a través de la parte anterior del gusano, donde el tubo faríngeo es visible solo en el corte a través de Z igual a ocho micras, como se espera de esta estructura aproximadamente cilíndrica con un diámetro exterior aproximado de cinco micras.
Además, la imagen transversal en el plano XZ muestra claramente los límites del gusano y el tubo faríngeo en el interior, lo que demuestra el éxito de la obtención de imágenes en 3D de la faringe. Con su desarrollo, esta técnica puede allanar el camino para que los investigadores realicen microscopía tridimensional en tubos de decenas de milímetros de volumen de imagen. Por lo tanto, la tomografía óptica sin lentes puede ser una herramienta útil para aplicaciones de imágenes de alto rendimiento en plataformas de chips del Líbano.
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Descripción general
Este artículo trata sobre la tomografía óptica sin lentes, una técnica de microscopía tridimensional que permite la obtención de imágenes de alta resolución de especímenes biológicos. El método posibilita la obtención de imágenes en un volumen amplio, lo que la hace adecuada para su integración con plataformas de laboratorio-en-un-chip.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Imagen biológica
- Técnicas de microscopía
Antecedentes
- La tomografía óptica sin lentes proporciona una resolución espacial de <1 μm × <1 μm × <3 μm.
- La técnica es capaz de imaginar volúmenes entre 15-100 mm³.
- Es particularmente beneficiosa para aplicaciones en tecnologías de laboratorio sobre un chip.
- Este método utiliza iluminación parcialmente coherente para la formación de imágenes.
Objetivo del estudio
- Lograr imágenes tridimensionales sin lentes de especímenes biológicos.
- Explorar la integración de esta técnica con plataformas de laboratorio sobre un chip.
- Mejorar las capacidades de imagen en grandes volúmenes.
Métodos Utilizados
- Colocación de la muestra directamente sobre el chip sensor.
- Uso de iluminación parcialmente coherente.
- Desplazamiento lateral de la fuente de luz para registrar imágenes holográficas con desplazamiento subpíxel.
- Registro de múltiples imágenes holográficas para imágenes tomográficas.
Resultados principales
- Imágenes exitosas de especímenes biológicos en tres dimensiones.
- Demuestra capacidades de alta resolución espacial.
- Integración efectiva con plataformas de laboratorio en un chip.
- Validación del método mediante diversas pruebas de imagen.
Conclusiones
- La tomografía sin lentes es una técnica prometedora para la imagen biológica.
- El método ofrece ventajas significativas en resolución espacial y volumen de imagen.
- Las aplicaciones futuras podrían expandirse a diversos campos de la investigación biológica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La microscopía tomográfica sin lentes y basada en chip permite la obtención de imágenes 3D de alta resolución, sin marcado y de gran volumen, de especímenes biológicos, sin necesidad de óptica voluminosa, lo que facilita su integración con plataformas microfluídicas y de laboratorio en un chip. Este enfoque reduce el tamaño y el costo del instrumento, manteniendo una resolución submicrométrica, y aborda los cuellos de botella en la etapa de descubrimiento relacionados con el rendimiento de la muestra y la compatibilidad de los ensayos. La tecnología mejora la confianza predictiva en la validación temprana de objetivos al proporcionar datos estructurales cuantitativos con resolución en profundidad para la selección fenotípica y la reducción mecanicista de riesgos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación de hipótesis terapéuticas mediante la visualización tridimensional de fenotipos celulares y orgánulos subcelulares.
- Valor operativo: Facilita la obtención de imágenes sin marcadores en especímenes vivos, reduciendo artefactos de preparación y preservando la biología nativa para estudios de interacción con el blanco.
- Valor predictivo: Genera datos volumétricos cuantitativos para aclarar el mecanismo de acción y reducir los riesgos asociados a las vías del blanco en las fases iniciales del descubrimiento.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Proporciona imágenes 3D con resolución submicrométrica en grandes campos de visión, lo que permite cribado fenotípico de alto contenido de microorganismos y poblaciones celulares.
- Valor operativo: Elimina la necesidad de lentes y óptica compleja, estandarizando los flujos de trabajo de imagen para el desarrollo de ensayos reproducibles y escalables.
- Preparación para ensayos: Facilita la preparación de sistemas biológicos validados para la evaluación de compuestos posteriores mediante la adquisición automatizada de datos de alto rendimiento.
Investigación Translacional y Preclínica
- Continuidad traslacional: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica al proporcionar imágenes 3D consistentes en sistemas modelo como C. elegans y embriones de pez cebra.
- Reducción de riesgos mecanicistas: Permite el seguimiento longitudinal de cambios estructurales en sistemas relevantes para enfermedades, apoyando la alineación de biomarcadores y decisiones de avance ajustadas al riesgo.
- Fidelidad del modelo preclínico: Conserva la arquitectura y dinámica tisular nativas, mejorando la trasladabilidad de los hallazgos desde contextos in vitro a in vivo.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la biología inicial hasta la identificación de compuestos activos, apoyando la comprobación de hipótesis, la estandarización de ensayos y los análisis cuantitativos sin necesidad de procesamiento extenso de muestras ni etiquetado.
- Biología de Descubrimiento: Permite la comprobación de hipótesis y la clarificación de vías mediante la visualización 3D de fenotipos estructurales en sistemas biológicos no perturbados.
- Selección: Proporciona imágenes listas para ensayos, reproducibles y con resultados cuantitativos para comparar condiciones de control y tratamiento en grandes poblaciones de muestras.
- Análisis: Genera reconstrucciones tomográficas resueltas por profundidad e imágenes de proyección que facilitan la comparación estadística de características morfológicas.
- Investigación Translacional: Aporta continuidad preclínica mediante la obtención de imágenes de organismos modelo relevantes para enfermedades, con resolución y cobertura volumétrica constantes.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma de imagen reutilizable, compatible con diversos tipos de muestras y formatos microfluídicos, reduciendo la inversión tecnológica redundante.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva mediante imágenes 3D de alta resolución sin etiquetado que reducen la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y escalabilidad mediante un diseño sin lentes, adquisición automatizada y compatibilidad con matrices de sensores de gran formato.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al permitir la detección temprana de anomalías fenotípicas, reduciendo el riesgo biológico en fases avanzadas y la ineficiencia de capital.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al proporcionar datos cuantitativos de imágenes multiparamétricas para la comparación objetiva de candidatos terapéuticos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en imágenes computacionales, holografía y algoritmos de reconstrucción tomográfica.
- Depende de matrices de sensores CMOS de alta resolución y etapas de iluminación motorizadas para la captura de datos en múltiples ángulos.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de iluminación, ajustes de exposición y procedimientos de desplazamiento subpíxel para garantizar la reproducibilidad.
- La adaptación a diferentes sistemas modelo puede requerir la optimización de las técnicas de preparación e inmovilización de muestras para mantener la viabilidad durante la adquisición de imágenes.
- Las limitaciones prácticas incluyen la sensibilidad a los índices de refracción y propiedades de dispersión de la muestra, lo que puede afectar la relación señal-ruido en especímenes densos o altamente absorbentes.
