Name: Un In vitro Co-infección modelo para estudiar Plasmodium falciparum-VIH-1 en las interacciones humano primario de monocitos derivados de las células inmunitarias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Aprende a desarrollar un modelo in vitro de coinfección para estudiar los efectos de Plasmodium falciparum sobre la replicación del VIH-1 en macrófagos derivados de monocitos humanos primarios.

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Este trabajo fue apoyado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud a través de un catalizador de Co-infecciones y la concesión co-morbilidades. Los eritrocitos humanos fueron proporcionados por el Centro Hospitalario de l&#39;Université Laval banco de sangre.

Nota: Los experimentos con el VIH-1 y Plasmodium falciparum se debe realizar en el adecuado nivel de laboratorios de bioseguridad (BSL2 para los parásitos, y BSL3 para el VIH-1 y coinfecciones) y la precaución se debe tener especial cuando se utiliza la sangre humana potencialmente infectados. 1. Las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) Purificación (Basado en 8 y 9) <ol><li> Comienza con sangre humana fresca de donantes sanos (500 ml) tratadas con anticoagulantes (heparina, citrato, ácido dextrosa citrato o citrato fosfato dextrosa). El uso libre de endotoxinas reactivos cuando la purificación y aislamiento de CMSP y en el resto del protocolo. </li><li> Desinfecte la bolsa de sangre, incluyendo el tubo, con el 70% de etanol, cortar el tubo y transferir cuidadosamente la sangre en un frasco T150. </li><li> Preparar 16 tubos con 15 ml de medio de separación linfocitos (Ficoll) por cada 50 ml tubo cónico (asegúrese de que Ficoll ha alcanzado la temperatura ambiente).Con cuidado, la capa de 30 ml de sangre fresca en la parte superior. </li><li> Se centrifuga a 400 xg durante 30 min a 20 ° C con rompe. </li><li> Durante la centrifugación, preparar 8 x 50 ml tubos cónicos con 25 ml de solución salina equilibrada de la temperatura ambiente de Hank (HBSS) por tubo. </li><li> Cuidadosamente transferir el anillo de células nublado en la interfase (contiene PBMC) al tubo de 50 ml que contiene el HBSS (piscina 2 anillos de células por tubo). Completar volúmenes de hasta 50 ml con HBSS. </li><li> Se centrifuga a 150 xg durante 15 min a 20 ° C con saltos en. </li><li> Durante la centrifugación del anillo de células nublado, recoger la capa superior amarilla de la etapa de Ficoll, la piscina de plasma para llenar un tubo cónico de 50 ml. Inactivar el complemento en el plasma mediante el calentamiento del tubo de 50 ml a 56 ° C durante 30 min y 10 min a girar 1.800 x g. Mantener el sobrenadante (contiene plasma autólogo diluyó que se puede utilizar como suplemento de medio en pasos posteriores). </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante y resuspensiónd el sedimento celular desde el paso de 1,7 en 25 ml de HBSS y 2 piscina gránulos por tubo de 50 ml. Gira a 300 xg durante 8 minutos a 20 ° C. </li><li> Eliminar el sobrenadante con cuidado y volver a suspender los pellets en 10 ml de HBSS y piscina en un tubo de 50 ml. </li><li> Tomar una alícuota, lleve a cabo la exclusión azul tripán para evaluar la mortalidad y luego contar PBMC. </li><li> Volumen completo a 50 ml con HBSS y centrifugado 10 min a 300 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en RPMI 1640 a 5x10 6 células / ml (se debe obtener alrededor de 400 a 500 x 10 6 PBMC de 500 ml de sangre). </li></ol> 2. Los monocitos-macrófagos derivados (MDM) Diferenciación (Basado en 8 y 9) <ol><li> Semillas de aproximadamente 1,25 x 10 8 PBMC en 15 platos cm con medio RPMI 1640 (25 ml / placa). </li><li> Que las células se adhieran durante 1-2 horas a 37 ° C con 5% atmósfera de CO 2. </li><li> Transferir las células no adheridas en un matraz de nuevo y se lava la placa con 15 ml dos veces endotoxina libre de PBS (5min, 300 xg). Las células adheridas son monocitos aislados. </li><li> Para permitir que los monocitos recién aisladas de diferenciarse en MDM, añadir 20 ml de medio RPMI 1640 suplementado con 5% de plasma autólogo (del paso 1,8). Añadir humana recombinante de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF, 25 ng / ml) y solución de penicilina / estreptomicina (PS, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina). Incubar durante 2 días, cambie a medio e incubar 2-3 días adicionales a 37 ° C en 5% atmósfera de CO 2. </li><li> Retire medio viejo y lavar con endotoxina libre de una vez PBS, agregue el PBS suavemente y aspirar de inmediato. Para separar MDM totalmente diferenciado, tratar las células con ~ Accutase 7 ml (Accutase, una mezcla comercialmente disponible de las proteasas y la actividad colagenolítica que permiten el desprendimiento de células de la placa de plástico) durante 15-20 min a 37 ° C en un 5% de CO 2 atmósfera, el rock suave a media hora. </li><li> Agregar 3.5 ml de plasma autólogo (del paso 1.8) en cada plato (para ayudar a proteger las células, mientras queraspando). </li><li> Raspe suavemente las células que hacen que ese medio cubre las células de todos los tiempos y la transferencia de la piscina / en un tubo de 50 ml. </li><li> Lavar las placas con PBS libre de endotoxina para recuperar mayor cantidad de células posible. </li><li> Gira de 5 minutos a 200 xg, desechar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el sedimento en 5 ml de medio de cultivo MDM (RPMI 1640 suplementado con complemento inactivado por 10% de suero fetal bovino (OFI), PS, HEPES 25 mM) y cuentan las células (MDM producen generalmente 2-8% del total de CMSP). Nota: una parte alícuota de MDM podrían tomarse en este paso para evaluar la pureza de la población de células por citometría de flujo, por lo general 99% de las MDM obtenido expresa CD14. </li><li> Semilla 1x10 5 MDM en 600 l de medio de cultivo MDM por pocillo en placas de 24 pocillos. </li><li> Incubar durante una noche a 37 ° C en un 5% de CO 2 atmósfera antes de infecciones. </li></ol> 3. Producción y cuantificación de VIH-1 en las poblaciones virales <ol><li> Producir reservas de virus utilizando la transfección de fosfato de calcio en las células HEK293T Folloala el protocolo de Fortín et al. 10. </li><li> Con el fin de obtener virus individuales del ciclo que contienen el gen informador de luciferasa-codificación, co-transfectar células HEK293T con cualquiera de 20 g NL4.3 Luc + Env - R + y 10 g de pHCMV-G, o 15 g de NL4.3 Luc Env + - + R y 15 g de pJRFL env. Utilizar 30 g de NL4.3 Luc + Env - I + para generar control deficientes glicoproteína-virus. Para que el virus replicativa completamente, usar 30 g de NL4.3Bal env. Los vectores pHCMV-G y env pJRFL codificar las glicoproteínas de la envoltura del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G) y de un CXCR5-trópico VIH-1 (diferente de NL4.3Bal env), respectivamente. Información adicional sobre los plásmidos se pueden obtener a partir de 8. Los plásmidos se pueden obtener a través de la Investigación y el Programa de SIDA de los NIH de referencia (NIAID, NIH). </li><li> Cuantificar todas las poblaciones virales por ELISA para la proteína de la cápside del VIH-1 p24 11, Y verificar su potencial infeccioso antes de su uso. Evaluamos la capacidad infecciosa de las poblaciones de nuestros virus a través del uso de células indicadoras TZM-BL 12. </li></ol> 4. Cultura de los parásitos Plasmodium falciparum (Basado en 13) 4.1 La cultura general y el mantenimiento de los parásitos <ol><li> Mantener P. falciparum 3D7 parásitos etapa asexual en eritrocitos humanos (grupo sanguíneo O +) en un hematocrito 4% en RPMI 1640 (tamponada con HEPES 25 mM y 25 mM NaHCO 3) suplementado con Albumax 0,5% (w / v) de II, 25 ug / ml de gentamicina e hipoxantina 370μM a 37 ° C en una mezcla de gas de 1% de oxígeno / 5% de dióxido de carbono en nitrógeno. </li><li> Parasitemia se puede controlar mediante una capa delgada de la cultura y la tinción con una solución de Giemsa 15%. </li><li> Siempre mantener un células no infectadas rojas de la sangre (uRBC) plato de cultivo en las mismas condiciones que los parásitos de usar como un control. Para obtener parasit última etapaes (trofozoitos o esquizontes primeros), sincronizar los parásitos de la siguiente manera: </li></ol> 4.2 Parásitos de sincronización <ol><li> Por la mañana, la cosecha de la cultura parásito, giro 5 minutos a 300 xg y descartar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el pellet en 5 volúmenes de células empaquetadas con 5% (w / v) de D-sorbitol e incubar 5 min a 37 ° C. </li><li> Gira de 5 minutos a 300 x g, desechar el sobrenadante, resuspender el pellet en 30 ml de medio de cultivo y volver a poner en la incubadora. </li><li> Aproximadamente 8 horas más tarde, repita los pasos 4.2.1 a 4.2.3 a fin de obtener los parásitos bien sincronizados. Los parásitos de la etapa tardía (trofozoitos o esquizontes primeros), entonces se puede cosechar a la mañana siguiente para llevar a cabo el experimento. Antes de la purificación, realizar la tinción de Giemsa para confirmar la etapa del ciclo de vida. </li></ol> 4.3 Plasmodium falciparum-los glóbulos rojos infectados (iRBC) purificación <ol><li> Esterilizar el separador VarioMacs (soporte y un imán) con un 70% de etanol y pencaje que bajo el capó biológica. </li><li> Fije la llave de tres vías de fondo de la columna CS. </li><li> Cortar el extremo del protector de aguja de plástico con el cortador Miltenyi especial y fijar la aguja a la parte inferior llave de paso. </li><li> Bloqueo de la columna en el imán con cuidado. </li><li> Eliminar todas las burbujas de aire en la columna por inyectando lentamente 10 ml de medio de cultivo MDM con la jeringa-kit cerrado atornillado en el lado izquierdo de la llave de paso. </li><li> Lavar la columna con ~ 20 ml de medio de cultivo MDM. </li><li> Cosecha de glóbulos rojos de la placa de cultivo, se lava una vez con 10 ml de medio de MDM (300 xg, 5 min) y resuspender el precipitado de glóbulos rojos en 12 ml de medio de cultivo MDM. Añadir lentamente a la columna y dejar que el flujo de suspensión a través de (sólo infectadas células rojas de la sangre que contienen parásitos en el trofozoíto o etapa esquizonte será retenido por el campo magnético debido a la presencia de cristales hemozoína). </li><li> Lavar una vez con 20 ml de medio y detener el flujo de líquido cuando alcanza el disco blanco en la parte superior de la columna. </li><li>Quitar la columna del imán y iRBC eluyen en un tubo limpio estéril con 12 ml de medio de cultivo MDM. </li><li> Frotis de una alícuota de la iRBC recuperó y realizar la tinción de Giemsa para confirmar la etapa del ciclo de vida. </li><li> Cuente recuperó iRBC utilizando un hemocitómetro (aislado RBC son 100% iRBC). </li><li> Las células de pellets (300 xg, 5 min), desechar el sobrenadante y tratar las células con 500 l fresca AB + suero humano (opsonización paso 14). </li><li> Incubar durante 30 min a 37 ° C en un 5% de CO 2 atmósfera. </li><li> Lavar una vez con 10 ml de medio de cultivo MDM (300 x g, 5 min), y volver a suspender iRBC a la concentración deseada. Por lo general, una parasitemia 10% 15 cm placa de cultivo más o menos da ~ 0.5-1x10 8 iRBC bien sincronizados. </li></ol> 5. La exposición de los MDM a Plasmodium falciparum <ol><li> Para exponer la MDM para uRBC o iRBC, las células deben ser resuspendidas en medio de cultivo MDM con el fin de obtener una relación de uRBC / iRBC: MDM de 75:1. En previamentepreparadas placas de 24 pocillos que contienen MDM, añadir un volumen adecuado de suspensión de glóbulos rojos a cada pocillo. Lleve a cabo todos los experimentos por triplicado. </li><li> Incubar co-cultivos de 4 horas a 37 ° C en un 5% de CO2 la atmósfera. </li><li> Se lavan las células con 600 l de PBS libre de endotoxinas 3 veces, agregue el PBS suavemente y aspirar de inmediato. </li><li> Para el resto de lisar glóbulos rojos, lavar los pocillos añadiendo 200 l de helado de agua estéril durante 20 segundos y aspirado. </li><li> Añadir 600 l medio de la cultura MDM e incubar 24 horas a 37 ° C en un 5% de CO2 la atmósfera. </li></ol> 6. Infección de MDM con un replicativa completamente VIH-1 <ol><li> A fin de evaluar el efecto de P. falciparum en la replicación del VIH-1 en MDM, añadir, según el esquema descrito en la Figura 1A, 10 ng de p24 (en 300 l de MDM medios de comunicación) de NL4.3Bal virus env en la apropiada pozos; añadir sólo medio MDM en los pocillos de control . </li><li> Incubar 2 horas a 37 ° C en un 5% Atmósfera de CO 2. </li><li> Se lavan las células con PBS libre de endotoxinas 3 veces, agregue el PBS suavemente y aspirar de inmediato. Añadir 600 l de medio fresco por MDM así. </li><li> Incubar a 37 ° C en un 5% de CO 2 atmósfera. </li><li> Al día 3, 6, 9 y 12 después del comienzo de la infección viral, la cosecha 200 l de cada sobrenadante, añadiendo 200 ul de medio fresco MDM posteriormente. Mantener los sobrenadantes recogidos a -20 ° C para la cuantificación de los principales del VIH-1 proteína p24 de la cápsida por ELISA tras Fortín et al. 10. </li></ol> 7. La infección de MDM con luciferasa de la codificación ciclo del virus <ol><li> Con el fin de determinar el impacto del parásito sobre el VIH-1 la expresión génica en MDM, añadir, según el esquema descrito en la Figura 1B, 10 ng de p24 (en 300 l de medio MDM) de cualquiera de NL4.3 Luc + Env - R + ( VSV-G), NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL env) o Luc NL4.3 +ENV - I + virus en los pocillos correspondientes. </li><li> Incubar 2 horas a 37 ° C en un 5% de CO 2 atmósfera. </li><li> Se lavan las células con 600 l de PBS libre de endotoxinas 3 veces, agregue el PBS suavemente y aspirar de inmediato. Añadir 600 l de medio fresco por MDM así. </li><li> Incubar a 37 ° C en un 5% de CO 2 atmósfera. </li><li> Retire el medio de la infección 72 horas siguientes y añadir 200 l de tampón de lisis 1X (suministrado con el kit de ensayo de la luciferasa). Que las células lisar a temperatura ambiente con agitación suave. Almacenar a -20 ° C. </li><li> Descongele la placa y transferir 40 l del lisado a una placa de luminómetro 96-así, añadir 100 l de sustrato de luciferasa (suministrado con el kit de ensayo de luciferasa) y medir la luciferasa (luciferasa de luciérnaga) actividad en un luminómetro siguiendo las instrucciones del fabricante. </li></ol> 8. Los resultados representativos Utilizando el modelo de co-infección, se muestra que exposure de P. falciparum a MDM disminuye su susceptibilidad a la infección VIH-1. De hecho, una disminución significativa (p &lt;0,05; 2 ANOVA, el día 12) en la liberación de partículas virales, medida por el VIH-1 proteína de la cápside p24 en el sobrenadante, se observa en MDM previamente con parásitos (Figura 2A). Esta observación se confirma en las células infectadas por virus que codifica un gen de la luciferasa-reportero. La infección con los virus de este tipo MDM albergan ya sea exógeno VSV-G o glucoproteínas del VIH-1 lleva a significativamente (p &lt;0,05, t de Student-test) la producción de luciferasa menos en las células expuestas a P. falciparum (Figura 2B). Es de notar que VSV-G-pseudotyped virus producido actividad mucho mayor que sus contrapartes luciferasa JRFLenv; esto es debido a la eficiencia infección mayor de VSV-G partículas pseudotyped 15. Dado que los parásitos la exposición a los impactos MDM ambos tipos de virus, esto sugiere que influye en algún paso en la ex gen viraldepresión (Figura 2B). También es importante mencionar que la viabilidad celular no se vio afectada por la exposición a MDM iRBC (datos no presentados), lo que indica que la inhibición observada es específica y no debido a la mortalidad celular. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4166/4166fig1.jpg" /> Figura 1. A) Placa de régimen para la infección con un virus MDM replicativa totalmente Falsa. Células no infectadas. uRBC: las células expuestas a los glóbulos rojos no infectados. iRBC: las células expuestas a Plasmodium falciparum infectados por los glóbulos rojos. Bal: células infectadas con NL4.3Bal env Bal / uRBC:. Las células expuestas a uRBC e infectadas con NL4.3Bal env Bal / iRBC:.. Las células expuestas a iRBC e infectadas con NL4.3Bal env b) Régimen placa para la infección con MDM solo ciclo de la luciferasa de codificación de virus de la Falsa. células no infectadas. uRBC: las células expuestas a los glóbulos rojos no infectados. iRBC: las células expuestas a Plasmodium falciparum-infected glóbulos rojos. Δenv: células infectadas con NL4.3 Luc + Env - I + JRFL:. Células infectadas con NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL env). VSV-G: las células infectadas con NL4.3 Luc + Env - R + (VSV-G) Δenv / uRBC:.. las células expuestas a uRBC e infectadas con NL4.3 Luc + Env-R + Δenv / iRBC: las células expuestas a iRBC e infectados con NL4.3 Luc + Env - I + JRFL / uRBC: las células expuestas a uRBC e infectadas con NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL env).. JRFL / iRBC: las células expuestas a iRBC e infectadas con NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL env). vsv-g/uRBC: las células expuestas a uRBC e infectadas con NL4.3 Luc + Env - R + (VSV-G): vsv-g/iRBC. las células expuestas a iRBC e infectadas con NL4.3 Luc + Env - R + (VSV-G). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4166/4166fig2.jpg"/&gt; Figura 2. . A) Efecto de Plasmodium falciparum en el VIH-1 en la producción viral MDM MDM fueron expuestos a uRBC o iRBC en una proporción 75:1 (uRBC / iRBC: MDM) durante 4 horas y se lavó extensamente. Las células fueron infectadas con 10 ng de NL4.3Bal p24 durante 2 horas env. La producción viral fue supervisado por ELISA para VIH-1 p24 en el sobrenadante libre de células en diferentes puntos temporales después de la infección viral inicial. Un representante experimento se muestra B) Efecto de Plasmodium falciparum en el VIH-1 de transcripción viral en MDM MDM fueron infectados con uRBC o iRBC en una proporción de 75:1 (uRBC / iRBC:.. MDM). Las células fueron infectadas con 10 ng de p24 del virus de un solo ciclo (ya sea NL4.3 Luc + Env - R +, NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL env) o NL4.3 Luc + Env - R + (VSV- g)). Luciferase expresión se evaluó en lisados ​​celulares 72 horas después de la infección inicial del virus. Un experimento representativo se muestra.

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<li>Zhao, C., Papadopoulou, B., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+infantum+enhances+human+immunodeficiency+virus+type-1+replication+in+primary+human+macrophages+through+a+complex+cytokine+network%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunol%22%5BJournal%5D)">Leishmania infantum enhances human immunodeficiency virus type-1 replication in primary human macrophages through a complex cytokine network.</a> Clinical Immunol. 113, 81-88 (2004).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Hemos ilustrado aquí dos enfoques diferentes para analizar el impacto del parásito de la malaria sobre el VIH-1 ciclo viral, es decir, ya sea mediante el análisis de la expresión genética viral o la producción de progenie y replicación del virus en macrófagos derivados de monocitos. Métodos similares han sido utilizados para la otra VIH-1-parásito co-infecciones 16. Sin embargo, estos nuevos datos son un paso adelante en la investigación de la malaria, el VIH-1 co-infecciones. . De hecho, Diou et al 8 estudiaron el efecto de hemozoína, los parásitos no en vivo, sobre el VIH-1 de replicación, de acuerdo con nuestros resultados, se observó que hemozoína era suficiente por sí misma para inhibir la producción viral por MDM, y no MDM. Usando el diseño experimental descrito, se observó que P. falciparum ejerce un claro efecto perjudicial sobre el ciclo de replicación del VIH-1 en los macrófagos: una inhibición significativa de la producción viral se observa en los macrófagos pre-expuestas a los parásitos (Figure 2A) y un impacto específico del parásito en la transcripción viral se ilustra en la Figura 2B. Sin embargo, no podemos dejar de lado los efectos adicionales del parásito en la entrada del virus o de fusión (decapsidation), o en los mecanismos de integración post-, tales como la síntesis de proteínas o de ensamble de partículas víricas y en ciernes. Además, es posible que un impacto diferente en la replicación del VIH-1 se obtendría si el parásito se añadieron o bien al mismo tiempo o infección MDM siguiente con el virus. Nuestra in vitro co-infección del modelo proporciona una herramienta poderosa para llevar a cabo investigaciones detalladas de VIH-1 / P. interacciones falciparum en la célula huésped. Por ejemplo, la combinación de este diseño experimental con otras técnicas tales como cuantitativo PCR en tiempo real, que puede atacar y cuantificar los pasos específicos en retrotranscripción viral y la integración del genoma viral al genoma de la célula huésped, son bastante factible y debe producir más INSIghts en los mecanismos involucrados en la co-infecciones. Además, los ensayos específicos para evaluar los primeros pasos del ciclo viral (la unión del virus, decapsidation, cuantificación entrada) se puede aplicar a este protocolo básico para analizar aún más el efecto sobre la replicación viral. Estas modificaciones muestran la flexibilidad de este protocolo es sobre el VIH-1 y la cuantificación de detección: de hecho, incluso el VIH-1 estándar ensayos de cuantificación de la transcriptasa inversa utilizando tritio nucleótidos marcados posiblemente podría sustituir a la prueba ELISA para VIH-1 p24. Además de las MDM, esperamos que nuestro sistema para poder adaptarse a otros tipos de células relevantes para la interacción del VIH-1-malaria, como los monocitos y células dendríticas. El hecho de que MDM son células adherentes facilita su manipulación, lo que permite fácil lavado de iRBC que no se han tomado en, o que están en contacto con MDM, sin eliminar cualquier macrófagos. Tal ventaja no se aplicaría a las células dendríticas y monocitos, que son cultivadas en suspensión, lo que complica la SEparación de iRBC uRBC y libre con dichas células y estamos tratando este asunto. Nuestro sistema también podría ser útil para estudiar las interacciones más complejas tales como los efectos de Plasmodium expuestos a las células derivadas de monocitos en el ciclo viral del VIH-1 en otras células del sistema inmune, tales como CD4-positivas las células T en los experimentos de co-cultivo. Finalmente, el protocolo podría ser adecuado para los experimentos que buscan en el efecto de P. falciparum iRBCs sobre la reactivación del VIH-1 en PBMC de VIH-1 en individuos infectados. Ética declaración PBMC humanas fueron obtenidas de la sangre de donantes sanos, de acuerdo con las directrices del Comité de Bioética del Centro Hospitalario de la Centro de Investigación de la Universidad Laval. Un escrito el consentimiento se obtuvo de todos los donantes de sangre.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Multicell </td><td> 350-000-CL </td><td></td></tr><tr><td> PBS-endotoxinas </td><td> Sigma </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Wisent </td><td> 080-150 </td><td> Inactivado por calor a 56 ° C durante 30 min </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4555-56 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax II </td><td> Gibco </td><td> 11021-037 </td><td> Disuelto en RPMI 1640, esterilizada por filtración </td></tr><tr><td> Medio de separación de linfocitos </td><td> Multicell </td><td> 305-010-CL </td><td></td></tr><tr><td> Las placas blancas luminómetro </td><td> Promega </td><td> Z3291 </td><td></td></tr><tr><td> Mac CS separación columms </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-041-305 </td><td></td></tr><tr><td> VarioMacs separador </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-090-282 </td><td></td></tr><tr><td> La penicilina / estreptomicina solución </td><td> Wisent </td><td> 450-201-EL </td><td></td></tr><tr><td> D-sorbitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S1876 </td><td></td></tr><tr><td> Rascador de la célula (25 cm) </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1830 </td><td></td></tr><tr><td> 24 y placas de cultivo celular </td><td> BD Falcon </td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 150 x 20 mm placa de cultivo </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1803.003 </td><td></td></tr><tr><td> M-CSF </td><td> Genscript </td><td> Z02001 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> Suero humano AB + </td><td> Valle Biomédica </td><td> HP1022 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Wisent </td><td> 311-505-CL </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1397 </td><td></td></tr><tr><td> Hipoxantina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9636 </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO $ 3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> Sistema de ensayo Luciferase </td><td> Promega </td><td> E1500 </td><td></td></tr><tr><td> Las células rojas de la sangre </td><td></td><td></td><td> Obtenido purificada a partir de banco de sangre chul. </td></tr></tbody></table>

un<em&gt; in vitro</em&gt; co-infección modelo para estudiar<em&gt; plasmodium falciparum</em&gt;-vih-1 en las interacciones humano primario de monocitos derivados de las células inmunitarias

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, el agente causante de la forma más mortal de la malaria y el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) se encuentran entre los problemas de salud más importantes del mundo, siendo responsable de un total de 4 millones de muertes al año 1. Debido a su amplia coincidencia en las regiones en desarrollo, especialmente en el África subsahariana, las coinfecciones con el paludismo y el VIH-1 son comunes, pero la interacción entre las dos enfermedades es poco conocida. Informes epidemiológicos han sugerido que la infección malárica transitoriamente aumenta la replicación del VIH-1 y aumenta la carga viral del VIH-1 en individuos co-infectados 2,3. Debido a que esta viremia se mantiene alta durante varias semanas después del tratamiento con antipalúdicos, este fenómeno podría tener un impacto en la progresión de la enfermedad y la transmisión. Los mecanismos inmunológicos celulares detrás de estas observaciones se han estudiado sólo casi. Los pocos estudios in vitro investigTES DE OPERAR EL impacto de la malaria sobre el VIH-1 han demostrado que la exposición a antígenos solubles de malaria puede aumentar la infección VIH-1 y la reactivación de las células inmunes. Sin embargo, estos estudios se utilizaron extractos de células enteras de P. falciparum esquizontes parásitos en el estadio y las células mononucleares de sangre periférica (CMSP), lo que hace que sea difícil de descifrar qué componente de malaria (s) fue el responsable de los efectos observados y cuáles son las células huésped objetivo eran 4,5. Trabajos recientes han demostrado que la exposición de las células dendríticas inmaduras derivadas de monocitos en el pigmento de la malaria hemozoína aumentado su capacidad de transferir el VIH-1 a células T CD4 + 6,7, sino que disminuyó el VIH-1 de macrófagos 8. Para arrojar luz sobre este complejo proceso, un análisis sistemático de las interacciones entre el parásito de la malaria y el VIH-1 en diferentes poblaciones humanas relevantes de células primarias es críticamente necesario. Existen varias técnicas para investigar el impacto de HIV-1 en la fagocitosis de los microorganismos y el efecto de tales patógenos en la replicación del VIH-1 se han descrito. Damos a conocer un método para investigar los efectos de P. por P. falciparum-eritrocitos infectados en la replicación del VIH-1 en humanos primarios derivados de los monocitos macrófagos. El impacto de la exposición parásito sobre el VIH-1 transcripción / traducción eventos se controla mediante el uso de virus individuales ciclo pseudotyped en el que un gen informador de luciferasa ha sustituido el gen Env mientras que el efecto sobre la cantidad de virus liberado por los macrófagos infectados se determina midiendo el VIH-1 proteína de la cápside p24 por ELISA en sobrenadantes de células.

Hemos desarrollado un<em&gt; In vitro</em&gt; La malaria-VIH-1 la co-infección modelo para estudiar el impacto de la<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; En el ciclo de replicación del VIH-1 en humanos primarios derivados de los monocitos macrófagos. Este sistema versátil se puede adaptar fácilmente a otros tipos de células primarias susceptibles a la infección por VIH-1.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infección modelo para estudiar<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-VIH-1 en las interacciones humano primario de monocitos derivados de las células inmunitarias

*Plasmodium falciparum*, el agente causal de la forma más letal de la malaria, y el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) se encuentran entre los más importantes...

El objetivo general de este procedimiento es desarrollar un modelo in vitro para estudiar los efectos de los eritrocitos infectados con plasmodium fpar sobre la replicación del VIH-1 en macrófagos derivados de monocitos primarios humanos. Esto se logra primero aislado los glóbulos rojos infectados con plasmodium, falsa para utilizando el sistema veac, y luego exponiendo los macrófagos derivados de monocitos humanos a las células infectadas. A continuación, los macrófagos derivados de monocitos expuestos a glóbulos rojos son infectados con VIH completamente replicativo o con VIH que codifica luciferasa de replicación única.Finalmente, los sobrenadantes de cultivo se recolectan a los días 3, 6, 9 y 12 posteriores a la infección para el virus completamente replicativo que codifica la luciferasa. Las células infectadas se lisan tras 72 horas de infección. En última instancia, la replicación viral puede monitorizarse cuantificando la cantidad de la proteína de la cápside P24 de VIH-1 en los sobrenadantes mediante ELISA, y la transcripción viral puede monitorizarse mediante la cuantificación de luciferasa en los lisados celulares.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las coinfecciones por malaria y VIH. Por ejemplo, ¿cómo influye la infección con el parásito Plasmodium en la replicación del VIH? Aunque este método fue desarrollado para estudiar las interacciones entre Plasmodium y el VIH en macrófagos, también podría aplicarse a otros tipos celulares.Por ejemplo, las células dendríticas, los monocitos o las células T CD cuatro que demuestran el procedimiento serán de Guadalupe Andreani. Una investigadora posdoctoral en el laboratorio comienza por cosechar los glóbulos rojos de la placa de cultivo, lava las células recuperadas en 10 mililitros de medio de macrófagos derivados de monocitos y luego resuspende el precipitado en 12 mililitros de medio de cultivo de macrófagos derivados de monocitos. A continuación, agregue lentamente la suspensión celular a una columna Milton ECS y deje que la suspensión fluya después de lavar la columna una vez con medio fresco, retírela del imán y eluya con 12 mililitros de medio de cultivo de macrófagos derivados de monocitos.Medio a través de la columna, eluyendo los glóbulos rojos infectados en un tubo estéril para exponer los macrófagos derivados de monocitos a glóbulos rojos infectados o no infectados. Añada el volumen adecuado de suspensión de glóbulos rojos a cada pocillo de una placa de 24 pocillos previamente preparada que contenga macrófagos derivados de monocitos. Incube los cultivos mixtos a 37 grados Celsius en 5 % de dióxido de carbono; después de cuatro horas, retire el medio que contiene los glóbulos rojos y luego añada suavemente 600 microlitros de PBS libre de endotoxinas a cada pocillo, lavando tres veces y aspirando inmediatamente el PBS tras cada lavado.Ahora, añada 200 microlitros de agua helada, estéril, a cada pocillo para lisar los glóbulos rojos, aspirando el agua después de 20 segundos. Luego, añada 600 microlitros de medio de cultivo de macrófagos derivados de monocitos a cada pocillo e incube los cultivos durante 24 horas a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Para evaluar el efecto de Plasmodium falciparum en la replicación del VIH-1 en macrófagos derivados de monocitos, añada 300 microlitros de medio de macrófagos derivados de monocitos que contenga p24 de los virus NL4-3 y BaL.IV.1 a los pocillos adecuados, de forma similar al protocolo mostrado en esta figura.Después de incubar los cultivos co durante dos horas, lave las células tres veces con 600 microlitros de PBS libre de endotoxinas. Luego, agregue 600 microlitros de medio fresco de macrófago derivado de monocito a cada pocillo y continúe incubando los cultivos co los días 3, 6, 9 y 12. Después de la infección viral inicial, retire 200 microlitros de cada sobrenadante, reemplazando la suspensión celular recuperada con 200 microlitros de medio fresco de macrófago derivado de monocito. Posteriormente, almacene los sobrenadantes recolectados a menos 20 grados Celsius para su análisis posterior mediante ELISA.Con el fin de determinar el impacto de los parásitos en la expresión del gen HIV uno en macrófagos derivados de monocitos, agregue 300 microlitros de medio de macrófagos derivados de monocitos que contenga la P24 del virus de interés recubierto con luciferasa ENC a los pozos correspondientes, de forma similar a los protocolos ilustrados aquí. Después de incubar y lavar las culturas co como se acaba de mostrar para el virus no recubierto con luciferasa ENC, retire el medio 72 horas después de la infección y agregue 200 microlitros del ensayo de luciferasa. Añada ahora el tampón de lisis para lisar las células a temperatura ambiente con agitación suave y luego almacene las culturas co a menos 20 grados Celsius.Después de descongelar la placa, transfiera 40 microlitros de lisado de cada pocillo al pocillo correspondiente en una placa de luminómetro de 96 pocillos. Luego agregue 100 microlitros del sustrato de luciferasa del kit de ensayo de luciferasa a cada pocillo. Finalmente, mida la actividad de luciferasa de luciérnaga en un luminómetro.De acuerdo con las instrucciones del fabricante en este experimento, los macrófagos derivados de monocitos fueron expuestos a glóbulos rojos infectados o no infectados y luego infectados con NL4-3Blen. Tal como se acaba de demostrar, la producción de la proteína viral P24 se monitoreó mediante ELIZA para la P24 del VIH-1 en sobrenadantes libres de células en diferentes momentos posteriores a la infección viral inicial. Observe la disminución significativa en la liberación de partículas virales el día 12, medida mediante la proteína de la cápside P24 del VIH-1 en el sobrenadante de macrófagos derivados de monocitos previamente tratados con parásitos.En este experimento, se expusieron macrófagos derivados de monocitos a glóbulos rojos infectados y no infectados, y luego se infectaron con un virus que codifica luciferasa, como se acaba de demostrar. Posteriormente, se evaluó la expresión de luciferasa en el lisado celular 72 horas después de la infección inicial con el virus. La infección de macrófagos derivados de monocitos con virus que portaban glicoproteínas exógenas de VSVG o del VIH-1 dio lugar a una producción significativamente menor de luciferasa en las células expuestas a p. falciparum. Es importante destacar que los virus pseudotipificados con VSVG produjeron una actividad de luciferasa mucho mayor que sus homólogos con JRFL, debido a la mayor eficiencia de infección de las partículas pseudotipificadas con VSVG.Esta técnica permitirá a los investigadores en el campo de la malaria y las coinfecciones por VIH explorar las interacciones entre estos dos patógenos en un modelo in vitro adaptable al estudio de varios tipos de células inmunitarias.

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Inmunología e Infección

Selección de Plasmodium falciparum Los parásitos de cytoadhesion a las células cerebrales endoteliales humanas

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Generación de un modelo de cultivo celular in vitro de coinfección malaria-VIH

El virus respiratorio sincitial humano (HRSV) puede causar bronquiolitis grave en lactantes pequeños. Parte de la patogenia de la enfermedad grave por HRSV es causada por la respuesta inmunitaria del huésped. La estimulación de las células inmunitarias humanas primarias con HRSV proporciona un sistema modelo rápido y reproducible para estudiar la activación de las vías inflamatorias y la infección.

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La coinfección humana es difícil de replicar in vitro. Sin embargo, los parásitos de la malaria humana pueden cultivarse fácilmente in vitro, al igual que las células mononucleares de sangre periférica humana recién aisladas infectadas naturalmente con el VIH. Esto proporciona un modelo excelente para estudiar las respuestas inmunitarias tempranas a los parásitos de la malaria en el contexto de la coinfección por el VIH.

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Aprende a desarrollar un modelo in vitro de coinfección para estudiar los efectos de Plasmodium falciparum sobre la replicación del VIH-1 en macrófagos derivados de monocitos humanos primarios.

Un In vitro Co-infección modelo para estudiar Plasmodium falciparum-VIH-1 en las interacciones humano primario de monocitos derivados de las células inmunitarias (Video) | JoVE Journal

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