Name: Cuantitativo, análisis en tiempo real de la actividad de reparación por escisión de base en lisados celulares que utilizan la lesión específicos Molecular beacons (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 1 s
Description: Aprende a medir la actividad de reparación de ADN en tiempo real usando balizas moleculares fluorescentes en lisados nucleares celulares. Este método cuantitativo permite analizar cinéticamente la función de glicosilasas y endonucleasas AP.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación de Pittsburgh y los Institutos Nacionales de Salud (NIH) [GM087798; CA148629; ES019498] para RWS. Apoyo para el Fondo para la UPCI Lentiviral fue proporcionada a RWS por la subvención del Cáncer Centro de Soporte de los Institutos Nacionales de Salud [P30 CA047904]. También se prestó apoyo por el Departamento de la Universidad de Pittsburgh de Farmacología y Biología Química de DS. También se prestó apoyo a la CV por la ESTRO.

<ol><li>Mutamba, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XRCC1+and+base+excision+repair+balance+in+response+to+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide.</a> DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).</li>
<li>Tang, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-methylpurine+DNA+glycosylase+and+DNA+polymerase+beta+modulate+BER+inhibitor+potentiation+of+glioma+cells+to+temozolomide%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-oncology%22%5BJournal%5D)">N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide.</a> Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).</li>
<li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids.</a> Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).</li>
<li>Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecularly+quenched+fluorogenic+substrates+for+hydrolytic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes.</a> Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).</li>
<li>Kreklau, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fluorometric+oligonucleotide+assay+to+measure+O%28+6%29-methylguanine+DNA+methyltransferase%2C+methylpurine+DNA+glycosylase%2C+8-oxoguanine+DNA+glycosylase+and+abasic+endonuclease+activities%3A+DNA+repair+status+in+human+breast+carcinoma+cells+overexpressing+methylpurine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).</li>
<li>Belon, C. A., Frick, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+helicase+activity+with+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Monitoring helicase activity with molecular beacons.</a> BioTechniques. 45, 433-442 (2008).</li>
<li>Ma, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+DNA+polymerase+activity+using+molecular+beacon%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon.</a> Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).</li>
<li>Summerer, D., Marx, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+beacon+for+quantitative+monitoring+of+the+DNA+polymerase+reaction+in+real-time%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).</li>
<li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+molecular+beacon+to+monitor+activity+of+E.+coli+DNA+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase.</a> The Analyst. 130, 350-357 (2005).</li>
<li>Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+beacons+for+the+detection+of+DNA+and+telomerase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).</li>
<li>Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavable+substrate+containing+molecular+beacons+for+the+quantification+of+DNA-photolyase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem+%3A+a+European+journal+of+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity.</a> Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).</li>
<li>Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+detection+of+DNA.RNA+hybridization+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).</li>
<li>Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+fluorescence+assay+for+hSMUG1+activity+based+on+modified+molecular+beacon%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+probes%22%5BJournal%5D)">A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon.</a> Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).</li>
<li>Mirbahai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+molecular+beacon+to+track+the+activity+of+base+excision+repair+protein+OGG1+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells.</a> DNA Repair (Amst). , (2009).</li>
<li>Maksimenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+beacon+assay+for+measuring+base+excision+repair+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).</li>
</ol>

RWS es un Consultor Científico de Trevigen, Inc. El resto de los autores declaran que no existen conflictos de intereses.

Hay más de 600 citas con &quot;marcador molecular&quot; el término para la detección y cuantificación de numerosas moléculas y las actividades enzimáticas, incluyendo la actividad helicasa 6, la actividad de ADN polimerasa 7,8, el ADN ligase de la actividad 9, actividad de la telomerasa 10, la actividad del ADN y el ADN fotoliasa 11 / RNA híbridos 12, entre muchos otros. Además de la utilización de marcadores moleculares para la medición de las actividade...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Cloruro de Potasio </td><td> Pescador </td><td> P217-500 </td><td> Grado molecular </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Pescador </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> Glicerol </td><td> Pescador </td><td> BP229-1 </td><td> Grado molecular </td></tr><tr><td> TDT </td><td> Pescador </td><td> BP172-5 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-solución </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-Sal </td><td> Sigma </td><td> H4034-500G </td><td></td></tr><tr><td> Hidróxido de potasio </td><td> Sigma </td><td> 17-8 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22μM filtro </td&gt; <td> Nalgene </td><td> 167-0020 </td><td></td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer productos de diálisis </td><td> Atravesar </td><td> 66373 </td><td> MW 7000 </td></tr><tr><td> Jeringa </td><td> Pescador </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Aguja </td><td> Pescador </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml Tubos microcentrífuga </td><td> Pescador </td><td> 05-408-129 </td><td> Negro </td></tr><tr><td> 15 ml tubos Falcon </td><td> Pescador </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> Kit de extracción de proteínas NucBuster </td><td> Calbiochem </td><td> 71183 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Marcadores moleculares </td><td> IDT </td><td></td><td></td></tr><tr><td> BioRad Protein Assay tinte de reagente de concentrado </td><td> BioRad </td><td> Cat # 500-0006 </td><td></td></tr></tbody></table>

cuantitativo, análisis en tiempo real de la actividad de reparación por escisión de base en lisados ​​celulares que utilizan la lesión específicos molecular beacons

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

Se describe un método para la determinación cuantitativa en tiempo real, medición de ADN glycosylase y las actividades de AP endonucleasa en lisados ​​de células nucleares con base de reparación por escisión (BER) marcadores moleculares. El substrato (faro) se compone de un desoxioligonucleótido que contiene una lesión sola base con un 6-carboxifluoresceína (6-FAM) resto conjugado con el extremo 5 &#39;y un resto Dabcyl conjugado con el extremo 3&#39; del oligonucleótido. El faro BER molecular es de 43 bases de longitud y la secuencia está diseñado para promover la formación de una estructura de tallo-bucle con 13 nucleótidos en el bucle y 15 pares de bases en el 1,2 vástago. Cuando se pliega en esta configuración, el resto 6-FAM se inactivó por Dabcyl de una manera no-fluorescente a través de Förster Resonancia transferencia de energía (FRET) 3,4. La lesión está posicionado de tal manera que tras la retirada lesión base y escisión hebra el restante 5 oligonucleótido base que contiene la fracción 6-FAM se libera del tallo. Suelte unaª desprendimiento de las extintor (Dabcyl) resulta en un aumento de la fluorescencia que es proporcional al nivel de la reparación del ADN. Mediante la recopilación de varias lecturas de los valores de fluorescencia en tiempo real de evaluación de la actividad de REC es posible. El uso de la norma cuantitativa instrumentos PCR en tiempo real permite el análisis simultáneo de numerosas muestras. El diseño de estas balizas BER moleculares, con una lesión de una sola base, es susceptible de análisis cinéticos, cuantificación y validación de REC inhibidor y es adaptable para la cuantificación de la actividad de reparación de ADN en el tejido y lisados ​​de células tumorales o con proteínas purificadas. El análisis de la actividad de BER en lisados ​​tumorales o tejido aspira utilizando estos marcadores moleculares pueden ser aplicables a las mediciones de biomarcadores funcionales. Además, el análisis de la actividad de REC con las proteínas purificadas con este ensayo cuantitativo proporciona una rápida y de alto rendimiento método para el descubrimiento y la validación de los inhibidores de la BER.

Se describe un método para la determinación cuantitativa, medida en tiempo real de ADN glicosilasa y actividades AP endonucleasas en lisados ​​de células nucleares. El ensayo proporciona tasas de actividad ADN Reparación susceptibles de análisis cinético y es adaptable para la cuantificación de la actividad del ADN en el tejido de reparación y lisados ​​tumorales o con proteínas purificadas.

Cuantitativo, análisis en tiempo real de la actividad de reparación por escisión de base en lisados ​​celulares que utilizan la lesión específicos Molecular beacons

Describimos un método para la medición cuantitativa y en tiempo real de las actividades de la ADN glicosilasa y la AP endonucleasa en lisados nucleares celulares utilizando bases...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en medir en tiempo real las tasas de reparación del ADN y los extractos nucleares celulares mediante balizas moleculares que fluorescen una vez que se reparan. Las balizas moleculares para la reparación por escisión básica están compuestas por oligonucleótidos desoxi con una estructura de horquilla que contiene una lesión de base única, con seis grupos de oxifenilfluoresceína unidos a los extremos cinco primos y dil moti unido al extremo tres primos cuando están plegadas. El grupo fam se apaga de forma no fluorescente mediante dab sil a través de la transferencia de energía de resonancia de Förster.Para evaluar la actividad de reparación del ADN, las balizas se incuban con extractos nucleares celulares, que contienen enzimas de reparación. La DNA glicosilasa reconoce y elimina la lesión en el ADN de la baliza. Los sitios ABA resultantes son sustratos para la AP endonucleasa uno o ape uno. Tras el reconocimiento, APE uno corta el esqueleto del ADN en el sitio ABA, permitiendo que el ADN que contiene el seis fam se disocie libremente del hairpin.La separación del apagador resulta en un aumento de la fluorescencia que es proporcio

quantitative-real-time-analysis-base-excision-repair-activity-cell

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Aquí, se demuestra el estudio de diferentes enfoques de reconocimiento de lesiones de ADN a través de imágenes AFM de una sola molécula con el sistema de reparación de escisión de nucleótidos como ejemplo. Se describen los procedimientos de preparación de muestras de ADN y proteínas, así como los detalles experimentales y analíticos de los experimentos de AFM.

Investigaciones de Microscopía de Fuerza Atómica de Reconocimiento de Lesión de ADN en Reparación de Excisión de Nucleótidos

Aquí se demuestra cómo se puede usar el Ensayo de Ligación de Proximidad in situ (PLA) para detectar y visualizar las interacciones directas proteína-proteína entre ATM y p53 en cultivos de células en suspensión expuestos al estrés genotóxico.

Detección y visualización de los complejos de proteínas inducidos por daño de ADN en cultivos de células en suspensión usando el ensayo de ligación de proximidad

Estudiar la cinética de reparación de daños de ADN requiere un sistema para inducir lesiones en regiones definidas del nucleares. Se describe un método para crear localizados roturas de doble cadena utilizando un microscopio confocal de escaneo láser equipado con un 405 nm láser y procedimientos automatizados para cuantificar la dinámica de los factores de reparación de estas lesiones.

Investigación de reclutamiento de la proteína a las lesiones del ADN usando 405 Nm láser Micro-irradiación

El objetivo de este protocolo es cuantificar la reparación de reticulaciones de ADN-proteína definido en ADN plásmido. Plásmidos lesionados son transfectados en líneas celulares mamíferos receptores y bajo peso molecular cosechada en múltiples puntos de tiempo después la transfección. Cinética de reparación del ADN se cuantificó usando extensión primer filamento específico seguido por qPCR.

Una prueba Simple, rápida y cuantitativa a medida reparación de vínculos cruzados de proteínas DNA en plásmidos Transfected en las células de mamífero

Se desarrolló un método no etiquetados, radio-isotópico para la corrección de la polimerasa de la DNA y un ensayo de reparación del ADN mediante espectrometría de masas MALDI-TOF alta resolución y una estrategia de extensión de un solo nucleótido. El ensayo demostró ser muy específico, simple, rápido y fácil de realizar para corregir y reparar los parches menor 9 nucleótidos.

Revisión y análisis de la reparación de ADN usando análisis de extensión de un solo nucleótido y MALDI-TOF espectrometría de masa

Este artículo introduce pasos esenciales de immunostaining y de la inmunoprecipitación de la cromatina. Estos protocolos se utilizan comúnmente para estudiar los procesos celulares relacionados con el daño del ADN y para visualizar y cuantificar el reclutamiento de proteínas implicadas en la reparación del ADN.

Visualización Y Cuantificación De La Endonucleasa Basada En El Daño Específico Del ADN Específico Del Sitio

Aquí se presenta la endonucleasa sgRNA / CAS9 y el protocolo de secuenciación de próxima generación que se puede utilizar para identificar las mutaciones asociadas con la reparación de rotura de doble cadena cerca del promotor CD4.

Uso de la secuenciación de próxima generación para identificar mutaciones asociadas con la reparación de una rotura de doble cadena inducida por CAS9 cerca del promotor CD4

Los ensayos de captura de bucle D (DLC) y extensión de bucle D (DLE) utilizan el principio de ligadura de proximidad junto con PCR cuantitativa para cuantificar la formación de bucle D, la extensión del bucle D y la formación de productos en el sitio de una ruptura ducible de doble cadena en Saccharomyces cerevisiae.

Detección de intermediarios de recombinación homóloga mediante ligadura de proximidad y PCR cuantitativa en Saccharomyces cerevisiae

Aquí, se presenta un protocolo para analizar las enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos, utilizando ejemplos de enzimas ligasa, nucleasa y polimerasa. El ensayo utiliza oligonucleótidos marcados con fluorescencia y sin marcar que pueden combinarse para formar dúplex que imitan el ARN y/o los daños en el ADN o los intermediarios de la vía, lo que permite la caracterización del comportamiento de las enzimas.

Uso de oligonucleótidos sintéticos modificados para analizar enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos

Presentamos protocolos para la evaluación de la competencia de la vía de reparación de roturas de doble cadena en células utilizando un conjunto de sustratos reporteros extracromosómicos basados en luminiscencia.

Evaluación de la actividad de reparación de roturas de doble cadena de ADN mediante ensayos reporteros cuantitativos y de alto rendimiento basados en luminiscencia

Aprende a medir la actividad de reparación de ADN en tiempo real usando balizas moleculares fluorescentes en lisados nucleares celulares. Este método cuantitativo permite analizar cinéticamente la función de glicosilasas y endonucleasas AP.

Cuantitativo, análisis en tiempo real de la actividad de reparación por escisión de base en lisados ​​celulares que utilizan la lesión específicos Molecular beacons (Video) | JoVE Journal

Cuantitativo, análisis en tiempo real de la actividad de reparación por escisión de base en lisados ​​celulares que utilizan la lesión específicos Molecular beacons

Explorar más videos

Cuantitativo, análisis en tiempo real de la actividad de reparación por escisión de base en lisados celulares que utilizan la lesión específicos Molecular beacons