Cuantitativo, análisis en tiempo real de la actividad de reparación por escisión de base en lisados ​​celulares que utilizan la lesión específicos Molecular beacons

El objetivo general del siguiente experimento es medir las tasas de reparación del ADN y los extractos nucleares de células en tiempo real utilizando balizas moleculares que emiten fluorescencia una vez que se reparan. Las balizas moleculares básicas de reparación por escisión se componen de desoxioligonucleótidos en una estructura de bucle de tallo que contiene una sola lesión de base con seis fracciones de oxifluoresceína de curva conjugadas a los cinco extremos primos y dil moti conjugadas a los tres extremos primos cuando se pliegan. La familia de seis se apaga por dab sil de una manera no fluorescente a través de la transferencia de energía de resonancia forestal.

Para evaluar la actividad de reparación del ADN, las balizas se incuban con extractos nucleares de células, que contienen enzimas de reparación. El glicosilato de ADN se reconoce y elimina la lesión de ADN en la baliza. Los sitios ABA resultantes son sustratos para la endonucleasa AP uno o el simio uno Al reconocerse, APE uno escinde la columna vertebral del ADN en el sitio ABA, lo que permite que el ADN que contiene las seis familias se disocie libremente de la horquilla.

El desprendimiento del extintor da como resultado un aumento de la fluorescencia que es proporcional al nivel de reparación del ADN y se puede evaluar en tiempo real utilizando una máquina de PCR cuantitativa en tiempo real. La capacidad de reparar el daño del ADN es crucial para cada célula y cada organismo. Entre la multitud de vías de reparación del ADN celular, los objetivos de reparación de la escisión de bases, las bases dañadas que pueden resultar de agresiones oxidativas o químicas que dilucidan el papel de los elementos celulares individuales que podrían influir en la reparación de la escisión de bases es uno de los principales objetivos de nuestros estudios de laboratorio.

Como tal, medir la actividad de reparación del ADN con precisión y sensibilidad se ha convertido en un interés en nuestro laboratorio. Este ensayo puede proporcionar dichos datos. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como el marcaje de 32 PN y el análisis por electroforesis en gel es que nuestra técnica no utiliza sustratos marcados radiactivos, puede medir las tasas de reparación en tiempo real y tiene un rango dinámico muy amplio.

Además, este enfoque puede utilizar varios fluorocuatro diferentes y/o lesiones de base para determinar la especificidad del sustrato. Hemos demostrado que este ensayo es altamente cuantitativo y muy sensible en diferentes entornos. Este ensayo de baliza molecular de reparación por escisión de bases es susceptible de análisis cinético.

La alta sensibilidad y especificidad del ensayo permite una cuantificación precisa de la reparación de la escisión de la base y, por lo tanto, es útil para el cribado o la validación de inhibidores de la reparación. Además, es adaptable para medir la actividad de reparación y los tejidos y lisados de células tumorales para mediciones de biomarcadores funcionales. Al diseñar balizas moleculares que se utilizarán para este ensayo, considere los siguientes oligonucleótidos de ADN que tienen 43 bases de longitud, como se muestra aquí.

Funciona bien. La secuencia de ADN no es única, pero debe permitir la formación de una estructura de horquilla. Cuando se arrodilla como se muestra aquí, la especificidad se logra mediante la inserción de lesiones de base específicas como uracilo o tetra hidro furina.

En la posición X, a seis bases del extremo de los cinco primos, el contenido de GC debe ser de al menos el 32% y no se debe colocar una base GB en el extremo de los cinco primos. Seis carboxifluoresceína o seis fam deben conjugarse con el extremo de cinco primos y el extremo de tres primos debe modificarse con dab sil. Este será el sustrato para que las proteínas de reparación del ADN aseguren la unión y la actividad de las liberaciones de glicosilo.

La posición de la lesión se ha elegido para proporcionar suficiente espacio desde la estructura de la horquilla y el extremo del ADN. La longitud del dúplex del tallo o de la horquilla debe ser de un mínimo de 15 pares de bases. La longitud de bucle recomendada es de 13 bases.

La baliza molecular de control debe ser idéntica a la baliza molecular experimental, excepto que no contiene una lesión de ADN. Por lo tanto, no debe ser reconocido por las enzimas de reparación del ADN. Una vez que las balizas moleculares están en la mano, se debe realizar una evaluación de calidad para garantizar que las balizas no emitan fluorescencia hasta que se calienten.

Y para determinar la temperatura óptima de fusión, todos los pasos durante el procedimiento de extracción deben realizarse en hielo o a cuatro grados centígrados. Para garantizar la estabilidad de la proteína, prepárese para el experimento mediante un enfriamiento previo. Dos vasos de precipitados de un litro por muestra, tampón de diálisis, cámaras de diálisis, microcentrífuga, tubos, jeringas y agujas.

Etiquete los tubos cónicos de 15 mililitros y colóquelos sobre hielo. Aspire el medio de crecimiento de las células y luego lávelas dos veces con 7,5 mililitros de PBS frío después del segundo lavado. Agregue cinco mililitros de PBS frío a cada plato y use un elevador de celdas para raspar las celdas del plato.

Transfiera las celdas a un tubo cónico refrigerado de 15 mililitros, luego centrifugue a 500 veces G a cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Después del centrifugado, retire el sobrenadante y estime el volumen de la célula empaquetada comparándolo con los volúmenes conocidos de líquido en tubos similares. Centrifugar los tubos durante un minuto más y, a continuación, retirar el PBS restante con una pipeta resus.

Suspenda el pellet de celda en 150 microlitros de reactivo de extracción nuclear buster, uno por cada 50 microlitros de volumen de celda empaquetada. A continuación, transfiera las células resuspendidas a un tubo preenfriado de 1,5 mililitros y vórtice durante 15 segundos a alta velocidad. Después del vórtice, incube el tubo en hielo durante cinco minutos, luego haga vórtice durante otros 15 segundos y centrifugue a 13.000 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.

Después del centrifugado, retire y deseche el sobrenadante, que contiene la fracción citoplasmática. Resus suspende el pellet en una mezcla de un microlitro de cóctel inhibidor de proteasa resus suspendido 100 x, un microlitro de DTT de 100 milimolares y 75 microlitros de extracción nuclear destructora. Reactivo dos por cada 50 microlitros de volumen de celda empaquetada.

Las células de Vortex durante 15 segundos a alta velocidad. Incubar en hielo durante cinco minutos y de nuevo en vórtice durante 15 segundos a alta velocidad centrífuga a 13.000 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después del centrifugado, se utiliza una jeringa para transferir el sobrenadante, que contiene las proteínas nucleares, a un casete de diálisis con un corte de 7.000 pesos moleculares.

A continuación, agregue 500 microlitros de DTT molar a 500 mililitros de tampón de diálisis preenfriado y dialice el lisado durante 90 minutos a cuatro grados centígrados con una agitación suave. Después de 90 minutos, transfiera el casete de diálisis a un segundo vaso de precipitados que contenga 0,5 litros de tampón de diálisis preenfriado con TDT y dialice. El lisado durante 90 minutos a cuatro grados centígrados con una agitación suave después de la diálisis, el extracto puede haberse cristalizado debido a las altas concentraciones de proteínas.

A continuación, inserte una jeringa nueva en un puerto diferente al utilizado para inyectar el casete y recoja la solución de proteína nuclear dializada del casete de diálisis. Trate de incluir cristales de aspecto turbio al extraer la solución de proteína nuclear dializada. Alícuota la muestra a tubos de microcentrífuga de 20 microlitros cada uno de congelación rápida en hielo seco y luego guárdela a menos 80 grados centígrados hasta que la necesite.

Determine la concentración de proteína y realice el control de calidad como se describe en el documento adjunto. Para realizar el ensayo de baliza molecular, descongele y diluya los lisados celulares a dos microgramos por microlitro de proteína con un tampón básico de reacción de reparación de cisión que contenga un milimolar de DTT, diluya las balizas moleculares a 200 micromolares con tampón básico de reacción de reparación por escisión. Dado que la máquina de PCR cuantitativa en tiempo real generalmente no se usa como fluorímetro, cambie el método de ejecución en la máquina de PCR cuantitativa en tiempo real para recopilar datos cada 20 segundos a 37 grados Celsius durante al menos 180 ciclos.

Luego, cada 20 segundos durante 15 ciclos a la fluorescencia máxima del faro molecular para obtener datos para la normalización. Ajuste el volumen de reacción a 25 microlitros. Luego, configure el diseño de la placa en el instrumento utilizando el software del biosistema aplicado con la curva estándar seleccionada como tipo de experimento, complete el diseño de la placa.

En esta tabla se muestra un ejemplo, que también se puede encontrar en el documento adjunto. No agregue nada al pozo seleccionado como la curva estándar. Coloque el lisado básico de células DTT de la reacción de reparación por escisión a una concentración de dos microgramos por microlitro y todas las balizas moleculares que se utilizan en el experimento en hielo.

A continuación, añada el DTT al tampón básico de la reacción de reparación por escisión hasta una concentración final de una pipeta milimolar. 15 microlitros de tampón básico de reacción de reparación por escisión con DTT en cada pocillo de una placa óptica Q-R-T-P-C-R compatible con hielo. A continuación, siguiendo la disposición de la placa, pipetee las balizas en los pozos adecuados.

Cada combinación de lisado y baliza molecular o control debe analizarse por triplicado. Por último, pipetear cinco microlitros por pocillo del lisado nuclear diluido en los pocillos adecuados. Es importante recordar que hay que mantener fríos todos los reactivos de baliza molecular y pipetear los lisados en la placa como último paso.

Recuerde, los lisados contienen proteínas activas y comenzarán a reparar las balizas moleculares tan pronto como se pipeteen en la mezcla de reacción. Por lo tanto, es muy importante mantener todos los reactivos fríos para minimizar la cantidad de reparación de balizas que se produce antes de comenzar a tomar mediciones. Una vez que se haya agregado todo, selle la placa con una película adhesiva óptica y mezcle golpeando suavemente la placa.

A continuación, realice un centrifugado rápido de diez segundos con una centrífuga para recoger soluciones en el fondo de los tubos o la placa después del centrifugado, inserte la placa en la máquina de PCR cuantitativa en tiempo real y comience el ensayo una vez finalizado, exporte los datos brutos preferiblemente en formato Excel y siga las instrucciones del documento adjunto para analizar los datos una vez que se hayan realizado los cálculos necesarios. Represente los datos de fluorescencia normalizados como porcentaje de fam libre frente al tiempo en segundos en un diagrama de dispersión con los errores correspondientes para evaluar la actividad de reparación del ADN y la calidad de los extractos nucleares de las células LN 4 28 y una línea celular de sobreexpresión de MPG designada como LN 4 28 MPG. El ensayo descrito en este video se realizó utilizando una baliza molecular que contenía el sustrato APE, tetra furina, como control positivo.

Como se muestra en esta figura, ambas líneas celulares tienen una actividad APE robusta como lo indica la pendiente pronunciada, la actividad del glicosato de ADN específica para la eliminación del sustrato MPG. La hipohipo hipoxantina indicada como HX se midió en lisados nucleares de ambas líneas celulares. Cada lisado se analizó utilizando una baliza molecular básica de control de reparación por escisión o una baliza molecular de reparación de escisión base HX para la baliza de control: LN 4 28 se muestra en verde y LN 4 28 MPG se muestra en púrpura para la baliza hipo.

El LN 4 28 se muestra en azul y el MPG del LN 4 28 se muestra en naranja. Los resultados se informan como A, las unidades de fluorescencia medias, y B, la fluorescencia normalizada. En cada célula se produjo un aumento de la fluorescencia dependiente del tiempo, indicativo de reparación de HX.

El lisado se incubó con el faro molecular HX como se esperaba. La línea celular LN 4 28 MPG indicada por el rastro naranja tuvo una tasa de reparación mucho más alta, como lo indica la acumulación más rápida de fluorescencia que la línea celular parental LN 4 28, que tiene una proteína MPG mínima. Por lo tanto, la tasa de reparación de lesiones específicas de ADN por proteínas de reparación específicas se puede medir a partir de extractos de células en tiempo real con niveles mínimos de fondo de escisión de ADN no específica.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseñar sus balizas moleculares y medir las tasas de reparación del ADN en tiempo real utilizando proteínas purificadas o lisados celulares. Con respecto al análisis, es fundamental evaluar el rango dinámico y los valores de fondo mediante la inclusión de reacciones de control como con o sin las balizas de control positivas y negativas. Teniendo en cuenta la variabilidad entre pocillos, es útil normalizar los datos de los pocillos individuales a los valores de entrada.

Esos están determinados por el paso más fino a la temperatura de fusión. Esto y la inclusión de otros tintes como un troquel de roca tendrán en cuenta la variabilidad inherente a los errores de pipeteo o las diferencias en un detector. Esta técnica nos permitió dilucidar la influencia de los componentes individuales de reparación por escisión en la actividad y la capacidad general de reparación.

Es lo suficientemente sensible como para desenmascarar pequeños cambios que no habrían sido detectables con los métodos convencionales.