On-Chip fenotipificación inflamatoria endotelial

El objetivo de este vídeo es demostrar una técnica de laboratorio en un chip para caracterizar el estado inflamatorio de las células endoteliales. Para empezar, las células endoteliales aórticas humanas se cultivan hasta la confluencia en un sustrato de cultivo de tejidos y luego se insertan en un dispositivo de cizallamiento de placas de Conan. Las células se tratan con la citocina proinflamatoria, TNF alfa, y se exponen simultáneamente a condiciones de esfuerzo de cizallamiento diferencial durante cuatro horas mediante el control preciso de la rotación del cono sobre el sustrato, el esfuerzo de cizallamiento modula una respuesta inflamatoria bien caracterizada a la citocina.

Eso incluye la regulación positiva de moléculas de adhesión como VCA one e ICAM one. El sustrato se transfiere a una etapa de microscopio donde el dispositivo microfluídico A-P-D-M-S se sella al vacío directamente a la monocapa creando canales de flujo. Las células monocíticas activadas, THP uno, vuelan sobre las células precondicionadas, donde se unen en proporción al nivel de adhesión celular.

El estado inflamatorio del endotelio se determina cuantificando el número total de células THP one que están firmemente detenidas. Hola, mi nombre es ella D Diverse, y yo soy Greg Foster. Y yo soy Keith Bailey.

Estamos en los laboratorios de los profesores, pastor y Simon en el Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de California en Davis. Hoy vamos a describir el uso de un laboratorio en un enfoque basado en chips para examinar cuantitativamente la disfunción endotelial y la inflamación. Estas herramientas nos proporcionan una plataforma para realizar estudios relacionados con la superposición del estrés metabólico con factores hidrodinámicos y la regulación del fenotipo inflamatorio endotelial y la susceptibilidad a la aterosclerosis.

Por lo tanto, nos referimos a nuestros dispositivos como miméticos vasculares, cámaras microfluídicas o vmmc. Estos dispositivos nos permiten cuantificar los resultados inflamatorios en las células endoteliales y los monocitos en condiciones que imitan a las de los vasos aterogénicos. El VMMC facilita el uso de pequeñas cantidades de reactivos o materiales que pueden tener un suministro limitado.

También se pueden construir en una serie de diseños y geometrías personalizables, lo que los hace muy adecuados para una amplia gama de aplicaciones. Hoy demostraremos un experimento representativo utilizando nuestro laboratorio en un enfoque de chip. Las monocapas endoteliales humanas se expondrán a la activación de citocinas bajo tensiones de cizallamiento bien definidas.

Demostraremos el uso de VMC para cuantificar el reclutamiento de células monocíticas humanas a la monocapa en tiempo real como una lectura funcional de la activación endotelial utilizando un torno de sustratos circulares de tres pulgadas que se muelen a partir de placas de cultivo de tejidos de 100 milímetros. Los sustratos de tres pulgadas se lavan con agua destilada y luego se esterilizan sumergiéndolos en etanol al 70%. Los sustratos estériles se colocan en placas de Petri de 100 milímetros y se dejan secar.

Luego se incuban con colágeno tipo uno a una concentración de 100 microgramos por mililitro durante una hora a temperatura ambiente y se lavan con PBS. Las células endoteliales aórticas humanas o AH están suspendidas a una concentración de 650.000 células por mililitro. Un mililitro de suspensión celular se coloca en gotas sobre un sustrato seco recubierto de colágeno y se extiende en una suspensión uniforme.

A continuación, los sustratos asentados se colocan en una incubadora de 37 grados con 5% de CO2 y se dejan adherir a la superficie del sustrato. Después de una hora y nueve mililitros de E GM dos de crecimiento, se agrega medio y se permite que las células crezcan en monocapas a aproximadamente el 90% de fluidez Co, las monocapas están listas para ser utilizadas para experimentos posteriores con transparencia. Las cámaras microfluídicas miméticas vasculares se construyen vertiendo el molde A-P-D-M-S sobre una forma maestra que comprende el canal deseado. Geometría.

La base de silicona se vierte en un bote de plástico, seguido por el agente de curado de silicona en una proporción de 10 a uno en peso. A continuación, el gel de PDMS se mezcla bien, teniendo cuidado de no raspar los lados del barco de camino y, por lo tanto, introduciendo virutas de plástico en la mezcla. Los maestros fotorresistentes se limpian con hexano y se preparan para moldear el VMMC.

A continuación, la mezcla PDMS se vierte sobre la forma maestra y luego se coloca en una cámara de vacío. En la cámara. El aire se elimina de la mezcla de PDMS y sube a la superficie después de 15 minutos.

El molde se retira de la cámara y el aire se sopla suavemente sobre la superficie del PDMS para purgar las burbujas de aire restantes del molde. Luego, el molde se tapa y se coloca en un horno a 37 grados durante una hora, donde se deja que el PMS se cure. Retire el gel PDMS solidificado del horno y haga incisiones circulares alrededor de la cámara con un bisturí pequeño.

Es crucial hacer esto gradualmente para evitar el contacto con el material fotorresistente, ya que esto dañará el molde maestro. Extraiga la cámara microfluídica de los puertos de entrada y salida del punzón del molde para cada canal con una aguja de bloqueo de señuelo de calibre 19. Además, perfore agujeros para los tubos de vacío lejos de los canales.

La preparación para el VMMC ya se ha completado. Pipetear la citocina proinflamatoria TNF alfa en seis mililitros de medio L 15 para lograr una concentración final de 0,5 nanogramos por mililitro. El medio L 15 se utiliza aquí como fluido de cizallamiento debido a su capacidad de amortiguación del pH en ausencia de 5% de CO2.

A continuación, el medio se introduce en una jeringa estéril de 10 mililitros, que se utiliza para cargar el dispositivo de cizallamiento. A continuación, la monocapa confluente se transfiere al dispositivo de cizallamiento de células, que se ha esterilizado con etanol nivelado y se ha ajustado la altura del espacio entre conos. El sustrato se retira de la placa de Petri y se coloca en el bloque de calibre de vidrio centrado y se inserta cuidadosamente en el fondo de la cámara de la carcasa, de modo que el cono esté directamente encima de las celdas.

El sustrato se asegura apretando uniformemente los tornillos de acero inoxidable alrededor del bloque de calibre. A continuación, el medio de cizallamiento se carga en la cámara, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire. A continuación, se utiliza una computadora para ingresar el programa de esfuerzo cortante deseado y se enciende el motor micro separado.

Aquí utilizamos un cizallamiento oscilatorio de cero más o menos cinco dinas por centímetro cuadrado. Después de cuatro horas, el programa de corte se detiene. Se retira el bloque de calibre y el sustrato se vuelve a colocar cuidadosamente en la placa de Petri.

Las células ya están listas para el ensayo de adhesión de monocitos. Inmediatamente después del cizallamiento, las monocapas de HA se transportan a la estación de microscopio para el montaje del VMMC. El VMMC se conecta a la manguera de vacío y se sumerge en agua desionizada para eliminar las burbujas de aire atrapadas dentro de los canales.

Con la válvula de vacío inicialmente apagada, la cámara se presiona cuidadosamente sobre la monocapa y la válvula de vacío se conecta. En este caso, es fundamental asegurarse de que no haya burbujas de aire atrapadas dentro de los canales de la cámara. Ahora, 80 microlitros de HBSS con calcio y magnesio se pipetean en un depósito hecho cortando la punta de un señuelo de calibre 19. El fluido de la aguja de bloqueo se empuja fuera de la punta presionando firmemente la parte superior del depósito, que luego se inserta en el puerto de entrada del VMMC.

Todo el conjunto se coloca en la platina del microscopio y se encienden la cámara del microscopio y el monitor de vídeo. Se carga una jeringa de vidrio de 10 mililitros en la bomba de jeringa. A continuación, el tubo de la jeringa se conecta al puerto de salida del VMMC.

El caudal se establece para inducir una tensión pura de un centímetro cuadrado dentro del canal, y luego se ejecuta en modo de recarga de modo que la jeringa extrae líquido del depósito a través del canal. Las células P 1 estimuladas con SDF one están suspendidas a una concentración de 2 millones de células por mililitro. A los dos minutos de la activación del flujo, se añaden 50 microlitros de suspensión celular al depósito.

Nuevamente, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire al desarrollar completamente el flujo. El vídeo se captura a tres fotogramas por segundo y los datos se enumeran mediante el software Image J. Adherente. Las celdas THP una se definen como no mover más de media celda de diámetro en 10 segundos.

Aquí demostramos datos que representan THP una adherencia a monocapas de ha estimuladas con TNF alfa y condicionadas bajo un esfuerzo de corte de pared alto y constante de 15 dines por centímetro cuadrado o un esfuerzo de corte oscilatorio de cero más o menos cinco dines por centímetro cuadrado ha monocapas condicionadas con esfuerzo de corte oscilatorio exhibieron un reclutamiento de TP una celda tres veces mayor en comparación con las monocapas que experimentaron un esfuerzo de corte alto. Hoy en día, demostramos el uso de técnicas in vitro personalizables que se pueden combinar para proporcionar información importante sobre los eventos inflamatorios tempranos que subyacen a la aterosclerosis. Específicamente, cuantificamos los resultados asociados con la disfunción endotelial y las células expuestas a estímulos inflamatorios en condiciones hidrodinámicas bien definidas.

El uso de VMM CS nos permite examinar mecanismos específicos que subyacen a las interacciones de adhesión endotelial y leucocitaria. Estos dispositivos también tienen la ventaja de ser flexibles y económicos y facilitan el uso de materiales cuyo suministro puede ser limitado, como los componentes derivados del suero de sujetos humanos. Nuestros estudios con estos dispositivos han incluido investigaciones sobre la inflamación inducida por citocinas, lípidos y rabia en las células endoteliales.

También hemos desarrollado ensayos en chip que examinan los mecanismos de adhesión en múltiples tipos de leucocitos, así como en sangre completa. En última instancia, prevemos que esta tecnología conducirá a enfoques ex vivo para evaluar el riesgo de enfermedad cardiovascular mediada por la inflamación de un individuo.