Postproducción de procesamiento de las Fibras electrospun de Ingeniería de Tejidos

El objetivo de este procedimiento es producir andamios biodegradables electrohilados que puedan esterilizarse y tener un espesor suficiente, así como una resistencia mecánica adecuada para la ingeniería tisular clínica. Esto se logra primero mediante la electrospunización de polímeros biodegradables en arquitecturas primarias, ya sea aleatorias o alineadas y orientadas, o estratificadas secuencialmente. El segundo paso consiste en aplicar modificaciones posteriores al hilado a los andamios, uniendo varias capas y esterilizándolos.

A continuación, se introducen células en los andamios y se evalúa su desempeño durante y después del cultivo. El paso final consiste en someter a las células a un régimen de ejercicio para imitar el estrés fisiológico que experimentarán en el organismo, con el fin de prepararlas para el trasplante. En última instancia, podemos evaluar la respuesta de las células al ejercicio mediante la medición de la matriz extracelular que producen en respuesta a la tensión dinámica.

Esta técnica es versátil y flexible, lo que permite fabricar una gran variedad de andamios con propiedades modificadas específicamente para la aplicación requerida. Por ejemplo, se pueden diseñar andamios para tratar afecciones difíciles en las que se necesitan reparaciones tisulares, como la sustitución de pérdidas extensas de piel en pacientes gravemente quemados o la reparación de la mucosa oral dañada tras el cáncer o un traumatismo. Aunque este video muestra la producción sostenida de células como marcador de estrés dinámico, también se podría considerar una variedad de proteínas de la matriz extracelular, así como evaluar muchos otros aspectos de la biología celular utilizando células sometidas o no a ejercicio.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades para obtener andamios reproducibles porque el proceso de electrohilado se ve afectado por muchas variables. La demostración visual del procesamiento de los andamios electrohilados después del hilado es importante. Rara vez se discute.

Es necesario conocer el proceso para aplicar con éxito la técnica en el entorno clínico. Comience recubriendo un colector con mandril rotatorio con papel de aluminio, colocando el lado brillante hacia afuera. Luego, coloque cuatro jeringas de cinco mililitros cargadas con cinco mililitros del polímero de interés.

Aquí se utiliza ácido poliláctico en una bomba de jeringa. Ajuste el caudal a 40 microlitros por minuto por jeringa y la distancia de trabajo a 17 centímetros desde la punta de la aguja hasta el mandril. A continuación, cargue las agujas de la jeringa a +17.000 voltios y realice la electrohilatura desde la distancia adecuada sobre el mandril recubierto con papel de aluminio para obtener fibras alineadas.

Gire el mandril a 1000 RPM para fibras aleatorias. Gire el mandril a 200 RPM. Los andamios electrohilados pueden almacenarse sobre papel de aluminio en un recipiente sellado a cuatro grados Celsius en presencia de un desecante durante al menos cuatro meses después de la electrohilación del segundo polímero PHBV Lotus.

Nuevamente aquí. El PLA ha mostrado una estratificación sobre el PHBV, utilizando luego los parámetros y condiciones normales para el centrifugado de ese polímero. Nuevamente, este proceso aditivo forma una doble capa de andamiaje, produciendo una bicapa para obtener un andamiaje multicapa mediante un calentador.

Coloque cuatro láminas de PLGA unas encima de otras en posición de rodillas y luego caliente las láminas a 60 grados Celsius durante tres horas para producir un andamiaje multicapa mediante laminado por vapor. Vierta 10 mililitros de metano DILU o DCM en un recipiente de tamaño adecuado. A continuación, coloque cuatro láminas de PLGA unas encima de otras y suspéndalas a dos centímetros por encima del DCM.

Finalmente, selle el recipiente durante una hora a temperatura ambiente para lograr la producción aséptica de andamios mediante electrohilado, disuelva polímeros de grado médico esterilizados por incubación en DCM y luego realice el electrohilado. Aplique la solución polimérica mediante electrohilado sobre una lámina estéril envuelta alrededor de un mandril esterilizado. Luego, dentro de una cabina de flujo laminar estéril, incube el andamio en medio de crecimiento sin antibióticos durante el período adecuado para verificar la esterilidad de las muestras según el desinfectante experimental con etanol.

Coloque los andamios en una solución de etanol y agua destilada durante 15 minutos. Para la esterilización con ácido peracético. Sumerja los andamios en una solución de ácido peracético y PBS durante tres horas.

A temperatura ambiente para la esterilización por rayos gamma, irradie los andamios con una dosis de tres kilogray utilizando primero una fuente de cesio, luego corte los andamios en rectángulos de cinco milímetros por 20 milímetros. A continuación, use un micrómetro para medir el grosor del andamio. Después, coloque los rectángulos en un instrumento Bose Electro Force 3,100.

Calcule el módulo de Young y la elasticidad a partir de la carga frente al desplazamiento como una curva de tensión-deformación trazada por el instrumento. Comience etiquetando las células con un colorante fluorescente antes de sembrarlas. Luego incube hasta alcanzar la confluencia, fibroblastos dérmicos humanos en tripsina y EDTA durante cinco minutos a 37 grados Celsius.

Luego, centrifugue las células desprendidas durante 10 minutos a 150 ×g a temperatura ambiente y resuspenda el sedimento en cinco mililitros de DMEM. Después de contarlas, ajuste la concentración celular para la siembra y siembre las células sobre los andamios. Ahora, obtenga imágenes de la superficie de los andamios marcados mediante un microscopio fluorescente para investigar la penetración de las células más profundamente en los andamios; para ello, se puede utilizar un microscopio confocal de multiphotones.

Esto puede lograr una penetración de aproximadamente 200 micrones en la mayoría de los andamios, con o sin células. Luego, tras cultivar los andamios sembrados, fije las muestras en un mililitro de formaldehído en PBS durante 20 minutos a 37 grados Celsius. Después de la fijación, lave las muestras tres veces con un mililitro de PBS; a continuación, incube cada muestra en 200 microlitros de anticuerpos primarios contra elastina durante 30 minutos a 37 grados Celsius.

Lave las muestras tres veces más en un mililitro de PBS y luego incube las muestras en una solución de anticuerpo secundario en PBS que contenga DPI durante 30 minutos. Finalmente, tras lavar las muestras una última vez en PBS, observe las muestras en el microscopio de fluorescencia utilizando una excitación de 365 nanómetros y una emisión de 460 nanómetros para el DPI, y una excitación de 480 nanómetros y una emisión de 533 nanómetros para el anticuerpo secundario. Primero, esterilice por autoclave el aparato de regulación de flujo y el balón; luego, en un cuarto limpio, retire el aparato de su empaque dentro de una cabina de flujo laminar en la posición adecuada para la electrospinning.

A continuación, conecte una jeringa de 50 mililitros llena con PBS al tubo lateral de una llave de tres vías e infle el globo con el PBS hasta que esté turgente. Ahora, electroespine el polímero deseado sobre el globo. Utilizando las condiciones normales de hilado y una distancia de trabajo de 10 centímetros, las fibras húmedas son lo suficientemente pegajosas como para adherirse a la superficie del globo sin despegarse posteriormente.

Una vez que el andamio haya secado, coloque el balón en un recipiente estéril y luego transporte el recipiente a una cabina de flujo laminar adecuada para el cultivo celular. El cultivo de células sobre un andamio en un balón distendido para someter a las células a un acondicionamiento biomecánico es la parte más complicada de este procedimiento. Es esencial cargar repetidamente el balón con la solución celular con el fin de adherir la mayor cantidad posible de células al andamio.

Encontramos que esto lleva aproximadamente 20 minutos. En la campana, retire el globo del recipiente y colóquelo sobre una superficie estéril, como la placa de Petri utilizada aquí, y pipete la suspensión celular sobre el globo recubierto cada 20 segundos durante 20 minutos para intentar distribuir las células uniformemente sobre la superficie del globo. Luego, coloque el globo nuevamente en el recipiente de cultivo y agregue el medio precalentado adecuado para el tipo celular.

Finalmente, conecte el aparato de inflado a una bomba de jeringa e infle y desinfle el globo según sea necesario para lograr una distensión biaxial. Se puede utilizar una bomba de jeringa controlada por computadora para lograr un régimen de distensión más complejo. La electrospinning puede utilizarse para crear andamios con arquitecturas aleatorias y ordenadas.

Esto es repetible y las fibras son uniformes. Por ejemplo, se pueden crear fibras perpendiculares mediante la electrospun de un conjunto de fibras alineadas sobre una hoja de aluminio girando la hoja 90 grados, y luego electrospun inmediatamente un segundo conjunto de fibras alineadas encima de ellas. Muchos tipos de polímeros pueden ser electrospun con características que pueden variar considerablemente, como se muestra aquí para P-L-A-P-H-B-V-P-C-L y PLGA; obsérvese que P-L-A-P-C-L y PLGA son todos andamios uniformes microfibrilares.

El PHBV se hiló formando una collar de perlas con nanofibras que conectan perlas de tamaño entre cinco y veinte micrones. Aquí, los andamiajes se hilaron inicialmente usando PHBV y luego las jeringas se llenaron con PLA, que se hiló encima de los andamiajes de PHBV. Estas imágenes muestran capas individuales representativas de PHBV y PLA.

Esta imagen ilustra cómo podría verse una sección transversal de un bicapa A-P-H-B-V-P-L-A con un collar de cuentas nano-fibroso denso, una capa de PHBV y una capa de PLA micro-fibrosa más abierta. Los tres tipos de andamios facilitan la adhesión y proliferación celular. Si se requieren andamios más gruesos, se puede emplear la fusión mediante vapor y calor para unir capas de andamios, como se muestra en las siguientes imágenes. Las capas de andamios fusionadas no se deslaminan y puede ser muy difícil encontrar la unión entre las capas.

Esta imagen muestra una sección a través de un andamio de PLA vaporizado y doblado, donde se han colocado juntos andamios fibrosos iniciales de aproximadamente 150 micrones. Luego, se utilizó vapor de DCM para crear andamios mucho más gruesos, de hasta 500 micrones. Esta imagen muestra la misma sección del bilayer de vapor, a aproximadamente dos veces el aumento anterior. En esta imagen, obsérvese cómo el andamio consiste en capas de fibras mucho más gruesas dispersas junto con capas de fibras más delgadas creadas mediante calor, doblando capas de fibras delgadas y gruesas juntas para producir andamios con propiedades mecánicas complejas.

Nuevamente, esta imagen muestra el mismo andamio de rodilla calentador a cuatro aumentos. La magnificación previa por membranas de capas puede realizarse con diferentes tipos celulares, cada uno cultivado en una membrana separada sin mezclarse, como se demuestra en estas imágenes de fibroblastos dérmicos humanos coloreados con dos tintes fluorescentes distintos para el rastreo celular. La primera imagen muestra fibroblastos sobre electros de PLA.

Las células fueron fijadas y teñidas con aquí los fibroblastos teñidos con dappy fueron sembrados sobre electros bun PHBV. En este experimento, los fibroblastos fueron previamente teñidos con el colorante vital Cell Tracker Green. Téngase en cuenta que las células se encuentran en el lado de PLA de la bicapa.

Esta imagen corresponde a una sección representativa de un bicapa con fibroblastos teñidos de rojo sobre la superficie inferior de PHBV y fibroblastos teñidos de verde sobre la superficie superior de PLA. En esta imagen, los fibroblastos fueron previamente teñidos con marcador celular rojo mientras crecían sobre la superficie de A-P-H-B-V. Por lo tanto, el uso de colorantes fluorescentes vitales proporciona una metodología conveniente para observar la distribución de células sobre un andamio mientras las células aún están en crecimiento.

El método de esterilización afecta al andamiaje y al cultivo celular subsiguiente. Esta gráfica de líneas ilustra los efectos del ácido peracético, la irradiación gamma y el etanol sobre la resistencia máxima a la tracción y el módulo de Young de un andamiaje de PLG.

Cada uno de los métodos de esterilización altera la resistencia a la tracción máxima y la elasticidad de los andamios. El cultivo de células sobre estos andamios reduce aún más su tensión máxima a la tracción, pero aumenta la elasticidad. Este gráfico de barras ilustra el efecto que el método de esterilización tiene sobre el diámetro de fibra de un andamio individual.

La irradiación gamma no tiene un efecto significativo sobre el diámetro de la fibra, mientras que el ácido paracético y el etanol reducen el diámetro de la fibra en aproximadamente un 50 %. Por lo tanto, la mejor manera de obtener andamios estériles es producirlos bajo condiciones asépticas. Esta última serie de imágenes demuestra que las células permanecen viables durante la distensión dinámica y también producen cantidades aumentadas de elastina. Observe el desarrollo del color azul oscuro producido por las células en crecimiento, tal como se detectó con un indicador metabólico, MTT.

Aquí, las células en azul cultivadas sobre un balón y sometidas a distensión biaxial desarrollaron fibras de elastina, como lo indica la tinción verde. Esto contrasta marcadamente con la ausencia de elastina cuando las mismas células se mantienen en condiciones estáticas sobre un andamio de balón idéntico. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el cultivo estático y el flujo de fluidos sobre las células en los andamios, para investigar cómo responden las células a diferentes condiciones de cultivo.

El desarrollo del cultivo de células sobre un andamiaje en un balón, que puede distenderse, ha resultado muy útil porque ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de la ingeniería de tejidos exploren ahora el efecto del acondicionamiento dinámico de células en construcciones de tejidos ingenierizados. No olvide que trabajar con fuentes de alimentación de alto voltaje, disolventes, láseres y células humanas puede ser peligroso, y siempre se deben tomar la formación adecuada y las precauciones necesarias al realizar este procedimiento.