Ingeniería bacterias adherentes mediante la creación de un único operón sintético curli

El objetivo general del siguiente experimento es dar propiedades adherentes a las bacterias para facilitar su separación de los medios líquidos. Esto se logra diseñando primero un rizo sintético para eludir la compleja regulación genética y permitir la producción fácil y masiva de polímeros pegajosos. Como segundo paso, se visualizan y cuantifican las bacterias adherentes en el poliestireno, lo que permite una estimación rápida de la eficiencia del dispositivo sintético.

A continuación, se visualiza una bacteria adherente en un vidrio mediante microscopía confocal. Con el fin de observar directamente el biofilm y obtener información sobre su estructura, se obtienen resultados que muestran un aumento significativo de la adherencia en la cepa que alberga el dispositivo sintético basándose tanto en la adherencia, como en la medición porcentual y en las observaciones microscópicas. La principal ventaja del enfoque de la biología sintética sobre los métodos existentes, como la clonación convencional, es que se puede obtener muy rápidamente una construcción que albergue solo los genes necesarios con las señales adecuadas.

Este método puede ayudar a responder una pregunta clave en el campo de la biorremediación, como abordar el desafío de eliminar las bacterias cargadas de metal de los desechos radiactivos. Generalmente, las personas nuevas en este método tienen dificultades porque se requieren conocimientos básicos sobre las señales reguladoras genéticas y el manejo de bases de datos. La demostración visual se centrará en la cuantificación y visualizaciones de la biopelícula porque estos dos pasos son muy difíciles de aprender debido a la fragilidad de los bioframes.

El primer paso para diseñar el carroña sintético es determinar la organización genética de los genes rizados y localizar sus señales endógenas, transcripcionales y traduccionales. Esto se logra utilizando bases de datos especializadas como REON DB o eco gene. El siguiente paso es seleccionar los cinco genes absolutamente necesarios para la síntesis de rizos, CSGB y CSGA y codificar los monómeros de fibra y C-S-G-E-C-S-G-F y CSGG codifican el complejo de secreción de rizos, extraer las secuencias elegidas de la base de datos en un formato más rápido, la gestión de datos y el análisis previo in silico se realizará con el software de gestión de clones, ya que el grupo C-S-G-G-F-E es antisentido en el genoma de E. coli.

Esta secuencia necesita ser convertida en su contraparte de complemento inverso. Utilice las herramientas de procesamiento de operaciones del administrador de clones molécula inversa molécula, pegue la secuencia C-S-G-E-F-G detrás de C-S-G-B-A mediante la función ligato. A continuación, agregue el promotor PRCN apropiado delante de la secuencia C-S-G-B-A-E-F-G iCal.

El locus RCN codifica una bomba FLX RCNA, responsable de la desintoxicación de níquel y cobalto, y su regulador metalológico afín RCNR. En ausencia de cobalto o níquel, el represor RCNR se une a la caja RCNR en el ADN e impide la activación completa de la transcripción de los genes posteriores. Si la concentración intracelular de cobaltos o níquel aumenta, la unión del cobalto o níquel a la proteína RCNR impide la fijación del represor al promotor y la actividad transcripcional de P-R-C-N-A aumenta al colocar los cinco genes rizados seleccionados bajo el control del promotor.

Se predice que el rizado PRCN se produce en exceso en presencia de cobalto y níquel. Posteriormente, optimice las señales transcripcionales agregando un sitio de unión de ribosoma perfecto o RBS frente al primer A TG de la secuencia CS gba, DNA y un segundo RBS perfecto frente a la secuencia C-S-G-E-F-G. Para cumplir con los estándares de I GM, el dispositivo debe estar flanqueado por un prefijo de bioladrillo estándar que contenga sitios de restricción para ECO R one y X-bar one, y un sufijo que contenga sitios de restricción para SPE one y PST one para facilitar el ensamblaje posterior.

La parte del bioladrillo en sí no puede contener ningún sitio de reconocimiento ECO R one, PST one SPE one y X-bar R one. Por lo tanto, estos sitios se eliminaron mediante cambios de mutación silenciosos en el análisis de restricción de silico del dispositivo reveló un PST, un sitio en la secuencia CSGA, un PST un sitio en la secuencia RCNR y un ECO R en el gen CSGE. Estos sitios fueron modificados por mutaciones silenciosas.

Una vez que se complete el diseño del opor sintético, ejecute una simulación de traducción utilizando el software de administrador de clones. Utilice el programa de alineación de secuencias para verificar la homología perfecta entre las proteínas rizadas de tipo salvaje y las proteínas codificadas por el sintético para comenzar este procedimiento para cada pocillo de una placa de poliestireno de 24 pocillos con dos mililitros de M 63, medio mínimo con 0,2% de glucosa inocular cada pocillo con 10 a las seis células de un cultivo bacteriano nocturno. Cultive las bacterias a 30 grados centígrados durante 18 a 48 horas sin agitar, cada columna de la placa de 24 pocillos representa una modalidad.

Se agrega la cantidad adecuada de cobalto y antibiótico cuando es necesario. Las tres primeras filas se utilizan para cuantificar las bacterias adherentes A promediando las tres repeticiones. La última fila izquierda se utiliza para visualizar el biofilm mediante tinción de violeta cristalino después de 18 a 48 horas, recuperar el supinato que contiene las células planctónicas de cada pocillo de las tres primeras filas de la placa de 24 pocillos y transferir el supinato a un tubo de hemólisis.

Enjuague cuidadosamente cada pocillo con un mililitro de medio M 63 y extraiga el lavado en el tubo de hemólisis con el supinato inicial. Esta piscina se conoce como celdas natatorias llamadas S. El fondo de los pozos en la microplaca está cubierto con celdas de adherencia. Para recuperar el biofilm, agregue un mililitro de M 63 en cada uno.

Raspe con la punta de la pipeta y luego pipetee hacia arriba y hacia abajo y transfiera la fracción de biofilm a un nuevo tubo de hemólisis. Agita el tubo durante 15 segundos. Recoger la fracción del biofilm en tubos de hemólisis.

Este grupo representa las células adheridas a la superficie llamadas B que transfieren 200 microlitros de la fracción supinato y biofilm de los tubos de hemólisis a una placa de 96 pocillos. Estime el número de bacterias adheridas a la superficie y nadadoras a partir de la densidad óptica en 600 nanómetros. El porcentaje de adherencia para cada modalidad se calcula utilizando la fórmula B por 100 dividido por tres veces S más B.To visualizar la biopelícula solo para la última fila de los 24 pocillos de la placa de descarte las células de plancton de esos pocillos.

Agregue un mililitro de M 63 a cada pocillo para enjuagar la biopelícula que se ha desarrollado en el fondo del plato. Seque la placa destapada durante una hora a 80 grados centígrados después de una hora, agregue 100 microlitros de 20% violeta cristalino para dos a cada pozo seguido de lavados prolongados con agua. Se requiere un chasis fluorescente para este protocolo.

Un huésped adecuado para el plásmido que lleva el rizo sintético es la cepa E. coli SCC one, que expresa constitutivamente la proteína fluorescente verde sin diferencias observables con respecto a la cepa madre MG 1 16 55. Transforme la cepa huésped con un plásmido puck 57 que lleve los rizos sintéticos para obtener la cepa S 23. Transforme la cepa huésped con un disco de plásmido de control 18 para obtener la cepa de control.

S 24 crecen durante la noche precultivos de las cepas S 23 y S 24 a 30 grados centígrados. En medio M 63 suplementado con glucosa y ampicilina al día siguiente, agregue 20 mililitros de medio M 63 a una placa de Petri y luego inocule 15 mililitros de M 63 en placas de Petri con 100 microlitros de los precultivos. Añade la concentración adecuada de cobalto y no olvides el control negativo sin cobalto.

Introduzca tres cubreobjetos de vidrio rectangulares en cada placa de Petri. Incubar los platos durante la noche a 30 grados centígrados sin agitar. Las bacterias se pueden visualizar directamente bajo el microscopio fluorescente los días siguientes.

Es importante evitar el secado de la muestra, por lo que los siguientes pasos deben realizarse con cuidado pero rápidamente. Retire cada cubreobjetos de las placas de Petri y escúrralo con cuidado. Limpie cuidadosamente la cara inferior con un pequeño bastoncillo de algodón empapado con etanol al 70% para limpiar todos los residuos bacterianos para la observación confocal.

Deposite el cubreobjetos en un portaobjetos de vidrio con la cara superior cubierta por el biofilm colocado boca arriba. A continuación, la biopelícula se cubre con un cubreobjetos más grande, que se fija al vidrio. Deslizar con barniz.

Invierta la configuración para que la biopelícula esté ahora en la cara inferior. Coloque la configuración bajo el microscopio láser confocal en este experimento. Dentro de la plataforma CT Micro se utiliza un microscopio láser confocal Zeiss LSM five 10 meta.

Seleccione el objetivo de inmersión en aceite de 40 veces. Utilice los siguientes ajustes, excite GFP a 4 88 nanómetros y recoja la fluorescencia bacteriana en el rango de 500 a 600 nanómetros. Utilice el objetivo de inmersión en aceite de 40 veces para adquirir imágenes.

En el modo confocal de escaneo láser. Escanee las estructuras tridimensionales generales de las biopelículas desde la superficie sólida hasta la interfaz con el medio de crecimiento. Usando un paso de una micra.

Realizar proyecciones tridimensionales con un software maus, determinar el espesor de la biopelícula mediante el análisis del valor medio de C a lo largo de secciones longitudinales estadísticas. Cuantificación de biopelícula, los volúmenes de bio se pueden extraer de pilas Z confocales. Las capacidades de adherencia de la E. coli diseñada para producir en exceso rizado en respuesta al metal se pueden evaluar mediante métodos simples.

Por ejemplo, la tinción de violeta cristalino en 24 placas Irene bien pulidas permite una visualización rápida de la formación de biopelícula en el fondo de cada pocillo, como lo muestra la diferencia en la intensidad del color púrpura. Parece que la cepa de tipo salvaje es menos adherente que la cepa modificada. Un método cuantitativo consiste en medir los porcentajes de adherencia del poliestireno del tipo silvestre y las cepas modificadas con diversas concentraciones de cobalto.

Los resultados presentados en este gráfico revelan que el porcentaje de adherencia de la cepa modificada es 1,5 veces mayor que el de la cepa de tipo salvaje en ausencia de cobalto. Además, se observó un refuerzo significativo de la adherencia en presencia de concentraciones crecientes de cobalto en medios con concentraciones de cobalto de 25 micromolares o 50 micromolares de porcentajes de adherencia modificados que alcanzan el 30% y el 40% respectivamente. Las capacidades de adherencia también se pueden comparar usando microscopía con bacterias marcadas con GFP cultivadas en portaobjetos de vidrio, las observaciones de microscopía de epifluorescencia de bacterias verdes sobre un fondo negro revelan que la cepa modificada forma una biopelícula, mientras que la cepa silvestre de trippe forma solo microcolonias indicadas por las flechas.

El análisis de microscopía confocal proporciona una visión general de la estructura tridimensional de la biopelícula. Las reconstrucciones de la vista superior se muestran en los paneles A y las reconstrucciones de la vista lateral se muestran en los paneles B. Los resultados confirman que la cepa diseñada es más adherente y forma una biopelícula más densa y gruesa que el tipo salvaje. Al intentar este procedimiento, es importante verificar dos veces el diseño de la operación, por ejemplo, para explorar el potencial de biomediación de Ecoli modificada u ocupantes en el contexto de aguas residuales radiactivas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseñar una apertura sintética utilizando el software de administrador de clones y cómo cuantificar rápidamente la expresión de cepas bacterianas. No olvide que trabajar con genes sintéticos y organismos genéticamente modificados puede ser extremadamente peligroso. Deben estar bajo de acuerdo con las leyes vigentes y siempre se deben tomar precauciones como la esterilización en autoclave de bacterias transformadas mientras se realiza este procedimiento.