Ingeniería bacterias adherentes mediante la creación de un único operón sintético curli

El objetivo general del siguiente experimento consiste en conferir propiedades adherentes a bacterias para facilitar su separación de medios líquidos. Esto se logra primero mediante el diseño de una curli sintética para sortear la regulación genética compleja y permitir la producción fácil y masiva de polímeros adhesivos. En un segundo paso, se visualizan y cuantifican bacterias adherentes sobre poliestireno, lo que permite una estimación rápida de la eficiencia del dispositivo sintético.

A continuación, se visualizan bacterias adherentes sobre vidrio mediante microscopía confocal. Con el fin de observar directamente el biofilm y obtener información sobre su estructura, los resultados obtenidos muestran un aumento significativo en la adhesión en la cepa que porta el dispositivo sintético, basado tanto en la medición del porcentaje de adhesión como en observaciones microscópicas. La principal ventaja del enfoque de biología sintética frente a métodos existentes como la clonación convencional es que se pueden obtener muy rápidamente constructos que portan únicamente los genes estrictamente necesarios con las señales adecuadas.

Este método puede ayudar a responder una pregunta clave en el campo de la biorremediación, como abordar el desafío de eliminar bacterias cargadas con metales de desechos radiactivos. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque se requiere conocimiento básico sobre señales reguladoras genéticas y manejo de bases de datos. La demostración visual se centrará en la cuantificación y visualización de biopelículas porque estas dos etapas son muy difíciles de aprender debido a la fragilidad de los biofotogramas.

El primer paso para diseñar el carrón sintético consiste en determinar la organización genética de los genes curly y localizar sus señales endógenas de transcripción y traducción. Esto se logra mediante el uso de bases de datos especializadas, como REON DB o eco gene. El siguiente paso es seleccionar los cinco genes absolutamente necesarios para la síntesis de curly: CSGB y CSGA, que codifican los monómeros de la fibra, y C-S-G-E-C-S-G-F y CSGG, que codifican el complejo de secreción del rizo; luego se extraen las secuencias seleccionadas de la base de datos en formato fasta. A continuación, se realizará la gestión de datos y un preanálisis in silico con el software Clone Manager, ya que el grupo C-S-G-G-F-E está en sentido antisentido en el genoma de E. coli.

Esta secuencia debe convertirse en su complemento inverso. Utilice las operaciones de herramientas del administrador de clones: proceso de molécula invertir molécula, y pegue la secuencia C-S-G-E-F-G detrás de C-S-G-B-A utilizando la función ligar. A continuación, agregue el promotor adecuado PRCN delante de la secuencia iCal C-S-G-B-A-E-F-G.

El locus RCN codifica una bomba FLX denominada RCNA, responsable de la detoxificación de níquel y cobalto, y su regulador metálico asociado RCNR. En ausencia de cobalto o níquel, el represor RCNR se une a la caja RCNR en el ADN y evita la activación completa de la transcripción de los genes downstream. Si la concentración intracelular de cobalto o níquel aumenta, la unión del cobalto o níquel a la proteína RCNR impide la fijación del represor al promotor y la actividad transcripcional de P-R-C-N-A aumenta, colocando los cinco genes rizados seleccionados bajo el control del promotor.

Se predice que las PRCN rizadas se sobreproducen en presencia de cobalto y níquel. Posteriormente, optimice las señales transcripcionales añadiendo un sitio de unión al ribosoma perfecto, o RBS, delante del primer ATG de la secuencia de ADN CS gba y un segundo RBS perfecto delante de la secuencia C-S-G-E-F-G. Para cumplir con los estándares de I GMs, el dispositivo debe estar flanqueado por un prefijo estándar de biofichas que contenga sitios de restricción para ECO R uno y X-bar uno, y un sufijo que contenga sitios de restricción para SPE uno y PST uno, para facilitar el ensamblaje posterior.

La parte del bio brick en sí no debe contener sitios de reconocimiento de ECO R uno, PST uno, SPE uno ni X-bar R uno. Por lo tanto, estos sitios se eliminaron mediante mutaciones silenciosas; el análisis in silico de restricción reveló un sitio PST uno en la secuencia CSGA, un sitio PST uno en la secuencia RCNR y un sitio ECO R uno en el gen CSGE. Estos sitios se modificaron mediante mutaciones silenciosas.

Una vez completado el diseño del opor sintético, realice una simulación de traducción utilizando el software clone manager. Utilice el programa de alineamiento de secuencias blast para verificar la homología perfecta entre las proteínas curly de tipo salvaje y las proteínas codificadas por el opor sintético. Para comenzar este procedimiento, agregue en cada pocillo de una placa de poliestireno de 24 pocillos dos mililitros de medio mínimo M 63 con glucosa al 0,2%, e inocule cada pocillo con 10⁶ células de un cultivo bacteriano de crecimiento nocturno. Incube las bacterias a 30 grados Celsius durante 18 a 48 horas sin agitación. Cada columna de la placa de 24 pocillos representa una modalidad.

Se agrega la cantidad adecuada de cobalto y antibiótico cuando sea necesario. Las tres primeras filas se utilizan para cuantificar las bacterias adherentes A mediante el promedio de las tres repeticiones. La última fila restante se utiliza para visualizar el biofilm mediante tinción con violeta de cristal después de 18 a 48 horas; recupere el sobrenadante que contiene las células planctónicas de cada pocillo de las primeras tres filas de la placa de 24 pocillos y transfiera el sobrenadante a un tubo de hemólisis.

Lave cuidadosamente cada pocillo con un mililitro de medio M 63 y aspire el lavado en el tubo de hemólisis junto con el sobrenadante inicial. Este conjunto se denomina células nadadoras y se designa como S. El fondo de los pocillos en la placa de microtitulación está cubierto con células adherentes. Para recuperar el biofilm, añada un mililitro de M 63 a cada pocillo.

Raspar bien con la punta de la pipeta, luego aspirar y dispensar varias veces y transferir la fracción de biopelícula a un nuevo tubo de hemólisis. Vortexar el tubo durante 15 segundos. Recoger la fracción de biopelícula en tubos de hemólisis.

Este pool representa las células adheridas a la superficie denominadas B. Transfiera 200 microlitros de la fracción sobrenadante y de biopelícula desde los tubos de hemólisis a una placa de 96 pocillos. Estime el número de bacterias adheridas a la superficie y bacterias móviles a partir de la densidad óptica a 600 nanómetros. El porcentaje de adherencia para cada modalidad se calcula utilizando la fórmula B multiplicado por 100 dividido entre tres veces S más B. Para visualizar el biopelícula, únicamente en la última fila de la placa de 24 pocillos, deseche las células planctónicas de esos pocillos.

Añada un mililitro de M 63 a cada pocillo para enjuagar el biofilm que se ha desarrollado en el fondo de la placa. Seque la placa destapada durante una hora a 80 grados celsius; después de una hora, añada 100 microlitros de violeta de cristal al 20 % a cada pocillo, seguido de lavados extensos con agua. Se requiere un chasis fluorescente para este protocolo.

Un huésped adecuado para el plásmido que porta el curli sintético es la cepa e coli SCC uno, que expresa constitutivamente la proteína verde fluorescente sin diferencia observable frente a la cepa parental MG 1 16 55. Transforme la cepa huésped con un plásmido puck 57 que porta el curli sintético para obtener la cepa S 23. Transforme la cepa huésped con un plásmido control puck 18 para obtener la cepa control.

Cultive durante la noche las culturas preinóculo de las cepas S 23 y S 24 a 30 grados Celsius. Al día siguiente, en medio M 63 suplementado con glucosa y ampicilina, agregue 20 mililitros de medio M 63 a una placa de Petri e inocule 15 mililitros de medio M 63 en placas de Petri con 100 microlitros de las culturas preinóculo. Añada la concentración adecuada de cobalto y no olvide incluir el control negativo sin cobalto.

Introduzca tres cubreobjetos de vidrio rectangulares en cada placa de Petri. Incube las placas durante la noche a 30 grados Celsius sin agitación. Los días siguientes, las bacterias pueden visualizarse directamente mediante microscopía de fluorescencia.

Es importante evitar el secado de la muestra, por lo que los siguientes pasos deben realizarse con cuidado pero rápidamente. Retire cada cubreobjetos de las placas de Petri y drene cuidadosamente. Limpie cuidadosamente la cara inferior con un pequeño hisopo empapado en etanol al 70 % para eliminar todos los residuos bacterianos antes de la observación confocal.

Coloque la cubeta sobre un portaobjetos de vidrio con la cara superior cubierta por el biofilm colocada hacia arriba. Luego, el biofilm se cubre con una cubeta más grande, que se fija al portaobjetos con barniz.

Invierta el montaje de modo que la biopelícula quede ahora en la cara inferior. Coloque el montaje bajo el microscopio láser confocal en este experimento. Se utiliza un microscopio láser confocal Zeiss LSM five 10 meta dentro de la plataforma CT micro.

Seleccione el objetivo de inmersión en aceite de 40 aumentos. Utilice la siguiente configuración: excite la GFP a 488 nanómetros y recoja la fluorescencia bacteriana en el rango de 500 a 600 nanómetros. Use el objetivo de inmersión en aceite de 40 aumentos para adquirir las imágenes.

En el modo de escaneo láser confocal, escanee las estructuras tridimensionales completas de los biofilms desde la superficie sólida hasta la interfaz con el medio de crecimiento, utilizando un paso de un micrómetro.

Realice proyecciones tridimensionales con un software maus, determine el grosor del biofilm mediante el análisis del valor promedio de C a lo largo de secciones longitudinales estadísticas. La cuantificación del biofilm, volúmenes biológicos, puede extraerse de pilas Z confocales. Las capacidades de adherencia de E. coli modificada genéticamente para sobreproducir curly en respuesta a metales pueden evaluarse mediante métodos sencillos.

Por ejemplo, la tinción con violeta de cristal en placas Irene pulidas de 24 pocillos permite una visualización rápida de la formación de biopelículas en el fondo de cada pocillo, como se observa por la diferencia en la intensidad del color púrpura. Parece que la cepa silvestre es menos adherente que la cepa modificada. Un método cuantitativo consiste en medir los porcentajes de adherencia sobre poliestireno de las cepas silvestre y modificada con diversas concentraciones de cobalto.

Los resultados presentados en esta gráfica revelan que el porcentaje de adherencia de la cepa modificada es 1,5 veces mayor que el de la cepa silvestre en ausencia de cobalto. Además, se observó un refuerzo significativo de la adherencia en presencia de concentraciones crecientes de cobalto, en medios con concentraciones de cobalto de 25 micromolares o 50 micromolares, los porcentajes de adherencia de las células modificadas alcanzan el 30 % y el 40 %, respectivamente. Las capacidades de adherencia también pueden compararse mediante microscopía utilizando bacterias marcadas con GFP cultivadas sobre portaobjetos, las observaciones mediante microscopía de epifluorescencia de bacterias verdes sobre un fondo negro revelan que la cepa modificada forma un biofilm, mientras que la cepa silvestre forma únicamente microcolonias indicadas por las flechas.

El análisis mediante microscopía confocal proporciona una visión general de la estructura tridimensional del biofilm. Las reconstrucciones de vista superior se muestran en los paneles A y las reconstrucciones de vista lateral se muestran en los paneles B. Los resultados confirman que la cepa modificada es más adherente y forma un biofilm más denso y grueso que el tipo salvaje. Al intentar este procedimiento, es importante verificar cuidadosamente el diseño experimental, por ejemplo, para explorar el potencial de biorremediación de E. coli modificada u Occus ants en el contexto de aguas residuales radiactivas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseñar un gen sintético utilizando software de gestión de clones y de cómo cuantificar rápidamente la expresión de cepas bacterianas. No olvide que trabajar con genes sintéticos y organismos modificados genéticamente puede ser extremadamente peligroso. Dichos trabajos deben realizarse de acuerdo con las leyes vigentes, y siempre deben tomarse precauciones como la autoclaveación de bacterias transformadas durante este procedimiento.