Name: Un juego de herramientas para la conversión de hidrocarburos en ambientes acuosos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 28 s
Description: Aprende a desarrollar un sistema bacteriano auto-regulado para la biorremediación de hidrocarburos usando E. coli modificada con BioBricks. Este método permite degradar alcanos en ambientes acuosos tóxicos de forma sostenible.

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Los experimentos realizados en este video-artículo fueron desarrollados para la competición internacional Genetically Engineered Machine 9. Los autores desean agradecer a los miembros del equipo iGEM Lucas Bergwerff, Pieter van TM Boheemen, Cnossen Jelmer, Hugo F. Cueto Rojas y Ramón van der Valk para la asistencia en la investigación. Agradecemos Han de Winde, Stefan de Kok y Yıldırım Esengul útil para los debates y hosting esta investigación. Este trabajo fue apoyado por la TU Delft University Departamento de Biotecnología, el Laboratorio de Bioinformática Delft, TU Delft Departamento de Bionanoscience, Oil Sands Leadership Initiative (OSLI), Stud studentenuitzendbureau, la Iniciativa de Países Bajos Genómica, Centro Kluyver, Nederlandse Vereniging Biotechnologische (Stichting Biotecnología Nederland) , DSM, Geneart, Greiner Bio-One y Genencor.

1. BioBrick Asamblea <ol><li> BioBricks del Registro de partes biológicas estándar son proporcionados por la sede iGEM. Para construir un nuevo BioBrick de BioBricks existentes, digerir el donante BioBrick (hasta 1,0 g) con las enzimas EcoRI y SpeI para el posicionamiento de las partes aguas abajo de los donantes de la parte aceptor. Se digiere con XbaI y PstI para posicionar la parte donante aguas arriba de la parte aceptor. Añadir una tercera enzima de restricción apropiada que corta en la columna vertebral de la donante. Realizar las digestiones en un volumen total de 20-25 ml con el tampón apropiado, de acuerdo con el proveedor (concentración final 1x). Usar 5 unidades / g de ADN para las enzimas de restricción. </li><li> Se digiere el aceptor BioBrick ya sea con EcoRI y XbaI o SpeI y PstI. </li><li> Incubar las digestiones para (al menos) una hora a 37 ° C. Inactivar las endonucleasas de restricción por el calor, la incubación a 80 ° C durante 10 min y se centrifuga en breve. </li><li> Se liga el BioBrick digeridopartes (donante y aceptor) juntos. Dado que XbaI y SpeI generar extremos compatibles de ADN, un sitio mixto se crea que no se puede cortar con cualquier enzima de restricción que resulta en una nueva &quot;combinado&quot; que BioBrick flanqueado por los sitios de restricción estándar 4. En la mezcla de ligación a la concentración final de ADN es preferiblemente ~ 100 ng / l. Realizar la reacción de ligación en un volumen total de 10-15 ml con el tampón de ligación T4 (concentración final 1x) y la T4 ligasa (1 unidad / g de ADN). </li><li> Incubar la mezcla de ligación a 16 ° C durante al menos 3 h. </li><li> Realizar reacción de transformación con medio circa de la mezcla de ligadura. </li><li> Confirme la BioBrick ser correcta con la secuenciación. </li><li> Para construir un nuevo BioBrick de ADN sintetizado, modificar los genes para la síntesis para la expresión óptima en E. coli por medio de la herramienta de la página web JCat ( <a href="http://www.jcat.de/" target="_blank">http://www.jcat.de/</a> ). Realizar modificaciones adicionales de acuerdo con los requisitos de la B<html> ioBrick estándar. Esta normalización implica que cada BioBrick se compone de una secuencia de ADN de interés precedido por un prefijo y seguido de un sufijo. El prefijo y el sufijo son secuencias que contienen sitios de restricción predefinidos, que están ausentes en la secuencia del plásmido restante. Estos sitios de restricción estándar hacen posible el intercambio y extender los insertos BioBrick flexible 9. El prefijo y sufijo tienen las siguientes secuencias: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Secuencia </td><td> Comentario </td></tr><tr><td> Prefijo </td><td> 5 &#39;GAATTCGCGGCCGCTTCTAG3&#39; </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5 &#39;GAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG 3&#39; </td><td> Si la siguiente parte es una secuencia de codificación o cualquier parte que comienza con &quot;ATG&quot; </td></tr><tr><td> Sufijo </td><td> 5 &#39;TACTAGTAGCGGCCGCTGCAG 3&#39; </td><td></td></tr></tbody></table>ove_title &quot;&gt; 2. Alkane Análisis de Conversión célula en reposo, En Vivo Este ensayo se realizó según el método descrito por Fujii et al. (2004). <ol><li> Cultura E. células de E. coli que expresan el sistema hidroxilasa alcano ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398014" target="_blank">BBa_K398014</a> ) y las que contienen un vector vacío ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_J13002" target="_blank">BBa_J13002</a> ) en 5 ml de medio LB con los antibióticos apropiados durante la noche. </li><li> Transferir 500 l de cultivo de una noche en 50 ml de LB fresco (con antibióticos) y se incuba hasta que la turbidez celular alcanzó una DO (densidad óptica) de 0,3 a 600 nm. </li><li> Centrifugar durante 10 min a 4.000 rpm y resuspender el sedimento en 5 ml de tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4). </li><li> Se centrifuga de nuevo durante 10 min a 4.000 rpm y resuspender el sedimento en 5 ml de tampón de fosfato 0,1 M que contiene ahora sales E2 y 0,66% v / v de glicerol (nitrógeno-deficienmedio t). </li><li> Medir la turbiedad de células (OD 600). </li><li> Preparar la mezcla de células de alícuotas de 6 ml en matraces de 25 ml de vidrio cerrado de la tapa y no de células controles (sales de E2 + 0,66% v / v de glicerol). </li><li> Añadir 100 nmol de alcano a cada matraz. </li><li> Incubar las mezclas a 37 ° C durante 24 hr (acortar cuando se obtienen tasas más altas). </li><li> Mida la OD 600 después de incubación. </li><li> Extraer los hidrocarburos en los medios de cultivo por acetato de etilo y determinar la concentración de hidrocarburos en cultivo celular por cromatografía de gases (véase el protocolo 3). </li><li> Calcular la degradación por unidad de biomasa dividiendo la cantidad total de alcano convertido por la biomasa total presente en cada matraz (OD 600 convertir a peso seco). Dividiendo el resultado por la duración experimental produce la actividad de degradación por unidad de biomasa por unidad de tiempo. El promedio se toma de tres carreras individuales. </li></ol> 3. Alkane Conversion Ensayo enzimático, EnVitro Este ensayo se realizó esencialmente según el método descrito por Li et al. (2008). <ol><li> Cultura E. células de E. coli que expresan el gen LADA ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398017" target="_blank">BBa_K398017</a> ) y las células que llevan un vector vacío ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_J13002" target="_blank">BBa_J13002</a> ) en 50 ml de medio LB con los antibióticos apropiados durante la noche. </li><li> Transferir 500 l de cultivo de una noche en 50 ml de LB fresco (con antibióticos) y se incuba hasta que la turbidez celular alcanzó una densidad óptica de 0,6 a 600 nm. </li><li> Centrifugar 10 minutos a 4.000 rpm (4 ° C) y resuspender el sedimento en 5 ml de 50 mM de tampón Tris. </li><li> Baño de ultrasonidos (disruptor celular, LA Biosystems) las células en ciclo de trabajo de 40% con un control de salida de 4, mantener la solución en hielo durante toda la duración. </li><li> Centrifugar la mezcla resultante durante 5 min a 4.000 rpm a 4 y dpor ejemplo, C para eliminar los restos celulares. Transferir el sobrenadante a un vial nuevo. </li><li> Determinar la concentración de proteína total de los extractos celulares mediante ensayo de Bradford. Nota: Usar frascos de vidrio para evitar el aumento de fondo y / o la pérdida de proteína. </li><li> Preparar una mezcla de 100 ml que contiene 0,1% v / v alcano y 50 mM de tampón Tris-HCl. </li><li> Calentar la mezcla a 100 ° C durante 5 min. Nota: Realice este paso sólo para alcanos de cadena media de duración con alto punto de ebullición. (Por ejemplo, C 16: 287 ° C). </li><li> Para conseguir una solubilidad óptima del alcano, sonicar durante 1 min mientras está todavía caliente hasta obtener una mezcla homogénea y viscosa se obtiene. </li><li> Añadir 1 mM de NADH, 1 mM FMN, 1 mM MgSO 4 y 0,01 v / v Triton X-100. </li><li> Preparar alícuotas de 6 ml en 25 ml cerrado la tapa frascos. </li><li> Añadir una cantidad adecuada de extracto de células (depende de ensayos de Bradford, concentración final de 5 mg de proteína / l). Preparar un control sin proteína. </li><li> Incubar a 60 ° C (para el correo óptimanzymatic actividad) durante 24 horas. </li><li> Extraer los hidrocarburos en los medios de cultivo por acetato de etilo y determinar la concentración de hidrocarburos en cultivo celular por cromatografía de gases (véase el protocolo 3). </li><li> Calcular la degradación por unidad de biomasa dividiendo la cantidad total de alcano convertido por proteína total a cada matraz (por Bradford curva de calibración). Además dividir por duración del experimento se obtiene la actividad de degradación por unidad de proteína celular por unidad de tiempo. El promedio se toma de tres carreras individuales. </li></ol> 4. Acetato de etilo de extracción de hidrocarburos y Medidas de concentración <ol><li> Alcanos se extrae de la solución acuosa mediante la adición de 2,5 ml de acetato de etilo (apolar solvant) a 6 ml de solución experimental. Un patrón interno se añade al disolvente en una concentración de 0,1% (v / v). El estándar (por ejemplo, ciclo-decan) varió en función de la gama prevista de los picos de interés. </li><li> Opcional: Añadir TritonX-100 a la mezcla acuosa y centrifugar las muestras durante 10 min a 4.000 rpm con el fin de obtener un adecuado sistema bifásico. </li><li> Vórtice de la mezcla durante 5 seg (1.500 rpm) y se incuba a temperatura ambiente hasta que las dos fases separadas. </li><li> Eliminar una cantidad máxima de la capa orgánica (superior) y secar el solvente usando sulfato de magnesio anhidro. </li><li> Retire MgSO 4 por filtración (0,2 m) y transferir el filtrado en viales de cromatografía de gases para mediciones o almacenar a -20 ° C. </li><li> Determinar la concentración por cromatografía de gases utilizando una columna de CP-SIL 5CB (longitud = 5 m). Inyectar 10 ul de muestra en modo de división (1:10, 230 ° C). Establecer el flujo de gases en columna a 1 ml / min (helio). El programa de temperatura del horno se utiliza la siguiente: <table border="1"><tbody><tr><td> Velocidad </td><td> Temperatura [° C] </td><td> Tiempo [min] </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 50 </td><td> 7,5 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 90 </td><td> 1,0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 110 </td><td> 2,0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 130 </td><td> 2,0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 145 </td><td> 2,0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 160 </td><td> 2,0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 170 </td><td> 2,0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 185 </td><td> 2,0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 210 </td><td> 2,0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 250 </td><td> 2,0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 320 </td><td> 2,0 </td></tr></tbody></table></li><li> Integrar los picos y corregir las concentraciones con respecto al patrón interno. </li></ol> 5. Alcohol / aldehído deshidrogenasa Ensayo de actividad Este ensayo se realizó esencialmente según el método descrito por Kato et al.(2010). <ol><li> Cultura E. células de E. coli que expresan la ADH ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398018" target="_blank">BBa_K398018</a> ) o ALDH ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398030" target="_blank">BBa_K398030</a> ) de genes y las células que llevan un vector vacío ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_J13002" target="_blank">BBa_J13002</a> ) en 50 ml de medio LB con los antibióticos apropiados durante la noche. </li><li> Transferir 500 l de cultivo de una noche en 50 ml de LB fresco (con antibióticos) y se incuba hasta que la turbidez celular alcanzó una densidad óptica de 0,6 a 600 nm. </li><li> Centrifugar 10 minutos a 4.000 rpm a 4 ° C y resuspender el sedimento en 5 ml de 50 mM de tampón Tris. </li><li> Someter a ultrasonidos la solución de células en ciclo de trabajo del 40% con un control de salida de 4 (mantener la solución en hielo durante la sonicación). </li><li> Centrifugar la mezcla resultante durante 5 min a 4.000 rpm a 4 ° C para eliminar los restos celulares. </li><li> Determinar la queTal concentración de proteína de los extractos celulares mediante ensayo de Bradford (Nota: use un vial de vidrio para prevenir la proteína de unión). </li><li> Cargar una placa de 96 pocillos con 180 l 57 mM de glicina tampón que contenía NAD (concentración final 1 mM, pH 9,5) en cada pocillo. </li><li> Añadir 5 l de alcohol (aldehído) a ensayar a los pocillos. Nota: alcoholes de cadena larga de calor antes del comienzo del ensayo de tener un líquido. Para cada alcohol (aldehído) un control sin sustrato debe ser añadido (control negativo). Además, preparar un blanco que contiene una mezcla de tampón y sustrato sin el extracto celular. </li><li> Precalentar la placa del lector de placas (Tecan Magellan v7.0) durante 15 min a 37 ° C para permitir el equilibrio del sistema. </li><li> Añadir una cantidad adecuada de extracto de células (depende de ensayos de Bradford, concentración final de 5 mg de proteína / l). Preparar un control sin proteína. </li><li> Medir la producción de NADH usando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 340 nm cada 2-3 min durante 1 hora a 37 ° C. &lt;/ Li&gt; <li> Cálculo de la tasa de producción de NADH a partir de la pendiente de la OD (340 nm). Tener en cuenta la longitud de la trayectoria de la luz y el coeficiente de extinción de la NADH de 6220 M -1 cm -1. Divide la tasa de producción de NADH por la cantidad total de proteína añadida para expresar la actividad de la deshidrogenasa de reacción en el extracto celular (U / mg de proteína celular total). Calcular la media y la desviación estándar de tres carreras independientes. </li></ol> 6. Caracterización pCaiF <ol><li> Cultura E. células de E. coli que expresan el constructo pCaiF-GFP ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398331" target="_blank">BBa_K398331</a> ) y las células que llevan el promotor solo ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398326" target="_blank">BBa_K398326</a> ) durante la noche en 5 ml de medio LB durante la noche los antibióticos apropiados. </li><li> Inocular 5 ml M9 que contenía 10 g / l de glucosa y los antibióticos con 50 l de cultivo de una noche y crecer durante la noche. </li&gt; <li> Subculture 50 l de la noche a la mañana excrecencia en 5 ml de M9 fresco g with10 / l y se incuba hasta que la turbidez celular alcanzó una densidad óptica de 0,2 a 600 nm. </li><li> Cargar una placa de 96 pocillos con 100 l de medio M9 fresco que contiene la cantidad deseada de fuente de carbono para la prueba en cada pocillo. Lleve a cabo tres experimentos para la evaluación estadística y añadir los respectivos controles negativos (tipo salvaje E. coli K12). </li><li> Añadir 5 l de cultivo de una noche a los pocillos que contienen medio. </li><li> Medir la curva de crecimiento (OD 600) y la fluorescencia de GFP (485 nm de excitación y de emisión de 520) usando un lector de placa de cada 10 minutos durante 18 horas a 37 ° C con agitación constante. </li><li> Cálculo de la tasa de crecimiento y el contenido de GFP específica de las respectivas mediciones y comparar con el control. Calcular la media y la desviación estándar de al menos tres experimentos independientes. </li></ol> 7. Ensayo Tolerancia <ol><li> CulturaE. coli que expresan genes PhPFDα y β ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398406" target="_blank">BBa_K398406</a> ) durante la noche en 5 ml de medio LB y los antibióticos adecuados. E. coli que expresan LADA gen ( <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398017" target="_blank">BBa_K398017</a> ) se utilizó como control negativo. </li><li> Subculture 10 l de la noche a la mañana en consecuencia fresco 5 ml de LB (con antibióticos) y se incuba hasta que la turbidez celular alcanzó una densidad óptica de 0,3 a 0,4 a 600 nm. </li><li> Diluir los cultivos con medio fresco hasta una OD 600 de 0,1 se alcanza. </li><li> Cargar una placa de 96 pocillos con 180 l medio M9 que contiene los antibióticos apropiados y la concentración final adecuada del compuesto tóxico (por ejemplo, 0, 4, 8, 10% de n-hexano) por triplicado. Dado que el agua alcano-mezclas podría conducir a sistemas de dos fases es esencial tener controles apropiados en la placa (por ejemplo, dcepas ifferent y los experimentos en blanco respectivos). </li><li> Añadir 20 l de la cultura (control) en los pocillos. </li><li> Medir la concentración de biomasa (OD 600) usando un lector de placas cada 10 minutos durante 24 horas a 37 ° C con agitación constante. </li><li> Calcular las tasas de crecimiento de las mediciones respectivas para las diferentes concentraciones de agente y comparar con el control negativo. Calcular la media y la desviación estándar de al menos tres carreras independientes. </li></ol> 8. Homólogo Mapping Interacción <ol><li> El HIM aplicación fue desarrollada para realizar consultas de proteínas en un servidor PostgreSQL ejecuta la base de datos STRING (gratuito para uso académico) 20. La interacción homólogo aplicación de mapeo identifica las proteínas que interactúan en el organismo huésped original utilizando la base de datos STRING. Las secuencias de los genes respectivos que interaccionan se utiliza en una búsqueda BLAST para encontrar genes homólogos en el organismo objetivo. Cytoscape 4 </shasta&gt; se utiliza para visualizar el resultado de la asignación. La herramienta de software HIM se puede descargar en: <a href="https://github.com/jcnossen/InteractionHomologMapping" target="_blank">https://github.com/jcnossen/InteractionHomologMapping.</a> </li><li> Para realizar un mapeo, (1) introducir el ID BioBrick y la aplicación se descargará automáticamente los datos de la secuencia parcial del Registro de partes biológicas estándar de 9, o (2) Intro (pegar) la secuencia de datos de la aplicación. </li><li> Utilizar el sitio web de base de datos STRING para encontrar el ID de proteína STRING para la secuencia de ácido amino entrado. </li><li> Una proteína con alta homología se determina usando BLAST. Posteriormente, la aplicación enumera cada proteína de interacción conocida en el organismo fuente y búsquedas de homólogos en el organismo huésped (por ejemplo, E. coli). </li><li> Exportar lista resultante interacción putativo de texto o Cytoscape. </li></ol>

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<li>Rojo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+alkanes+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Degradation of alkanes by bacteria.</a> Environ. Microbiol. 11 (10), 2477-2490 (2009).</li>
<li>STRING 9.0 Known and Predicted Protein-Protein Interactions [Internet]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://string-db.org/newstring_cgi/show_download_page.pl">http://string-db.org/newstring_cgi/show_download_page.pl</a> (2012).</li>
<li>Van Beilen, J. B., Panke, S., Lucchini, S., Franchini, A. G., Rothlisberger, M., Witholt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Pseudomonas+putida+alkane-degradation+gene+clusters+and+flanking+insertion+sequences%3A+evolution+and+regulation+of+the+alk+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Pseudomonas putida alkane-degradation gene clusters and flanking insertion sequences: evolution and regulation of the alk genes.</a> Microbiology. 147, 1621-1630 (2001).</li>
<li>Wang, L., Tang, Y., Wang, S., Liu, R. L., Liu, M. Z., Zhang, Y., Liang, F. L., Feng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+a+novel+thermophilic+Bacillus+strain+degrading+long-chain+n-alkanes%5BTitle%5D)+AND+%22Extremophiles%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of a novel thermophilic Bacillus strain degrading long-chain n-alkanes.</a> Extremophiles. 10 (4), 347-356 (2006).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El principio BioBrick se utiliza para construir un chasis para la degradación de alcanos y una prueba de principio para los componentes individuales de la caja de herramientas se obtuvo. Se proponen varios ensayos para medir la in vivo e in vitro de la actividad de enzimas de la ruta de degradación de alcanos. El trabajo presentado con éxito demuestra un número de métodos que pueden utilizarse para determinar la actividad enzimática y la expresión en el organismo huésped E. coli después de la ...

La contaminación por petróleo es una de las causas más graves de contaminación ambiental y afecta en gran medida a los ecosistemas, empresas y comunidades 3. Por ejemplo, se requieren soluciones para combatir la contaminación continua por petróleo procedente de las aguas residuales de arenas bituminosas en Alberta, Canadá. Durante el proceso de extracción de petróleo a partir de arenas bituminosas, el bitumen, una forma semisólida y oxidada del petróleo, se extrae mediante técnicas de recuperación térmica que consumen aproximadamente 3,1 barriles de agua por cada barril de petróleo 1. El agua de proceso contaminada con petróleo, procedente principalmente de un río local, se almacena en estanques de relaves tras la extracción del bitumen. Se necesita un reciclaje más eficaz del agua de proceso para reducir la necesidad de captación de agua dulce. Para facilitar la extracción del bitumen y garantizar que los sitios aguas abajo cumplan con las directrices de calidad del agua para la protección de los ecosistemas acuáticos, los tratamientos del agua de proceso están evolucionando rápidamente 3.
Actualmente se fomentan las tecnologías de biorremediación que emplean microorganismos para tratar la contaminación por compuestos orgánicos 1. Los alcanos son la familia más abundante de hidrocarburos en el petróleo crudo, con entre 5 y 40 átomos de carbono por molécula 7, 21. Se sabe que muchas bacterias degradan alcanos de diversas longitudes mediante la oxidación secuencial del grupo metilo terminal, formando primero alcoholes, luego aldehídos y finalmente ácidos grasos 8. En este proyecto iGEM se expresaron y caracterizaron varias enzimas procedentes de diferentes organismos, y se pusieron a disposición mediante el estándar BioBrick y el Registro de Partes Biológicas Estandarizadas.
El sistema bien estudiado de hidroxilasa de alcanos de Gordonia sp. TF6 facilita la etapa inicial de oxidación de alcanos C5-C13, así como de cicloalcanos C5-C8, mediante un mínimo de cuatro componentes: alkB2 (alcano 1-monooxigenasa), rubA3, rubA4 (dos rubredoxinas) y RubB (rubredoxina reductasa) 8, 21. Se ha descrito que ladA, una monooxigenasa de alcanos flavoproteica de Geobacillus thermodinitrificans NG-80-2, realiza la oxidación de alcanos de cadena larga (desde C15 hasta C36) 7, 15, 18, 22. LadA forma un complejo catalítico con mononucleótido de flavina (FMN) que utiliza oxígeno atómico para la oxidación, lo que resulta en la conversión de los alcanos en los alcoholes primarios correspondientes. Los alcoholes se oxidan posteriormente mediante deshidrogenasas de alcohol y aldehído a ácidos grasos, que entran fácilmente en la vía de β-oxidación 7, 21. Una deshidrogenasa de alcohol independiente de zinc procedente de la bacteria termófila Geobacillus thermoleovorans B23 oxida los alcoholes de cadena media a sus aldanos respectivos, utilizando NAD+ como cofactor 10. La deshidrogenasa de aldehído procedente del mismo microorganismo es capaz de catalizar la etapa final dependiente de NAD+ en la oxidación de cadenas medias 11.
Con el fin de reducir los costos de inducción y mantener una proliferación bacteriana óptima, se caracterizó el promotor pCaiF de E.coli. Este promotor puede regular la expresión de los componentes de la vía de degradación de hidrocarburos y está regulado por los niveles de cAMP-Crp, que a su vez dependen de las concentraciones de glucosa 6. En altas concentraciones extracelulares de glucosa en el medio, el nivel celular de AMPc (adenosín monofosfato cíclico) fue bajo debido a la inhibición de la adenilato ciclasa como efecto secundario del transporte de glucosa mediado por el sistema PTS. Por el contrario, durante la limitación (bajas concentraciones de glucosa), el nivel de AMPc aumentó y Crp se unió al AMPc formando el complejo cAMP-Crp, que se une al promotor pCaiF y activa la transcripción de los componentes downstream 6, 14.
El E. coli silvestre solo puede tolerar concentraciones moderadas de hidrocarburos. Para completar el conjunto de herramientas, era necesario abordar la tolerancia a los hidrocarburos. Se conoce que varias bacterias tolerantes a disolventes orgánicos sobreviven en sistemas bifásicos agua-disolvente12. Los componentes moleculares que se sabe aumentan la tolerancia son las chaperonas que facilitan el plegamiento correcto de las proteínas. Se ha demostrado que el sistema de prefoldina de Pyrococcus horikoshii OT3, compuesto por las proteínas phPFDα y phPFDβ, incrementa la tolerancia a hidrocarburos17.
El kit de conversión de alcanos se construyó siguiendo el principio BioBrick, que está documentado en el Registro de Partes Biológicas Estandarizadas 9. Los BioBricks son plásmidos que contienen un inserto funcional específico flanqueado por 4 sitios de restricción predeterminados. Los insertos BioBrick pueden ampliarse de forma flexible, lo que permite la construcción de sistemas biológicos con nuevas funciones.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; K12</td><td>New England Biolabs</td><td>C2523H</td><td></td></tr><tr><td>Octano</td><td>Fluka</td><td>74822</td><td></td></tr><tr><td>Hexadecano</td><td>Fluka</td><td>52209</td><td></td></tr><tr><td>octanol-1</td><td>Fluka</td><td>95446</td><td></td></tr><tr><td>dodecanol-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>126799</td><td></td></tr><tr><td>Hexano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4505</td><td></td></tr><tr><td>FMN</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2253</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄</td><td>J.T. Baker Casno</td><td>7487 889</td><td></td></tr><tr><td>Tritón X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>ligasa T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Cromatógrafo de gases</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disruptor celular</td><td>LA Biosystems</td><td>CD-019</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>Amersham Pharmacia</td><td>spec 2000</td><td></td></tr><tr><td>Lector de placas</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td>Magellan v7.0</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora </td><td>Innova, 44</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioBrickTM K398014: BBa_J23100-BBa_J61100-&lt;em&gt;alkB2&lt;/em&gt;-BBa_J61100-&lt;em&gt;rubA3&lt;/em&gt;-BBa_J61100-&lt;em&gt;rubA4&lt;/em&gt;- BBa_J61100-&lt;em&gt;rubB&lt;/em&gt;</td><td>Universidad Tecnológica de Delft en el departamento de Biotecnología o Registro de Partes Biológicas Estándar</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398014&quot; objetivo=&quot;_blank&quot;&gt;BBa_K398014&lt;/a&gt;</td><td>Sistema de alcano hidroxilasa&lt;br/&gt; Resistencia: cloranfenicol </td></tr><tr><td>BioBrickTM K398027: BBa_R0040-BBa_B0034-&lt;em&gt;ladA&lt;/em&gt; </td><td>Universidad Tecnológica de Delft en el departamento de Biotecnología o Registro de Partes Biológicas Estándar</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398027&quot; objetivo=&quot;_blank&quot;&gt;BBa_K398027&lt;/a&gt;</td><td>Generador de proteína ladA&lt;br/&gt; Resistencia: cloranfenicol </td></tr><tr><td>BioBrickTM K398018: BBa_J23100-BBa_J61101-&lt;em&gt;ADH&lt;/em&gt; </td><td>Universidad Tecnológica de Delft en el departamento de Biotecnología o Registro de Partes Biológicas Estándar</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398018&quot; objetivo=&quot;_blank&quot;&gt;BBa_K398018&lt;/a&gt;</td><td>generador de ADH&lt;br/&gt; Resistencia: cloranfenicol </td></tr><tr><td>BioBrickTM K398030: BBa_R0040-BBa_B0034-&lt;em&gt;ALDH&lt;/em&gt; </td><td>Universidad Tecnológica de Delft en el departamento de Biotecnología o Registro de Partes Biológicas Estándar</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398030&quot; objetivo=&quot;_blank&quot;&gt;BBa_K398030&lt;/a&gt;</td><td>generador de ALDH&lt;br/&gt; Resistencia: cloranfenicol </td></tr><tr><td>BioBrickTM K398326:&lt;em&gt; pCaiF&lt;/em&gt; </td><td>Universidad Tecnológica de Delft en el departamento de Biotecnología o Registro de Partes Biológicas Estándar</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398326&quot; objetivo=&quot;_blank&quot;&gt;BBa_K398326&lt;/a&gt;</td><td>promotor pCaiF&lt;br/&gt; Resistencia: cloranfenicol </td></tr><tr><td>BioBrickTM K398331:&lt;em&gt; pCaiF&lt;/em&gt;-BBa_B0032-BBa_I13401</td><td>Universidad Tecnológica de Delft en el departamento de Biotecnología o Registro de Partes Biológicas Estándar</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398331&quot; objetivo=&quot;_blank&quot;&gt;BBa_K398331&lt;/a&gt;</td><td>Dispositivo de medición pCaiF&lt;br/&gt; Resistencia: cloranfenicol </td></tr><tr><td>BioBrickTM K398406: BBa_J23002-BBa_J61107-&lt;em&gt;phPFD&lt;/em&gt;&lt;em&gt;&amp;alpha;&lt;/em&gt;-BBa_J61107- </td><td>Universidad Tecnológica de Delft en el departamento de Biotecnología o Registro de Partes Biológicas Estándar</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398406&quot; objetivo=&quot;_blank&quot;&gt;BBa_K398406&lt;/a&gt;</td><td>Agrupamiento de tolerancia a disolventes&lt;br/&gt; Resistencia: cloranfenicol </td></tr></tbody></table>

un juego de herramientas para la conversión de hidrocarburos en ambientes acuosos

A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

Este trabajo expone un conjunto de herramientas que permite la conversión de alcanos por Escherichia coli y presenta una prueba de principio de su aplicabilidad. El juego de herramientas se compone de varias piezas estándar intercambiables (BioBricks) 9 abordan la conversión de alcanos, la regulación de la expresión génica y la supervivencia en tóxicos ambientes ricos en hidrocarburos. Una vía de tres pasos para la degradación de alcano se llevó a cabo en E. coli para permitir la conversión de alcanos a medio y largo de cadena a sus respectivos alcanoles, alcanales y, finalmente, ácidos alcanoicos. Este último se metaboliza a través de la nativo β-oxidación vía. Para facilitar la oxidación de alcanos de cadena media-(C5-C13) y cicloalcanos (C5-C8), cuatro genes (alkB2, rubA3, rubA4 y Rubb) del sistema hidroxilasa alcano de Gordonia sp. TF6 8,21 se transformaron en E. coli. Para la conversión de losalcanos de cadena larga (C15-C36), el gen Lada de Geobacillus thermodenitrificans fue implementado. Para conocer los pasos necesarios adicionales del proceso de degradación, ADH y ALDH (procedente de thermodenitrificans G.) se introdujeron 10,11. La actividad se midió mediante ensayos de células en reposo. Para cada etapa oxidativa, la actividad enzimática se observó. Para optimizar la eficacia del proceso, la expresión fue inducida sólo bajo condiciones bajas de glucosa: un promotor regulado sustrato, pCaiF, se utilizó. pCaiF está presente en E. coli K12 y regula la expresión de los genes implicados en la degradación de fuentes de carbono distintas a la glucosa. La última parte del conjunto de instrumentos - focalización supervivencia - se implementó el uso de genes de tolerancia, solventes PhPFDα y β, ambos de Pyrococcus horikoshii OT3. Disolventes orgánicos pueden inducir estrés celular y la disminución de la supervivencia de forma negativa affecting plegamiento de proteínas. Como chaperones, PhPFDα y β mejorar el proceso de plegamiento de proteínas por ejemplo en virtud de la presencia de alcanos. La expresión de estos genes condujeron a una tolerancia mejorada de hidrocarburos se muestra por una tasa de crecimiento mayor (hasta 50%) en la presencia de 10% de n-hexano en el medio de cultivo se observaron. En resumen, los resultados indican que el kit de herramientas permite E. coli para convertir y tolerar hidrocarburos en ambientes acuosos. Como tal, representa un primer paso hacia una solución sostenible para la recuperación de petróleo mediante un enfoque de la biología sintética.

Conversión de alcanos
La actividad de los tres pasos de oxidación desde el alcano hasta el ácido graso correspondiente se evaluó mediante ensayos con células en reposo y mediciones de actividad enzimática. Los resultados se presentan siguiendo las reacciones de la ruta metabólica: (1) alcano hidroxilasa, (2) alcohol deshidrogenasa y (3) aldehído deshidrogenasa. 
Para el primer paso, se construyeron diferentes plásmidos para alcanos de cadena media y larga. El plásmido <a href="http://partsreg...

Un auto sostenible sistema de regulación de las bacterias para la remediación de contaminaciones de aceite ha sido diseñado utilizando piezas estándar de ADN intercambiables (BioBricks). Una ingeniería<em&gt; E. coli</emCepa&gt; se utiliza para degradar alcanos a través de β-oxidación en ambientes acuosos tóxicos. Las respectivas enzimas de diferentes especies mostraron actividad de degradación de alcano. Además, una mayor tolerancia a<em&gt; N</em&gt;-Hexano se obtuvo mediante la introducción de genes de alcano bacterias tolerantes.

Un juego de herramientas para la conversión de hidrocarburos en ambientes acuosos

Este trabajo propone un conjunto de herramientas que permite la conversión de alcanos mediante Escherichia coli y presenta una prueba de principio de su aplicabilidad. El ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

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