Un procedimiento optimizado para el activado por fluorescencia de células de clasificación (FACS) El aislamiento de progenitores neurales autónomas de los órganos viscerales de los fetos de ratones

El objetivo general de este procedimiento es obtener una población de progenitores neuronales purificados a partir de ganglios del sistema nervioso periférico. Esto se logra primero mediante la disección del órgano o ganglios específicos de interés a partir de ratones fetales. Los tejidos luego se disocian parcialmente para liberar las células individuales al medio circundante.

A continuación, se filtra la suspensión celular para eliminar cualquier resto de agregados de tejido o agregados grandes. Finalmente, la suspensión celular se clasifica mediante citometría de flujo para aislar la población de interés según la expresión de un marcador fluorescente en dicha población celular. En última instancia, se pueden comparar los patrones de expresión génica entre progenitores aislados en diferentes etapas del desarrollo, o entre poblaciones purificadas de diferentes tipos celulares neuronales.

La principal ventaja de esta técnica frente al aislamiento de poblaciones celulares basado en el marcado con anticuerpos es que a menudo no hay reactivos inmuno disponibles que etiqueten células que expresan un gen determinado. Las líneas de ratones modificadas genéticamente que producen proteínas fluorescentes en subpoblaciones neuronales discretas permiten el aislamiento de estas poblaciones celulares. Aunque demostramos este método para el aislamiento de progenitores neurales del intestino y de la vía neurogénica de la boca, también puede aplicarse a otros sistemas modelo que expresan reporteros fluorescentes.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque tienden a digerir en exceso los tejidos de origen, lo que resulta en una pérdida de viabilidad celular. Antes de comenzar la disección, observe los embriones mediante iluminación de campo claro para asegurarse de que las estructuras relevantes estén enfocadas. Luego, identifique los embriones positivos para el transgén mediante la detección de la expresión del reportero fluorescente utilizando un microscopio estereoscópico fluorescente.

Después de la eutanasia, comience agregando una cantidad mínima de PBS al recipiente de disección, para que el embrión no flote mientras se disecan los tejidos. Abra la piel del embrión a lo largo de los costados del cuerpo y a través del abdomen al nivel del hígado. Gire el embrión sobre su espalda y use pinzas finas para fijarlo en su lugar.

A nivel de las extremidades anteriores, inserte otro par de pinzas a la altura del diafragma y luego tire enérgicamente. Jale los órganos internos hacia la cola y alejándolos de la pared corporal dorsal para extraer las vísceras desde el hígado hasta el tubérculo genital. Si salen órganos de la cavidad torácica, como el corazón o los pulmones, adheridos a las vísceras, retírelos antes de continuar.

Una vez que las vísceras abdominales se separan de la carcasa, inserte un par de pinzas debajo del hígado, cerca del estómago, y separe suavemente el hígado del intestino. Luego, disecte cuidadosamente el intestino posterior de la uretra dorsal y retire el intestino del tracto urogenital. Finalmente, gire el intestino para que el bazo quede visible debajo del estómago.

Extraiga el bazo y el páncreas. Separe los bucles del intestino sosteniendo el mesenterio. Luego, retire cuidadosamente el mesenterio y la vasculatura asociada del intestino tirando suavemente del mesenterio.

Evite sostener directamente el intestino con la pinza. Si el intestino se rompe, simplemente reúna las piezas separadas en la etapa de disociación. Agrupe cada tipo de tejido juntos en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga HBSS frío con hielo según el tipo de tejido y el tipo de fenotipo del embrión.

Después de la centrifugación, retire por aspiración la mayor cantidad posible de HBSS de los tejidos subdisecados. A continuación, re suspenda el sedimento tisular en uno o varios mililitros de ACU max. Cambiando la punta de pipeta entre cada muestra.

Para evitar la contaminación cruzada entre tipos de tejidos, coloque los tubos en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 20 a 45 minutos. Dependiendo del estadio del tejido que se esté aislando, la disociación y filtración del tejido es la parte más complicada del procedimiento para prevenir una disociación excesiva del tejido, lo que resulta en una baja viabilidad celular.

Limite el tiempo de disociación y no intente disociar completamente todos los fragmentos de tejido a mitad del proceso. Al final del tiempo de disociación, rompa manualmente el tejido golpeando enérgicamente el tubo contra el costado del baño de agua y agitándolo hacia abajo con un movimiento rápido de muñeca. A continuación, coloque las muestras disociadas en hielo e inmediatamente añada un mililitro de solución de detención recién preparada a cada tubo, utilizando una punta de pipeta nueva para cada muestra. Pase la muestra arriba y abajo con la pipeta hasta que el tejido esté casi completamente disociado.

Ahora, utilizando un par de pinzas esterilizadas con etanol, coloque un cuadrado de tres centímetros de membrana de malla de nailon de 38 micrones sobre la boca de un tubo cónico nuevo de 15 mililitros. Luego, use puntas de pequeño diámetro para filtrar la solución celular resuspendida individualmente a través de la malla, pipeteando en el centro de la membrana. Una vez que la suspensión celular haya sido filtrada, enjuague el tubo de muestra con un mililitro de tampón de detención 1-5 y filtre cualquier célula restante.

Luego, retire la membrana teniendo cuidado de evitar que muestras de tejido no filtradas entren en el tubo. Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante de las suspensiones celulares y resuspenda el precipitado en un mililitro de quench uno a cinco. A continuación, filtre cada suspensión celular a través de una malla de nailon hacia tubos de poliestireno de cinco mililitros, como se acaba de mostrar.

Comience reservando una pequeña alícuota de la muestra de fluorescencia para el control de compensación solo EGFP. Luego divida la muestra de tejido silvestre en dos porciones, etiquetando una como solo silvestre y la otra como siete A a d. Solo. Ahora llene todos los tubos de muestra con quench uno a cinco, y tras centrifugar las muestras, aspire todo excepto los últimos 200 microlitros del sobrenadante en cada tubo.

Finalmente, agregue siete AAD a las muestras que se van a clasificar y al control solo con siete AAD. Luego agregue 0,75 mililitros de triazol LS a tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros. Para la recolección de muestras, comience utilizando las muestras de control para ajustar los parámetros de compensación y las compuertas, con el fin de evitar las células muertas positivas para siete AAD y recolectar células que exhiban una alta intensidad de fluorescencia GFP.

Después de ajustar los parámetros de compensación, comience la clasificación a la presión más baja posible con una boquilla de gran diámetro y un flujo bajo. Recolecte un máximo de 25.000 células en cada tubo de microcentrífuga para que el LS triol no quede excesivamente diluido. Inmediatamente después de la clasificación, vortex cada tubo de células capturadas en el LS triol.

En esta primera figura, se muestra aquí un tracto genitourinario completo de un embrión de 15,5 días postcóitum, visto ventralmente bajo iluminación de campo claro. La misma muestra se observa bajo iluminación de fluorescencia para demostrar la distribución de células positivas para EGFP en las glándulas suprarrenales y en los ganglios celíacos ubicados medialmente, identificados por la expresión de su transgén TH-EGFP. Esta vista lateral de una vejiga subdisecada de un embrión de 15,5 días postcóitum TH-EGFP muestra fluorescencia debida a la expresión del transgén en los ganglios pélvicos, en la pared de la vejiga y en la uretra.

En esta vista dorsal de las mismas células positivas para EGFP, se observan células evidentes en el tejido de la uretra dorsal anterior. La disociación para producir suspensiones celulares destinadas a la clasificación por flujo es un equilibrio delicado entre una digestión enzimática adecuada y la evitación de una sobre-digestión, que puede resultar en baja viabilidad celular. Estas microfotografías muestran tejidos del tracto urogenital inferior y del intestino a la mitad del tiempo de disociación. Como se observa en estas imágenes de tejido adecuadamente digerido antes y después de la diseción manual, trozos triangulares de órganos subdisecados aún son claramente evidentes en tejidos tratados enzimáticamente durante demasiado tiempo o con una concentración excesiva de enzima.

Sin embargo, la suspensión resultante carece de fragmentos tisulares grandes residuales; una disociación adecuada y el filtrado manual producen perfiles de citometría de flujo que típicamente exhiben más del 90 % de células viables, y dentro de esta población viable, las células conservan una expresión intensa de EGFP. La población negra está compuesta por células individuales muertas, marcadas por la incorporación del colorante fluorescente seven a a d. La población gris está compuesta por células singletes, basadas en la dispersión frontal y lateral, que han excluido seven a a d y, por lo tanto, son viables.

La población verde proviene del área positiva para GFP seleccionada por compuerta y está compuesta por células viables individuales que han excluido el siete A a d, y que exhiben fluorescencia de EGFP. Con este procedimiento, puede realizarse el aislamiento de progenitores neuronales a partir de otros tejidos periféricos como la cadena simpática, la raíz dorsal, los ganglios o el pulmón, con el fin de responder preguntas sobre las diferencias en los perfiles de expresión génica entre poblaciones o sobre el desarrollo de linajes distintos.