Un procedimiento optimizado para el activado por fluorescencia de células de clasificación (FACS) El aislamiento de progenitores neurales autónomas de los órganos viscerales de los fetos de ratones

El objetivo general de este procedimiento es derivar una población de progenitores neuronales purificados a partir de los ganglios del sistema nervioso periférico. Esto se logra diseccionando primero el órgano o los ganglios específicos de interés de ratones fetales. A continuación, los tejidos se disocian parcialmente para liberar las células individuales en el medio circundante.

A continuación, la suspensión celular se filtra para eliminar cualquier grupo de tejido residual o agregados grandes. Finalmente, la suspensión celular se clasifica por flujo para aislar la población de interés en función de la expresión de un reportero fluorescente en esa población celular. En última instancia, los patrones de expresión génica se pueden comparar entre progenitores, aislados en diferentes etapas de desarrollo, o entre poblaciones purificadas de diferentes tipos de células neuronales.

La principal ventaja de esta técnica sobre el aislamiento de poblaciones celulares basado en el marcaje de anticuerpos es que a menudo no se dispone de reactivos inmunológicos. Para etiquetar células que expresan un gen particular, líneas de ratones modificados genéticamente que producen proteínas fluorescentes en subconjuntos neuronales discretos permiten el aislamiento de estas poblaciones celulares. Si bien demostramos este método para el aislamiento de progenitores neuronales del intestino y el rastro neurogénico de la boca, también se puede aplicar a otros sistemas modelo que expresan reporteros fluorescentes.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque tienden a digerir en exceso los tejidos de origen, lo que resulta en una pérdida de viabilidad celular. Antes de comenzar la disección, observe los embriones mediante iluminación de campo claro para asegurarse de que las estructuras relevantes estén enfocadas. A continuación, identifique los embriones transgénicos positivos mediante el cribado de la expresión del indicador fluorescente utilizando un microscopio estereoscópico fluorescente.

Después de la eutanasia, los embriones comienzan agregando una cantidad mínima de PBS a la placa de disección, para que el embrión no flote mientras se diseccionan los tejidos. Abrir la piel del embrión a lo largo de los lados del cuerpo y a través del abdomen a la altura del hígado. Enrolle el embrión sobre su espalda y use pinzas finas para sujetarlo en su lugar.

A nivel de la extremidad anterior, inserte otro par de pinzas a nivel del diafragma y luego enérgicamente. Tire de los órganos internos hacia abajo hacia la cola y lejos de la pared dorsal del cuerpo para eliminar las vísceras desde el hígado hasta el tubérculo genital. Si algún órgano de la cavidad torácica, como el corazón o los pulmones, sale unido a las vísceras, retírelos antes de continuar.

Una vez que las vísceras abdominales estén separadas del cadáver, inserte un par de pinzas debajo del hígado, cerca del estómago, y separe suavemente el hígado del intestino. A continuación, diseccione cuidadosamente el intestino posterior de la uretra dorsal y extraiga el intestino del tracto urogenital. Finalmente, voltee el intestino para que el bazo sea visible debajo del estómago.

Extirpar el bazo y el páncreas. Separe los bucles de la tripa sujetando el mesentario. A continuación, retire el mesentario y la vasculatura que lo acompaña del intestino tirando suavemente del mesentario.

Evite sujetar el intestino directamente con las pinzas. Si el intestino se rompe, simplemente agrupe las piezas separadas en la etapa de disociación. Agrupe cada tipo de tejido en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga HBSS frío como hielo según el tipo de tejido y el tipo de fenotipo del embrión.

Después de la granulación, los tejidos subdiseccionados aspiran la mayor cantidad posible de HBSS. A continuación, vuelva a suspender el pellet de tejido en uno o varios mililitros de ACU máx. Cambio de las puntas de pipeta entre cada muestra.

Para evitar la contaminación cruzada de los tipos de tejidos, coloque los tubos en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 20 a 45 minutos. Dependiendo de la etapa del tejido que se aísla, la disociación y el filtrado del tejido es la parte más complicada del procedimiento para evitar la disociación manifiesta del tejido. Y como resultado, baja viabilidad celular.

Limite el tiempo de disociación y no intente disociar completamente todas las piezas de tejido a mitad de camino. Y al final del tiempo de disociación, rompa manualmente el tejido golpeando vigorosamente el tubo contra el costado del baño de agua y arrojando el tubo hacia abajo con un movimiento de muñeca bruscamente. Ahora mueva las muestras disociadas sobre hielo e inmediatamente agregue un mililitro de enfriamiento recién preparado a cada tubo usando una nueva punta de pipeta para cada muestra, trione la muestra hacia arriba y hacia abajo hasta que el tejido esté casi completamente disociado.

Ahora, usando un par de pinzas esterilizadas con etanol, coloque un cuadrado de tres centímetros de membrana de malla de nailon de 38 micras sobre la boca de un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, utilice puntas de diámetro estrecho para filtrar la solución de célula resuspendida individual a través de la malla pipeteando en el centro de la membrana. Una vez que se haya filtrado la suspensión celular, enjuague el tubo de muestra con un mililitro de enfriamiento de uno a cinco y filtre las células restantes.

A continuación, retire la membrana teniendo cuidado de evitar que cualquier muestra de tejido sin filtrar entre en el tubo. Después de la granulación, las suspensiones celulares aspiran el sobrenadante y resuspenden la pellet en un mililitro de enfriamiento de uno a cinco. A continuación, filtre cada suspensión celular a través de una malla de nailon en tubos de poliestireno de cinco mililitros, como se muestra acabamos de mostrar.

Comience reservando una pequeña alícuota de la muestra de fluorescencia para el control de compensación solo de EGFP. A continuación, divida la muestra de tejido de tipo salvaje en dos porciones, etiquetando una sola de tipo salvaje y las otras siete de la A a la d. Únicamente. Ahora llene todos los tubos de muestra con enfriamiento del uno al cinco, y después de peletizar las muestras, aspire todos menos los últimos 200 microlitros de sobrenadante en cada tubo.

Por último, agregue siete a a d a las muestras a clasificar y las siete a a d solo controle. A continuación, añada 0,75 mililitros de triazol LS a la microcentrífuga de 1,5 mililitros. Los tubos de recolección de muestras comienzan utilizando las muestras de control para establecer los parámetros de compensación y las puertas para evitar siete células muertas positivas A a D y para recolectar células que exhiben una alta intensidad de fluorescencia GFP.

Después de configurar los parámetros de compensación, comience a clasificar a la presión más baja posible con una boquilla de diámetro ancho y un caudal bajo. Recoja un máximo de 25.000 células en cada tubo de microcentrífuga para que el triol LS no se diluya demasiado. Inmediatamente después de clasificar el vórtice, cada tubo de células capturado en el triol ls.

En esta primera figura, se muestra un tracto genital europeo completo a los 15,5 días después del coito visto ventralmente bajo iluminación de campo claro. La misma muestra se observa bajo iluminación de fluorescencia para demostrar la distribución de las células positivas para EGFP en los ganglios celíacos suprarrenales y mediales localizados según se identifican por su expresión de transgén TH EGFP. Esta vista lateral de una vejiga subdisecada TH EGFP 15,5 días después del cotus muestra fluorescencia de la expresión de transgenes en los ganglios pélvicos, la pared de la vejiga y la uretra.

En esta vista dorsal del mismo EGFP, las células positivas son evidentes en la uretra dorsal anterior, la disociación del tejido para producir suspensiones celulares para la clasificación de flujo es un delicado equilibrio entre una digestión enzimática adecuada y evitar la digestión excesiva que puede resultar en bajas variabilidades celulares. Estas fotomicrografías muestran el tracto urogenital inferior y los tejidos intestinales a mitad del tiempo de disociación. Como se ve en estas fotos de tejido adecuadamente digerido antes y después del manual, las tres piezas de órganos subdisecados todavía son claramente evidentes en los tejidos que se tratan enzimáticamente durante demasiado tiempo o con una concentración demasiado alta de enzima.

Sin embargo, la suspensión resultante carece de grandes trozos residuales de tejido y la disociación adecuada y el filtrado manual produce perfiles de citometría de flujo que suelen exhibir más del 90% de células viables y aquellas células que expresan el reportero en esta población viable, las células retienen la expresión de EGFP de alta intensidad. La población negra está compuesta por células individuales que están muertas y marcadas por la captación de siete a a d muertes por fluorescencia. La población gris está compuesta por células singlete basadas en la dispersión frontal y lateral que han excluido siete a a d y, por lo tanto, son viables.

La población verde proviene del área cerrada positiva de GFP y está compuesta por células viables individuales que han excluido siete A a d, y que exhiben fluorescencia de EGFP. Con este procedimiento, se puede realizar el aislamiento de progenitores neuronales de otros tejidos periféricos como la cadena simpática, la raíz dorsal, los ganglios o el pulmón para responder preguntas sobre las diferencias en los perfiles de expresión génica entre poblaciones o sobre el desarrollo de linajes distintos.