Un ensayo Galvanotaxis por análisis de la cinética precursoras neurales migración celular en un campo aplicado externamente directo Corriente Eléctrica

El objetivo general de este procedimiento es visualizar la migración de células precursoras neuronales derivadas de adultos en presencia de un campo eléctrico de corriente continua. Esto se logra primero aislando y cultivando células precursoras neurales subependimarias del ratón adulto. El siguiente paso es preparar las cámaras Galván Axxis y transferir las células precursoras neurales a las cámaras.

El paso final es aplicar un campo eléctrico de corriente continua a través de la cámara Galván Axxis y realizar imágenes de lapso de tiempo para observar la migración de los neuroprecursores. En última instancia, la microscopía de imágenes de lapso de tiempo captura las propiedades tácticas de Galván de los neuroprecursores en sus estados diferenciados e indiferenciados. Aunque este método puede proporcionar información sobre el oasis de galván de las células neuroprecursoras, también se puede aplicar a otros sistemas, como un modelo de accidente cerebrovascular de ratón para el reclutamiento de neuroprecursores en los sitios de las lesiones para mejorar la reparación neurológica.

Rob Pilley Post, un estudiante graduado de mi laboratorio, demostrará el procedimiento. Al comenzar este procedimiento, los NPC deben haber estado en cultivo durante siete días, para que las neuroesferas primarias que flotan libremente estén listas para la cosecha. Cuando sea necesario, comience a preparar tres cámaras Galván Axxis colocando tres vasos cuadrados.

Número uno, cubra los resbalones en una botella de seis ácido clorhídrico normal durante la noche. Temprano al día siguiente, prepare el gel de matra para que se descongele lentamente sobre hielo. Después de cuatro horas, estará listo para usar para construir la cámara.

Primero, use un cortador de vidrio con punta de diamante para cortar seis tiras rectangulares de vidrio de un nuevo cuadrado. Número uno, cubreobjetos. Transfiera los deslizamientos cuadrados y rectangulares lavados con ácido a una campana de flujo laminar.

Lave las tiras de vidrio con etanol al 70% seguido de agua de autoclave de grado de cultivo de tejidos. Deje que se sequen al aire o séquenlos en papel sin pelusa. A continuación, aplique grasa al vacío en el perímetro de una superficie de cada portaobjetos de vidrio cuadrado y séllelos a la base de plástico de 60 milímetros.

Placas de Petri. Aplique grasa al vacío en un lado de las tiras de vidrio rectangulares y séllelas en los bordes opuestos del cuadrado. El vidrio se desliza para crear cuadrados con un canal central en el centro de cada plato.

Los rayos UV esterilizan estos cuadrados o cámaras de vidrio modificado durante al menos 15 minutos en una capucha. A continuación, pipetee de 250 a 300 microlitros de poliol lisina en el canal central de las cámaras. A continuación, incubar las cámaras a temperatura ambiente durante dos horas, aproximadamente 15 minutos antes de que finalice la incubación.

Preparar la solución de gel de matri después de dos horas, aspirar la lisina de poliol y lavar los canales centrales con un mililitro de agua de autoclave. A continuación, pipetee de 250 a 300 microlitros de solución de gel Matri en los canales centrales e incube las cámaras a 37 grados centígrados durante una hora. Después de la incubación, aspire la solución de matrigel.

A continuación, lave suavemente los comederos centrales con uno o dos mililitros de SFM. Ahora pipetee 100 microlitros de E-F-H-S-F-M o F-B-S-S-F-M en los canales centrales en preparación para las células cultivadas. A continuación, pipetee de cuatro a cinco mililitros de la esfera neuroslógica que contiene el cultivo en una nueva placa de Petri de 60 milímetros.

A continuación, coloque la placa de Petri en la platina del microscopio de conteo debajo del objetivo de visualización de cinco veces. Utilice una pipeta P 10 para transferir suavemente de cinco a ocho neurosferas enteras al canal central de cada cámara. Hasta cuatro.

Las neuroesferas pueden transferirse a la vez, pero no hay que disociarlas de las neuroesferas de los canales centrales. Extiéndalos con cuidado sin alterar el sustrato de matrigel. A continuación, añada 150 microlitros adicionales de E-F-H-S-F-M o F-B-S-S-F-M en los canales centrales.

Ahora cultiva, las células en una incubadora humidificada. Después de 17 a 20 horas en cultura, los NPC indiferenciados estarán disponibles después de 69 a 72 horas. En la cultura, habrá NPC diferenciados disponibles.

Bajo el microscopio de contabilidad, seleccione la cámara con las mejores celdas para el análisis de migración de imágenes de células vivas. Las células deberían estar casi completamente disociadas de sus neuroesferas y aún no han comenzado a formar procesos en una capucha. Prepara una cubierta de la cámara.

Lave una cubierta de vidrio cuadrada con etanol al 70%, luego con agua esterilizada en autoclave y aplique una tira de grasa de vacío en dos bordes paralelos. Ahora cubra la cámara. Primero, aspire los medios de cultivo desde el canal central y luego selle rápidamente la cubierta, deslícela sobre las paredes rectangulares como un techo.

A continuación, utilizando la acción capilar, cargue 100 microlitros de medios frescos en el canal central. Ahora use grasa de vacío para crear bordes para piscinas de medios de cultivo. En cada extremo del canal central en el sistema de imágenes de células vivas, se han preparado tubos de gel agros, plata, electrodos de cloruro de plata y dos placas de Petri de 60 milímetros para usar.

Como reservorios de medios de cultivo, permita que las cámaras descansen dentro del ambiente de 37 grados Celsius 5% de dióxido de carbono durante 20 a 30 minutos. Durante este tiempo, prepare las tapas de las dos placas de Petri vacías y la tapa de la placa de Petri de las cámaras Galván Axxis perforando agujeros en ellas con una pipeta Dremel o herramienta, de 1,5 a dos mililitros de medios a cada lado del canal central y agregue de siete a ocho mililitros de SFM en cada placa de Petri vacía. Coloque una placa de Petri a cada lado del canal central de la cámara y coloque un electrodo en cada placa.

Cierre el espacio entre la cámara y las placas de Petri para establecer la continuidad eléctrica. Con los puentes de gel Agros, conecte los electrodos a una fuente de alimentación externa con un medidor M en serie para medir la corriente eléctrica y encender la fuente de alimentación. Utilice un volímetro para medir la intensidad del campo eléctrico directamente a través del canal central.

Ajuste la salida de la fuente de alimentación según sea necesario. Ahora inicie el módulo de lapso de tiempo en el sistema de imágenes. En el software de visión Axio, seleccione adquisición multidimensional y haga clic en ver.

Para los canales, seleccione el canal seis, haga clic en T para el lapso de tiempo. Establezca la configuración del intervalo de lapso de tiempo en un minuto, establezca la duración en ocho horas en los campos de configuración antes, después del punto de tiempo, seleccione el punto de tiempo antes y después. Ahora haga clic en iniciar y permita que el experimento se ejecute durante la cantidad de tiempo deseada después de completar el ensayo, continúe con el análisis IHC.

El análisis cinemático reveló que en presencia de un DCEF de 250 milivoltios por milímetro, las NPC indiferenciadas exhiben, axxis de galván altamente dirigidas y rápidas hacia el cátodo a esta intensidad de campo, más del 98% de las NPC indiferenciadas migraron durante las seis a ocho horas completas durante las seis a ocho horas durante las que fueron fotografiadas. En ausencia de A-D-C-E-F. Se observó un movimiento aleatorio de las células.

Dado que las células muertas no migran, esto sugiere que permanecen viables durante este período. En ausencia o presencia de A-D-C-E-F, los fenotipos diferenciados experimentaron una migración insignificante, tanto en presencia como en ausencia de subconjuntos A-D-C-E-F de células diferenciadas. Procesos extendidos que tendían a alinearse perpendicularmente a la dirección del DCEF, pero no se observó una translocación notable del cuerpo celular.

La inmunotinción verificó que las NPC mantuvieron la expresión positiva del nido de marcadores precursores neurales después de seis horas de exposición a DC EF. En los ensayos con NPCs inducidas a diferenciarse en fenotipos maduros, la mayoría de las células expresan el marcador de astrocitos maduros proteína ácida fibrilar glial o GFAP después de seis horas de exposición a DCEF. Siguiendo este procedimiento, se puede adquirir información sobre los mecanismos celulares que están involucrados en la transducción del campo eléctrico de corriente continua en motilidad celular mediante el uso de modelos genéticos de knockout.

O señor, un por ejemplo.