Name: Un ensayo Galvanotaxis por análisis de la cinética precursoras neurales migración celular en un campo aplicado externamente directo Corriente Eléctrica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Aprende a visualizar la migración de células precursoras neuronales mediante galvanotaxis en camaras Galvan Axxis con campo eléctrico continuo. Este método permite estudiar la reparación neural en modelos de neurociencia.

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Este trabajo es financiado por las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (subvención # 249669, 482986 y #) y Heart and Stroke Foundation de Canadá (subvención # 485508). Los autores agradecen a Youssef El-Hayek y el Dr. Qi Wan por su ayuda en la elaboración de los protocolos experimentales.

Todos los procedimientos que impliquen la manipulación de animales fueron aprobados por la Universidad de Toronto Comité de Cuidado de Animales de acuerdo con las directrices institucionales (Protocolo n º. 20009387). Los siguientes métodos se debe realizar utilizando instrumentos estériles y técnicas, en una campana de flujo laminar en su caso. En el texto siguiente protocolo, la frase &quot;EFH-SFM&quot; se refiere a medio libre de suero suplementado con factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de fibroblastos básico y la heparina. EFH-SFM se utiliza en la investigación de la galvanotaxia de NPCs no diferenciados debido a que estos mitógenos mantener NPCs en su estado indiferenciado 4. Al investigar la galvanotaxia de NPCs inducidas a diferenciarse en tipos de células maduras, &quot;FBS-SFM&quot; se refiere a medio libre de suero suplementado con suero fetal bovino al 1%. FBS promueve la diferenciación de NPCs en maduros fenotipos neurales 5. 1. Aislamiento y cultivo de precursores neurales (Nose muestra en vídeo) <ol><li> Anestesiar un ratón CD1 (6-8 semanas) con isofluorano y el sacrificio por dislocación cervical. </li><li> Apaga la cabeza en 70% de etanol y decapitar al animal con tijeras de disección cortante. </li><li> Mientras sostiene la cabeza con fórceps quirúrgico, quitar la piel en la superficie dorsal para exponer el cráneo. </li><li> Utilizando un escalpelo y no. 11 blade, anotar el cráneo en el seno frontal a lo largo del eje mediolateral, y también a lo largo de la sutura sagital en la dirección rostrocaudal. </li><li> Pelar los huesos parietales lejos de la cabeza con no. 7 pinzas curvas, teniendo cuidado de no perforar el tejido cerebral. </li><li> Insertar una espátula fina debajo del cerebro a partir de debajo del cerebelo y avanzando hacia los bulbos olfatorios. Mientras sostiene el cráneo en su lugar con pinzas, tire suavemente del cerebro del cráneo y de inmediato se coloca en el hielo frío artificial líquido cefalorraquídeo (ver recetas a continuación). </li><li> Bajo un microscopio de disección, usando estériltijeras y pinzas de disección del cerebro cortar por la mitad a lo largo de la línea media. Gire cada hemisferio a fin de que la media (corte) de la superficie hacia arriba. </li><li> Seleccione un hemisferio, y con la superficie medial hacia arriba, busque el esplenio del cuerpo calloso (región posterior del cuerpo calloso). </li><li> Hacer una incisión en la superficie de la corteza de la rodilla del cuerpo calloso a lo largo del eje dorsoventral. </li><li> Pelar la corteza incisa hacia el bulbo olfatorio para exponer las paredes medial y lateral del ventrículo lateral. </li><li> Girar el hemisferio para que la superficie dorsal esté orientada hacia arriba, y el uso de micro tijeras curvadas para cortar y recoger las paredes expuestas medial y lateral, que contienen la región periventricular NPCs donde residen 6. </li><li> Repita los pasos 1.8 a 1.11 para el otro hemisferio. </li><li> Pipetear el tejido aislado en 7 ml de solución de tripsina (ver receta a continuación) en un tubo de 15 cc, y coloque el tubo en un rockero en un 37 ° Cincubadora durante 25 min. </li><li> Centrifugar el tubo a 1.500 rpm durante 5 min, aspirar el sobrenadante, y resuspender el tejido en 2 ml de solución de inhibidor de tripsina (véase la receta a continuación). </li><li> Suavemente se tritura el tejido con una pipeta Pasteur de pequeñas perforaciones 30-50 veces con cuidado para evitar burbujas de aire. </li><li> Centrifugar el tubo a 1.500 rpm durante 5 min, aspirar el sobrenadante, y resuspender en 1-2 ml de SFM (ver receta más abajo) triturando el pellet 3-5 veces. </li><li> Centrifugar el tubo a 1.500 rpm durante 3 min, aspirar el sobrenadante y se resuspende en 1 ml de SFM + EFH. </li><li> Contar vivir densidad de células con un hemocitómetro y la placa de las células en un matraz de cultivo T25 a una densidad de 10 células por microlitro en SFM + EFH. </li><li> Deje que la cultura a crecer durante 7 días no perturbados para producir flotan libremente neuroesferas primarias compuestas de NPCs. </li></ol> 2. Galvanotaxis cámara de preparación <ol><li> Coloque 3 cristal cuadrado no. Un cubreobjetos (22 x 22 x 0,17 mm) ina botella de ácido clorhídrico 6 N durante la noche. </li><li> El día siguiente, utilizar una punta de diamante de cristal del cortador para cortar 6 tiras rectangulares (22 x 5 x 0,17 mm) de vidrio de no cuadrado. Un cubreobjetos. </li><li> Transfiera los resbalones cuadrados lavados con ácido e injertos rectangulares en una campana de flujo laminar. Lavar las tiras rectangulares y cuadradas primero con 70% de etanol, luego con el cultivo de tejidos de grado agua tratada en autoclave, y permitir que se seque en un Kim Wipe (para esterilidad añadido, el cristal se puede permitir que el aire seco). </li><li> Aplicar grasa de vacío para el perímetro de una superficie de las placas de vidrio cuadrados, y los sella a la base de 60 mm de placas Petri de plástico. </li><li> Aplicar grasa de vacío a lo largo del eje largo de una superficie de las tiras rectangulares de vidrio, y sellar los bordes opuestos de las placas de vidrio cuadrados (de forma que son paralelas entre sí) con el fin de crear un canal central. </li><li> UV-esterilizar las cámaras durante al menos 15 min en la campana de flujo laminar. </li><li> Pipetear 250-300 l de poli-L-Lysine en el canal central de las cámaras y se incuban a temperatura ambiente durante 2 h. </li><li> Aproximadamente 15 min antes de la finalización del periodo de incubación, preparar la solución de Matrigel (ver receta más abajo). </li><li> Aspirar el poli-L-lisina, se lavan los canales centrales con 1 ml de agua esterilizada, y la pipeta 250-300 l de solución de Matrigel en las depresiones centrales. </li><li> Incubar las cámaras a 37 º C durante 1 hr. </li><li> Aspirar la solución Matrigel y lavar suavemente los valles centrales con 1-2 ml de SFM. </li><li> Añadir 100 l de EFH-SFM SFM-FBS o en los valles centrales y la transferencia de las cámaras Galvanotaxis en el escenario de un microscopio contando. </li><li> Ml pipeta 3-4 de la cultura neurosphere que contiene en una placa de Petri de 60 mm y transferir la placa de Petri para la etapa del recuento con microscopio. </li><li> En un objetivo de visión de 5x, utilizar una pipeta para transferir P10 5-8 neuroesferas enteros (hasta cuatro a la vez) en el canal central de cada galvanotaxiacámara sin disociar, y extiende con cuidado las neuroesferas alrededor de la depresión central sin interrumpir el sustrato Matrigel. </li><li> Añadir un adicional de 150-200 l de EFH-SFM SFM-FBS o en los valles centrales. </li><li> Transferir las cámaras Galvanotaxis en un 37 ° C, 5% de CO 2, 100% incubador humidificado durante 17-20 horas (si el análisis de NPCs indiferenciadas) para permitir que las neuroesferas para adherirse al sustrato Matrigel y se disocian en células individuales como se muestra en la Figura 1 . Si el análisis de NPCs diferenciados, el período de incubación debe ser extendido a 69-72 horas para permitir la diferenciación de las células. </li></ol> 3. Vivo Celular Time-lapse de imágenes <ol><li> Permitir que el sistema de células de imágenes en vivo se equilibre a 37 ° C, 5% de CO 2 durante un mínimo de 30 min antes de la iniciación de la grabación de lapso de tiempo. </li><li> Corte dos piezas de 12 cm de diámetro a 1 mm Plata alambre, la bobina de un lado, y colocarlos en Clorox blixiviación durante 20 minutos para formar Ag / AgCl electrodos. </li><li> Transferir las cámaras Galvanotaxis sobre la platina de un microscopio contar y seleccionar qué cámara se utilizan para análisis en vivo de células migración de imagen basado en los siguientes criterios: i) las neuroesferas debe ser casi completamente disocia en células individuales y ii) las células deben poseer morfologías circulares con poco o ningún proceso que se extiende desde los cuerpos celulares. </li><li> Transferir la cámara galvanotaxia seleccionado en una campana de flujo laminar, junto con un no cuadrado separado. 1 vaso cubreobjetos y grasa de vacío. </li><li> Lavar la tapa de deslizarse primero con 70% de etanol, luego con agua tratada en autoclave, y aplicar una tira de grasa de vacío en dos bordes paralelos de la hoja de cubierta. </li><li> Aspirar los medios de cultivo de la cubeta central de la cámara, a continuación, colocar rápidamente la hoja de la cubierta (grasa-lado que mira hacia abajo) en la cámara de tal manera que el resto grasa tiras de las dos tiras paralelas rectangulares de vidrio, creando efectivamente un techoa la cámara. </li><li> Añadir 100 l de nuevo EFH-SFM SFM-FBS o en la pila central a través de la acción capilar. </li><li> Use grasa de vacío para crear bordes de piscinas de medios de cultivo en cada extremo de la cubeta central, como se muestra en la Figura 2. </li><li> Cortar dos piezas de 15 cm de tubo de PVC, y utilizar una jeringa de 10 cc con una aguja de calibre 18 para inyectar cuidadosamente una solución de agarosa en el tubo, asegurándose de que no se forman burbujas en los tubos, y permitir que el gel solidifique durante 5 min. </li><li> Transferir la cámara galvanotaxia al sistema de células de imágenes en vivo, junto con los tubos de gel de agarosa, Ag / AgCl, y un par de vacío 60 mm placas de Petri que serán utilizados como medios de cultivo embalses y contendrá el Ag / AgCl. Permitir la cámara galvanotaxia a descansar dentro de la 37 ° C, 5% de CO 2 ambiente durante 20-30 min. </li><li> Durante este tiempo, preparar las tapas de las cajas de Petri vacías 2 y la tapa de la cámara de cápsula de Petri galvanotaxia por los agujeros de perforaciónen ellos con una herramienta Dremel o similar como se muestra en la Figura 3. </li><li> Pipetear 1-1.5 ml de EFH-SFM o FBS SFM-en ambos lados de la depresión central, y 7-8 ml de SFM en cada placa de Petri vacía. Colocar una placa de Petri en cada lado del canal central de la cámara de galvanotaxia y coloque un electrodo Ag / AgCl en cada plato. Salvar la distancia entre la cámara de galvanotaxia y las placas Petri a establecer la continuidad eléctrica con los puentes en gel de agarosa, tal como se muestra en la Figura 4. </li><li> Conecte los electrodos de Ag / AgCl a una fuente de alimentación externa, con un amperímetro en serie para medir la corriente eléctrica y encienda la fuente de alimentación. Use un voltímetro para medir la fuerza del campo eléctrico directamente a través de la depresión central, y ajustar la salida de la fuente de alimentación hasta que la fuerza deseada de campo eléctrico se consigue (los ensayos realizados en este laboratorio utilizan una fuerza dcEF de 250 mV / mm con corriente eléctrica entre 1 y 1,5 mA). </li><li> IniciativaTE el módulo de lapso de tiempo en el sistema de células de imágenes en directo, y permitir el experimento para funcionar para la cantidad de tiempo deseada. Después de completar el ensayo, fijar las células en 4% de paraformaldehído para el análisis de inmunotinción estándar. </li></ol>

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<li>Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lipids%2C+EGF+receptors%2C+and+intracellular+signals+colocalize+and+are+polarized+in+epithelial+cells+moving+directionally+in+a+physiological+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field.</a> The FASEB Journal. , (2002).</li>
<li>Fang, K., Ionides, E., Oster, G., Nuccitelli, R., Isseroff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+receptor+relocalization+and+kinase+activity+are+necessary+for+directional+migration+of+keratinocytes+in+DC+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields.</a> J. Cell Sci. 112, 1967-1976 (1999).</li>
<li>McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+Cell+Behavior+Electrically%3A+Current+Views+and+Future+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Controlling Cell Behavior Electrically: Current Views and Future Potential.</a> Physiol. Rev. 85, 943-978 (2005).</li>
<li>Morshead, C. M., Benveniste, P., Iscove, N. N., vander Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+competence+is+a+rare+property+of+neural+stem+cells+that+may+depend+on+genetic+and+epigenetic+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic competence is a rare property of neural stem cells that may depend on genetic and epigenetic alterations.</a> Nat. Med. 8, 268-273 (2002).</li>
<li>Babona-Pilipos, R., Droujinine, I. A., Popovic, M. R., Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+Subependymal+Neural+Precursors%2C+but+Not+Differentiated+Cells%2C+Undergo+Rapid+Cathodal+Migration+in+the+Presence+of+Direct+Current+Electric+Fields%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Adult Subependymal Neural Precursors, but Not Differentiated Cells, Undergo Rapid Cathodal Migration in the Presence of Direct Current Electric Fields.</a> PLoS ONE. 6, e23808(2011).</li>
<li>Deuschl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Randomized+Trial+of+Deep-Brain+Stimulation+for+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">A Randomized Trial of Deep-Brain Stimulation for Parkinson's Disease.</a> N. Engl. J. Med. 355, 896-908 (2006).</li>
<li>Stone, S. S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+Entorhinal+Cortex+Promotes+Adult+Neurogenesis+and+Facilitates+Spatial+Memory%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stimulation of Entorhinal Cortex Promotes Adult Neurogenesis and Facilitates Spatial Memory.</a> J. Neurosci. 31, 13469-13484 (2011).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Este protocolo ha sido adaptado de los métodos bien establecidos de estudios previos 7-9. Galvanotactic cámaras pueden construirse utilizando una variedad de técnicas diferentes, incluyendo la construcción de un vaso separado bien para el confinamiento de la siembra de células, o el uso de CO 2 ablación con láser para la microfabricación de la depresión central 10,11. Algunas técnicas pueden ser más laborioso o costosos que otros. Se ha descrito un ensayo simple y rentable para la constr...

<table border="1"><tbody><tr><td height="44"> Nombre del elemento </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Precursoras neurales de aislamiento de células </td></tr><tr><td> 2 M NaCl </td><td> Sigma </td><td> S5886 </td><td> 11,688 g disueltos en 100 ml de dH 2 O </td></tr><tr><td> 1 M KCl </td><td> Sigma </td><td> P5405 </td><td> 7,456 g disueltos en 100 ml de dH 2 O </td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2 </td><td> Sigma </td><td> M2393 </td><td> 20,33 g disueltos en 100 ml de dH 2 O </td></tr><tr><td> 155 mM NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S5761 </td><td> 1,302 g disueltos en 100 ml de dH 2 O </td></tr><tr><td> La glucosa 0,5 M </td><td> Sigma </td><td> G6152 </td><td> 9,01 g disueltos en 100ml dH 2 O </td></tr><tr><td> 108 mM CaCl 2 </td><td> Sigma </td><td> C7902 </td><td> 1,59 g disueltos en 100 ml de dH 2 O </td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina de páncreas bovino </td><td> Sigma </td><td> T1005 </td><td></td></tr><tr><td> Ovejas testículos hialuronidasa </td><td> Sigma </td><td> H6254 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido quinurénico </td><td> Sigma </td><td> K3375 </td><td></td></tr><tr><td> Inhibidor de tripsina de ovomucoide </td><td> Worthington </td><td> LS003086 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12100046 </td><td></td></tr><tr><td> F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 21700075 </td><td></td></tr><tr><td> 30% de glucosa </td><td> Sigma </td><td> G6152 </td><td></td></tr><tr><td> 7,5% NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1 M </td><td> Sigma </td><td> H3375 </td><td> 23,83 g disueltos en 100 ml de dH 2 O </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> FEAG </td><td> Invitrogen </td><td> PMG8041 </td><td> Reconstituir en 1 ml de mezcla de la hormona y la alícuota en 20 unidades mu l. </td></tr><tr><td> FGF </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0226 </td><td> Reconstituir en 0,5 ml de mezcla de la hormona y la alícuota en 20 unidades mu l. </td></tr><tr><td> La heparina </td><td> Sigma </td><td> H3149 </td><td></td></tr><tr><td> Apo-transferrina </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 3188-AT </td><td> 0,1 g disueltos en 4 ml de dH 2 0 </td></tr><tr><td> Putrescina </td><td> Sigma </td><td> P7505 </td><td> Disolver 9,61 mg en Apo-transferrina asíción </td></tr><tr><td> Insulina </td><td> Sigma </td><td> I5500 </td><td> Disolver 25 mg en 0,5 ml de HCl 0,1 N y añade a 3,5 ml de dH 2 0 </td></tr><tr><td> Selenio </td><td> Sigma </td><td> S9133 </td><td></td></tr><tr><td> Progesterona </td><td> Sigma </td><td> P6149 </td><td></td></tr><tr><td> Herramientas generales Dissection </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Disección microscopio </td><td> Zeiss </td><td> Stemi 2000 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Galvanotaxis cámara de preparación </td></tr><tr><td> Square portaobjetos de vidrio cubierta </td><td> VWR </td><td> 16004 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido clorhídrico 6N </td><td> VWR </td><td> BDH3204-1 </td><td></td></tr><tr><td> Grasa de alto vacío </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 60 mm Placas de Petri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> Poli-L-lisina </td><td> Sigma </td><td> P4707 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 354234 </td><td> Descongelar y alícuota en 150 unidades mu l </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 10082139 </td><td> Utilice únicamente si la inducción de diferenciación NPC, de lo contrario usar SFM + EFH medios de cultivo como se ha indicado anteriormente </td></tr><tr><td> Contando microscopio </td><td> Olimpo </td><td> CKX41 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Vivo Celular Time-lapse de imágenes </td></tr><tr><td> Alambre de plata </td><td> Alfa Aesar </td><td> 11434 </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure agarosa </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-027 </td><td></td></tr><tr><td> Calentar la inactividadATED FBS </td><td> Sigma </td><td> 16140071 </td><td></td></tr><tr><td> Tubería de PVC </td><td> Fisher Scientific </td><td> 80000006 </td><td> 3/32 &quot;ID x 5/32&quot; OD </td></tr><tr><td> Blanqueador </td><td> Clorox </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10 cc jeringa </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> Calibre 18 aguja </td><td> BD </td><td> 305195 </td><td></td></tr><tr><td> Dremel taladro </td><td> Dremel </td><td> Modelo 750 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio invertido equipado con cámara de humidificado, incubados </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert-200M </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Recetas <table border="1"><tbody><tr><td> Artículo </td><td> Volumen </td></tr><tr><td> 2 M NaCl </td><td> 6,2 ml </td></tr><tr><td>1 M KCl </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2 </td><td> 0,32 ml </td></tr><tr><td> 155mm NaHCO 3 </td><td> 16,9 ml </td></tr><tr><td> La glucosa 1M </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 108 mM CaCl 2 </td><td> 0,09256 ml </td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Agua autoclave </td><td> 74 ml </td></tr></tbody></table> Líquido cefalorraquídeo artificial <table border="1"><tbody><tr><td> Artículo </td><td> Volumen o Masa </td></tr><tr><td> Líquido cefalorraquídeo artificial </td><td> 30 ml </td></tr><tr><td> Tripsina de páncreas bovino </td><td> 40 mg </td></tr><tr><td> Ovejas testículos hialuronidasa </td><td> 22,8 mg </td></tr><tr><td> Ácido quinurénico </td><td> 5 mg </td></tr></tbody></table> &lt;strong&gt; solución de tripsina <table border="1"><tbody><tr><td> Artículo </td><td> Volumen o Masa </td></tr><tr><td> SFM </td><td> 15 ml </td></tr><tr><td> Inhibidor de tripsina de ovomucoide </td><td> 10 mg </td></tr></tbody></table> Solución de inhibidor de tripsina <table border="1"><tbody><tr><td> Artículo </td><td> Volumen </td></tr><tr><td> Agua autoclave </td><td> 37 ml </td></tr><tr><td> 10 veces DMEM/F12 </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> 30% de glucosa </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> 7,5% NaHCO 3 </td><td> 1,5 ml </td></tr><tr><td> HEPES 1 M </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> Transferrina, putrescina solución </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td> 25 mg solución de insulina </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td> Selenio </td><td> 100 y mu; L </td></tr><tr><td> Progesterona </td><td> 100 l </td></tr></tbody></table> Hormona Mix (100 ml en total, almacenan a -20 ° C) <table border="1"><tbody><tr><td> Artículo </td><td> Volumen </td></tr><tr><td> Agua autoclave </td><td> 37,5 ml </td></tr><tr><td> 10X DMEM/F12 (3:1) </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 30% de glucosa </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 7,5% NaHCO 3 </td><td> 0,75 ml </td></tr><tr><td> HEPES 1 M </td><td> 0,25 ml </td></tr><tr><td> Hormona de mezcla </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td> 0,5 ml </td></tr></tbody></table> Serum Free Media EFH-SFM: añadir 10 l de EGF, 10 l de FGF, y 3,66 l de heparina FBS-SFM: añadir 0,5 ml de FBS <table frontera = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> Artículo </td><td> Volumen </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> 150 l </td></tr><tr><td> SFM </td><td> 3,6 ml </td></tr></tbody></table> Matrigel Solución alícuota Matrigel debe ser colocado en una caja de hielo y se dejó descongelar lentamente durante 4-5 horas para formar un líquido viscoso antes de mezclar con SFM. Esto asegurará la formación de una capa lisa de sustrato Matrigel. Si no descongelaron lentamente, el sustrato resultante contendrá grupos de Matrigel, posiblemente obstaculizar la migración celular. <table border="1"><tbody><tr><td> Artículo </td><td> Volumen o Masa </td></tr><tr><td> UltraPure agarosa </td><td> 300 mg en 10 ml ddH 2 0 </td></tr><tr><td> SFM FBS inactivado por calor </td><td> 8 ml 2 ml </td></tr></tbody></table> MatrigelSolución Mezcle 8 ml de SFM con 2 ml de FBS inactivado por calor en un tubo de 15 cc halcón. Mezcla de agarosa con 10 ml ddH 2 0 en un matraz Erlenmeyer, y el calor en un horno de microondas durante 30 segundos en intervalos de 10-sec, asegurando para eliminar la solución del microondas después de cada intervalo de 10-sec y mezclar bien. Tras el final de 10 segundos período de microondas, mezclar la solución de agarosa con el SFM / solución de SFB y guárdelo en un baño de agua 57 ° C. </td></tr></tbody></table>

un ensayo galvanotaxis por análisis de la cinética precursoras neurales migración celular en un campo aplicado externamente directo corriente eléctrica

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

El descubrimiento de células madre neurales y células progenitoras (colectivamente denominadas células precursoras neurales) (CPN) en el cerebro adulto de mamíferos ha conducido a un cuerpo de la investigación dirigida a la utilización de las propiedades multipotentes y proliferativa de estas células para el desarrollo de estrategias neuroregenerativas. Un paso crítico para el éxito de tales estrategias es la movilización de NPCs hacia un sitio de la lesión después de un trasplante exógeno o para aumentar la respuesta de los precursores endógenos que se encuentran en la región periventricular del SNC. Por consiguiente, es esencial para comprender los mecanismos que promueven, orientar y mejorar la migración NPC. Nuestro trabajo se centra en la utilización de los campos eléctricos de corriente directa (dcEFs) promover y migración NPC directa - un fenómeno conocido como galvanotaxia. Endógenos campos eléctricos funcionan como señales fisiológicas esenciales para la migración celular durante el desarrollo normal y la reparación de heridas. Interrupción farmacológica de latrans-neural en embriones de potencial tubo axolotl provoca graves malformaciones en el desarrollo 1. En el contexto de la cicatrización de heridas, la tasa de reparación de córnea heridos se correlaciona directamente con la magnitud del potencial de heridas epiteliales que surge después de la lesión, como se muestra por la mejora farmacológica o la interrupción de este dcEF 2-3. Hemos demostrado que los adultos NPCs subependimales someterse a migración catódica rápida y dirigida in vitro cuando se exponen a un dcEF aplicada externamente. En este protocolo se describen técnicas de nuestro laboratorio para la creación de un ensayo de galvanotaxia simple y eficaz para la alta resolución, observación a largo plazo de la translocación dirigida cuerpo celular (migración) en un nivel de una sola célula. Este ensayo sería adecuado para la investigación de los mecanismos que regulan la transducción de dcEF en la motilidad celular mediante el uso de ratones transgénicos o knockout, ARN corto de interferencia, o agonistas / antagonistas de receptores específicos.

Análisis cinemático revela que en presencia de un 250 mV / mm dcEF, NPCs indiferenciadas exponer galvanotaxia altamente dirigidos y rápido hacia el cátodo (Figura 5A, Película 1). En ausencia de un dcEF, movimiento al azar de las células se observó (Figura 5B, Película 2). En esta intensidad de campo,&gt; 98% de NPCs indiferenciadas migrar para toda 6-8 hr para los que se explora, y ya que las células muertas no migran esto sugiere que permanecen viables durante este período en la ausen...

En este protocolo, se muestran cómo construir cámaras personalizados que permitan la aplicación de un campo eléctrico de corriente directa para activar el tiempo de imágenes a intervalos de cerebro adulto derivado translocación célula precursora neural durante galvanotaxia.

Un ensayo Galvanotaxis por análisis de la cinética precursoras neurales migración celular en un campo aplicado externamente directo Corriente Eléctrica

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar la migración de células precursoras neurales derivadas de adultos en presencia de un campo eléctrico de corriente continua. Esto se logra primero aislando y cultivando células precursoras neurales subependimarias del ratón adulto. El siguiente paso consiste en preparar cámaras Galvan Axxis y transferir las células precursoras neurales a las cámaras.El último paso consiste en aplicar un campo eléctrico de corriente continua a través de la cámara Galvan Axxis y realizar imágenes de lapso de tiempo para observar la migración de los precursores neuronales. En última instancia, la microscopía de imágenes de lapso de tiempo captura las propiedades galvanotácticas de los precursores neuronales en sus estados diferenciado y no diferenciado. Aunque este método puede proporcionar información sobre la galvanosis de las células precursoras neuronales, también puede aplicarse a otros sistemas, como un modelo de accidente cerebrovascular en ratón para el reclutamiento de precursores neuronales hacia sitios de lesión con el fin de potenciar la reparación neuronal.El procedimiento será demostrado por Rob Pilley, un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Al iniciar este procedimiento, las NPCs deben haber estado en cultivo durante siete días, de modo que los neuroesferas primarias flotantes estén listas para ser recolectadas. Cuando sea necesario, comience a preparar tres cámaras Galvan Axxis colocando tres vidrios cuadrados.Primero, colocar las laminillas en un frasco con ácido clorhídrico normal 6 durante la noche. A primera hora del día siguiente, preparar el gel Matra para que se descongele lentamente sobre hielo. Después de cuatro horas, estará listo para usarlo en la construcción de la cámara.Primero, utilice un cortador de vidrio con punta de diamante para cortar seis tiras rectangulares de vidrio a partir de cubreobjetos cuadrados nuevos número uno. Transfiera los cubreobjetos cuadrados lavados con ácido y las tiras rectangulares a una cabina de flujo laminar.Lave las tiras de vidrio con etanol al 70 % seguido de agua estéril para cultivo de tejidos. Deje que sequen al aire o séquelas sobre papel sin pelusas. A continuación, aplique grasa al vacío alrededor del perímetro de una superficie de cada portaobjetos cuadrado de vidrio y séllelos a la base de plástico de 60 milímetros.Placas de Petri. Aplique grasa para vacío en un lado de las tiras de vidrio rectangulares y séllelas en los bordes opuestos del cuadrado. Use portaobjetos de vidrio para crear cuadrados con una ranura central en el centro de cada placa.Sterilice con luz UV estos cuadrados o cámaras de vidrio modificados durante al menos 15 minutos en una cabina. A continuación, pipetee entre 250 y 300 microlitros de poliolisina en la depresión central de las cámaras. Luego incube las cámaras a temperatura ambiente durante dos horas, aproximadamente 15 minutos antes de que finalice la incubación.Prepare la solución de Matrigel después de dos horas, aspire la polilisina y lave las ranuras centrales con un mililitro de agua autoclaveada. Luego, pipete de 250 a 300 microlitros de la solución de Matrigel sobre las ranuras centrales e incube las cámaras a 37 grados Celsius durante una hora. Tras la incubación, aspire la solución de Matrigel.Luego, lave suavemente las ranuras centrales con uno a dos mililitros de medio libre de suero (SFM). Ahora, agregue mediante pipeta 100 microlitros de E-F-H-S-F-M o F-B-S-S-F-M a las ranuras centrales para prepararlas para las células cultivadas. A continuación, transfiera mediante pipeta cuatro a cinco mililitros del cultivo que contiene neuroesferas a un nuevo plato de Petri de 60 milímetros.Luego, coloque la placa de Petri sobre la platina del microscopio de recuento bajo el objetivo de visualización de cinco aumentos. Utilice una pipeta P10 para transferir suavemente de cinco a ocho neuroesferas completas a la ranura central de cada cámara. Hasta cuatro.Los neuroesferas pueden transferirse de inmediato, pero no las disociar con las neuroesferas en las hendiduras centrales. Extiéndalas cuidadosamente alrededor sin alterar el sustrato de matrigel. Luego, añada un volumen adicional de 150 microlitros de E-F-H-S-F-M o F-B-S-S-F-M sobre las hendiduras centrales.Ahora cultive las células en un incubador humedecido. Después de 17 a 20 horas en cultivo, los NPCs no diferenciados estarán disponibles tras 69 a 72 horas. En cultivo, los NPCs diferenciados estarán disponibles.Bajo el microscopio invertido, seleccione la cámara con las mejores células para el análisis de migración mediante imágenes de células vivas. Las células deben ser redondas, casi completamente disociadas de sus neuroesferas y aún no haber formado, o apenas haber comenzado a formar, prolongaciones en la cabina. Prepare una cubierta de cámara.Lave una cubreobjetos cuadrada de vidrio con etanol al 70%, luego con agua autoclavada y aplique una tira de grasa al vacío en dos bordes paralelos. Ahora cubra la cámara. Primero, aspire el medio de cultivo del surco central y luego selle rápidamente la cubreobjetos sobre las paredes rectangulares como si fuera un techo.A continuación, utilizando la acción capilar, cargue 100 microlitros de medio fresco en la ranura central. Ahora utilice grasa de vacío para crear bordes para charcos de medio de cultivo. En cada extremo de la ranura central del sistema de microscopía de células vivas, tenga preparados tubos de gel de agarosa, electrodos de plata y cloruro de plata, y dos placas de Petri de 60 milímetros para usar.Como reservorios de medio de cultivo, deje que las cámaras reposen dentro del ambiente de 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 20 a 30 minutos. Durante este tiempo, prepare las tapas de los dos platos de Petri vacíos y la tapa del plato de Petri de las cámaras Galvan Axxis perforando orificios en ellas con una Dremel o una pipeta de herramienta, agregue de 1,5 a dos mililitros de medio en cada lado del surco central y añada de siete a ocho mililitros de medio SFM en cada plato de Petri vacío. Coloque un plato de Petri a cada lado del surco central de la cámara y coloque un electrodo en cada plato.Cruce el espacio entre la cámara y las placas de Petri para establecer la continuidad eléctrica. Con los puentes de gel Agros, conecte los electrodos a una fuente de alimentación externa con un medidor M en serie para medir la corriente eléctrica y encienda la fuente de alimentación. Utilice un voltímetro para medir directamente la intensidad del campo eléctrico a través del canal central.Ajuste la salida de la fuente de alimentación según sea necesario. Ahora inicie el módulo de lapso de tiempo en el sistema de imagen. En el software Axio Vision, seleccione adquisición multidimensional y haga clic en ver.Para los canales, seleccione el canal seis y haga clic en T para lapse de tiempo. En la configuración, establezca el intervalo del lapse de tiempo en un minuto y la duración en ocho horas en los campos antes y después del punto temporal; seleccione el punto temporal anterior y posterior. Ahora haga clic en iniciar y permita que el experimento se ejecute durante el tiempo deseado. Tras la finalización del ensayo, continúe con el análisis de inmunohistoquímica (IHC).El análisis cinemático reveló que en presencia de un DCEF de 250 milivoltios por milímetro, los NPCs no diferenciados exhiben una galvanoaxia altamente dirigida y rápida hacia el cátodo; a esta intensidad de campo, más del 98 % de los NPCs no diferenciados migraron durante las seis a ocho horas completas en las que fueron observados. En ausencia de un DCEF, se observó un movimiento aleatorio de las células.Dado que las células muertas no migran, esto sugiere que permanecen viables durante este período. En ausencia o presencia de A-D-C-E-F, los fenotipos diferenciados experimentaron una migración insignificante, tanto en presencia como en ausencia de subconjuntos de células diferenciadas A-D-C-E-F. Se observaron procesos alargados que tendían a alinearse perpendicularmente a la dirección del DCEF, pero no se observó una translocación notable del cuerpo celular.La inmunotinción confirmó que las NPCs mantuvieron una expresión positiva del marcador de precursor neural nestin tras seis horas de exposición al campo eléctrico de corriente continua. En los ensayos que involucran NPCs inducidas a diferenciarse en fenotipos maduros, la mayoría de las células expresan el marcador de astrocito maduro proteína ácida fibrilar glial o GFAP tras seis horas de exposición al CDEC. Tras seguir este procedimiento, se pueden obtener conocimientos sobre los mecanismos celulares implicados en la transducción del campo eléctrico de corriente continua en motilidad celular mediante el uso de modelos genéticos con eliminación génica.O señor, un ejemplo.

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