Name: Facilitar el descubrimiento de fármacos: Un sistema automatizado de alta el contenido del ensayo La inflamación en el pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Aprende a realizar cribado fenotípico de alta capacidad para identificar compuestos inmunomoduladores utilizando larvas de pez cebra. Este método automatizado permite cuantificar respuestas inflamatorias mediante microscopía en tiempo real.

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<p class="jove_content"&gt; Damos las gracias a Nadeshda Wolf, Eschen Nadine y Delong Susanne para la ganadería excelente. CW fue apoyado por una beca de doctorado en el programa &quot;Helmholtz<em&gt; BioInterfaces</em&gt; International Graduate School (BIFIGS). El apoyo adicional fue proporcionada por una donación de KIT-RISC y por una Marie Curie Internacional Reintegración de subvención dentro del 7 º Programa Marco de la Comunidad Europea (PIRG07-GA-2010-267,552) al GC. AHS fue apoyada por BOLD (Biología del hígado y el páncreas y el Desarrollo de Enfermedades) - Marie Curie Initial Training Network (238.821). UL fue apoyada por Dopaminet 7PM (Séptimo Programa Marco) (223.744).</p&gt;

1. Manejo de animales Para el ensayo de Chin uso 3 fdd larvas resultantes de los apareamientos de grupo entre homocigotos cldnB doble transgénico :: GFP / lysC :: DsRed2 AB y el pescado (de tipo salvaje). Recoger embriones por desove natural y criarlos a 29 ° C en medio de E3 (5 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4 y 0,1% de azul de metileno, se equilibró a pH 7,0) en placas de Petri. Es esencial para mantener una densidad de embriones que no excedan de 50-70 por placa. 2. Larva Clasificación Compruebe que todas las larvas en un estereoscopio de fluorescencia para la expresión del fluorescente, la inflamación espontánea y desarrollo relacionadas con la edad apropiada. 3. Preparación Examen Medio (Siempre prepare fresco) Preparar medio E3 sin azul de metileno suplementado con DMSO (1% final) y MS222 (0,05 g / l). 4. CuSO4Preparación (Siempre prepare fresco) En primer lugar, pesar CuSO 4 (M r = 159,6 g / mol) y preparar una solución madre 20 mM en dH 2 O. Preparar 120 mM CuSO 4 solución de trabajo (de 20 mM de solución de reserva) en E3/DMSO (1%) / 222-MS. Proteger CuSO 4 solución de la luz. 5. 384 y placa de preparación (Greiner 384 pocillos de microplacas) Pre-añaden 20 l de E3/DMSO (1%) / MS 222-a cada pocillo con una pipeta inversa. Un aumento de punta de la pipeta diámetro es necesario para controlar los embriones con cuidado sin causar ningún herido, esto se hace cortando la punta de un orificio de 2 mm. Transferir sola larva en 74 l de medio a cada pocillo (84 l para el control sin tratar). Si es necesario, las larvas de orientarse en una posición lateral en el bien con un sistema flexible de puntas de pipeta Eppendorf Microloader (Eppendorf, 5242 956.003). Llevar a cabo todos los pasos siguientes para manejo de líquidos con un líquido robotel manejo de estación de trabajo para asegurar el tratamiento simultáneo de todas las larvas. 6. Tratamiento de Drogas Mezcle los compuestos de la placa de drogas de valores 5 veces pipeteando arriba y hacia abajo. Añadir 16 l de la placa de 7.5X existencias de medicamentos a cada pocillo y mezclar 5 veces. Ajuste la posición de la punta dentro de los pozos para evitar lesiones de las larvas y dispensar el medio a 10 l / s. Mezclar medio en pocillos 4 veces para asegurar una distribución homogénea del fármaco dentro del pozo. 7. Incubación Incubar la placa de detección de 1 hora a 29 ° C cubierto con papel de aluminio para proteger los compuestos así como CuSO 4 de la luz. 8. Química hiriente Añadir 10 l de 120 mM CuSO 4 solución de trabajo a cada pocillo, excepto con los controles negativos, mezcla de 4 veces y se incuba de nuevo durante 1 hora a 29 ° C. 9. Lavado Retire y el intercambio de 80 l de mí<html> mediano de cada pocillo dos veces (en 20 pasos l) para eliminar los compuestos y CuSO 4. 10. Adquisición de imágenes Iniciar la adquisición de imágenes en un microscopio invertido automatizado (es decir: Olympus exploración ^ R) 90 minutos después del tratamiento inicial de cobre. Ajuste inicial z nivel de manera que neuromastos de derecha e izquierda de la línea lateral posterior son visibles. Imagen de cada pozo una vez por hora en el campo claro los canales, Cy3 y las buenas prácticas agrarias en 4 planos focales (50 m distancia) con un objetivo de 4x (NA = 0,13). Información adicional sobre la imagen y procesamiento de datos están disponibles bajo petición. 11. Procesamiento de Imágenes 1. Los datos de clasificación Las imágenes RAW se procesan con nuestro script personalizado el software LabVIEW. La primera operación en la canalización de procesamiento de imagen es la clasificación de imágenes en bruto del microscopio carpeta de datos generados por el canal, así y la información de punto de tiempo. ove_step &quot;&gt; 2. foco extendido Posteriormente, el software crea extendidos imágenes de enfoque de 4 planos focales para cada uno de los canales. 3. RGB de superposición En un último paso de las imágenes enfoque ampliado de los 3 canales se combinan para dar lugar a un final de RGB-superposición de imágenes. 4. La detección automática neuromast Una herramienta de reconocimiento de patrones (LabView rápida herramienta de prototipado IA) identifica neuromastos dentro de las superposiciones de imágenes RGB y crea un área de interés definida empíricamente en torno a los neuromastos. 5. Cuantificación Dentro del área de interés definida empíricamente que rodea neuromastos heridos rojos leucocitos fluorescentes refleja en forma de píxeles de color rojo) se obtuvo como resultado de una lectura primaria de p orcentaje una razón o por ccupied eukocytes l (Paol). En promedio 95,27 ± 2,11% (FDA1) y 95,12 ±1,56% (FDA2) de pozos (larvas) se han detectado correctamente y posteriormente se han sometido a procesamiento de datos adicional. La salida de datos en bruto (Paol para cada neuromast detectado) se almacena en un archivo txt y sirve como la entrada de datos para las secuencias de comandos de MATLAB que procesan los datos en bruto más. 12. Procesamiento de Datos 1. Imaps Evaluar el éxito de los experimentos individuales mediante la visualización gráfica de la Paol salida de datos en bruto en un código de color puede ser realizado con los mapas de la inflamación llamados (IMAPS) (Figura 2). Verde brillante refleja un alto índice inflamatoria inicial, el negro indica que no hay inflamación. Esta rápida visión general permite la rápida identificación de los experimentos fallidos, que luego pueden ser excluidos de los análisis de datos adicionales. 2. Un promedio de los controles Cada placa contiene 320 compuestos experimentales que refleja unalos datos de un solo punto por compuesto y el tiempo de punto, así como 32 controles positivos y negativos, respectivamente. El control de 32 repeticiones son en promedio y desviación estándar se calcula. Para los controles sólo puntos de datos dentro de 2 desviaciones estándar están incluidos. 3. Normalización La normalización se lleva a cabo mediante el análisis de hoja de cálculo. El valor promedio de DMSO, siendo el control negativo, se pone a 0 y la más alta Paol promediada para el control de cobre se pone a 1, de modo que la diferencia máxima entre el control positivo y negativo se pone a 1. Paol Cada compuesto se interpolados o extrapolados linealmente a los controles respectivos en la placa experimental. 4. Final de lectura: el índice inflamatorio Después de suficientes experimentos replicados (es decir, 15) han llevado a cabo, normalizó los datos brutos de replicar los experimentos se hacen un promedio, lo que resulta en un final de lectura - la respuesta inflamatoriaíndice. El índice inicial inflamatoria del control de cobre comienza a 100% para el tiempo cero punto y se correlaciona a la hora de inicio de adquisición de imagen (90 minutos después del tratamiento inicial de cobre). 5. Ajuste monotónico regresión exponencial Debido a la resolución de la inflamación a través del tiempo se realiza un ajuste monotónico exponencial de regresión no lineal hacia la inflamación inicial mediante el uso de <img src="/files/ftp_upload/4203/4203eq1.jpg" alt="Ecuación 1" /> - Un 0 es una medida de la respuesta inicial en t = 0, un 1 está relacionada con la pendiente de la magnitud en el tiempo. 6. 2-D función de espacio de parcela (Figura 4) Para generar el espacio de características, una regresión no lineal se aplica y un grupo-análisis divide el espacio de características en regiones características, permitiendo así la identificación automática de candidatos interesantes de diferentes inmuno-moduladores categorías (anti-inflammatteoría, la lucha contra la resolución, pro-inflamatoria, a favor de la resolución). Todos los compuestos se muestran en la parcela 2-D basado en los parámetros de un 0 y un 1. 13. Manipulación y almacenamiento de datos Nuestros datos rutinas de manejo de crear páginas web para visualizar y representar a las pantallas de este tipo de fármacos que proporcionan una visión rápida de la imagen y procesamiento de datos los resultados de los pasos, así como una vista detallada cuando sea solicitado por el usuario 10. Los enlaces blandos a otros relevantes bases de datos heterogéneas biológicas y químicas se integran también para proporcionar un recurso valioso para los estudios comparativos y la novela 11. Por estas rutinas, normas de datos adecuados y metainformación se establecen para el almacenamiento a largo plazo de estos datos. 14. Los resultados representativos En una pantalla de piloto se analizó una biblioteca que consta de 640 aprobado por la FDA conocidos compuestos bioactivos de los efectos en la iniciación, progresión o resolución de una Granulomatosisrespuesta inflamatoria ocytic. Sobre la base de los efectos observados se clasifican 4 tipos de fenotipos moduladores inmunes que pueden ser indicativos de los diferentes modos de acción: anti-inflamatorios (1), anti-resolución (2), pro-inflamatorias (3) y pro-resolución (4) , que puede ser descrito con los parámetros de un 0 y un 1, que surgen de un ajuste de regresión no lineal monotónica (e ao ​​+ alx -) hacia la inflamación inicial. Un 0 representa la magnitud de la respuesta inflamatoria, mientras que un 1 caracteriza a la pendiente de la curva y, por tanto describe la resolución inflamación. Viendo todos los compuestos en una parcela de 2-D característica espacial (un 1 vs un 0) permite la identificación automática de los candidatos de golpe de las categorías moduladores inmunes diferentes (Figura 3). 45 de 640 compuestos ejercida significativo efecto anti-inflamatorio al reducir el índice inflamatorio inicial a 50% o menos. Dentro de this categoría encontramos 6 compuestos pertenecientes a la clase farmacológica de la no-esteroides anti-inflamatorios no esteroideos (AINE), lo que confirma la validez de nuestro enfoque. Sin embargo, los AINE no clasificado entre los más potentes fármacos antiinflamatorios. Aparte de los AINE se encuentran varias clases adicionales de drogas farmacológicas como, por ejemplo, los bloqueadores de los receptores de angiotensina (ARA II), antibióticos e inhibidores de la bomba de protones. 7 compuestos cumplieron con los criterios mínimos definidos empíricamente para los potenciales resolución a favor de las drogas. 18 drogas que ejerce un efecto proinflamatorio, lo que resulta en el reclutamiento de leucocitos exagerada a neuromastos lesionados en comparación con los controles positivos. Sólo dos compuestos impedido la resolución oportuna de la respuesta inflamatoria. El efecto antiinflamatorio de los candidatos afectados varios (candidatos ejemplares desde arriba mencionadas clases de medicamentos farmacológicos) de la pantalla del piloto de could ser confirmada de manera dosis-dependiente en los sucesivos ensayos de Chin secundarias (datos no mostrados). Una segunda prueba de 4 potenciales resolución a favor de las drogas no ha confirmado el modo indicado de acción como ejercida en la pantalla principal. 2 de los fármacos tenían un ligero potencial anti-inflamatorio en concentraciones más altas (20 mM). Un tercer fármaco mostraron una marginal no dependiente de la dosis efecto anti-inflamatorio en concentraciones de fármaco que van desde 5 hasta 20 mM. El cuarto fármaco no tuvo efecto sobre la respuesta inflamatoria a las concentraciones ensayadas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig1.jpg" /> Figura 1. Flujo de trabajo de la prueba de la barbilla. Individual compuesto de transgénicos cldnB :: GFP / lysC :: DsRed2 larvas (3 DPF) se distribuyen manualmente en placas de microtitulación de 384 pocillos. Las drogas se añadieron simultáneamente a cada pocillo utilizando una estación de trabajo compacta Zephyr manejo de líquidos. Las placas de ensayo se incuban a continuación durante 1 hora a 29 ° C. El tratamiento con CuSO 4 </sub&gt; - Solución (10 mM de concentración final) durante 1 h inflige las heridas e inicia una respuesta inflamatoria aguda. Por último, la solución de cobre y las drogas son lavados y la adquisición automática de imágenes se inicia (90 minutos después del tratamiento del cobre inicial). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig2.jpg" /> Figura 2. . Vista general del cuadro de imágenes en bruto La figura muestra las imágenes en bruto de 4 planos focales (Z = 0 - 3) a distancias de 50 m en los canales de Cy3 (izquierda) y las buenas prácticas agrarias (derecha), respectivamente. Las flechas (Z = 1,2) indican neuromastos ejemplares, puntas de flecha (Z = 1,2) apuntan a los leucocitos agrupados en torno a neuromastos. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig3.jpg" /> Figura 3. Mapas de la inflamación (IMAPS) El éxito de los experimentos individuales pueden ser evaluadas en imaps que reflejan la respuesta inflamatoria (datos brutos) en un código de colores: verde brillante. Refleja una inflación inicial alta<html> la respuesta involucrados en procesos inflamatorios, el negro indica que no hay inflamación en el punto de tiempo imaps 0 (izquierda) y el tiempo-el punto 5 (derecha) indican claramente si un experimento se debe incluir en la información adicional.. Controles de cobre (fila 13 y 24) se muestran en diferentes tonos de verde, mientras que el control de los pozos de DMSO (fila 1 y 12) aparecen en color verde oscuro o negro. A la hora del punto 5, la inflamación está casi resuelto en los controles de cobre, ahora se indica en tonos oscuros de verde o negro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4203/4203fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig4.jpg" /> Figura 4. 2-D característica gráfica de espacio de 320 compuestos de un FDA aprobó la biblioteca y sus respectivos controles. Todos los pozos compuestos se pueden mostrar en una gráfica característica de 2-D el espacio sobre la base de los parámetros de un 0 y un 1, que surgen de una relación no lineal regresión de ajuste (d/4203/4203eq1.jpg &quot;alt =&quot; Ecuación 1 &quot;/&gt;) hacia la inflamación inicial. Esta parcela espacio de características permite la identificación automática de los candidatos interesantes que pertenecen a uno de los siguientes 4 inmuno-moduladores categorías que pueden ser indicativos de las drogas &#39;modo de acción:. anti-inflamatorio (1), anti-resolución (2), pro-inflamatorias (3) y en favor de la resolución (4) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4203/4203fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> .

<ol><li>Peterson, R. T., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+use+of+small+molecules+for+probing+biological+processes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Discovery and use of small molecules for probing biological processes in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 76, (2004).</li>
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<li>Luetjohann, D. S., Shah, A. H., Christen, M. P., Richter, F., Knese, K., Liebel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sciencenet%27+-+towards+a+global+search+and+share+engine+for+all+scientific+knowledge%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Sciencenet' - towards a global search and share engine for all scientific knowledge.</a> Bioinformatics. 27, 1734-1735 (2011).</li>
<li>Liebel, U., Kindler, B., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvester%27%3A+a+fast+meta+search+engine+of+human+protein+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Harvester': a fast meta search engine of human protein resources.</a> Bioinformatics. 20, 1962-1963 (2004).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

<p class="jove_content"&gt; A continuación les presentamos un sistema totalmente automatizado de alto rendimiento de estrategia de cribado que permita la identificación de compuestos moduladores de la inmunidad en un contexto animal. Lo que permite el seguimiento de una respuesta inflamatoria aguda<em&gt; En vivo</em&gt; Y en tiempo real.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Ofrecemos un protocolo para aplicar el pez cebra como modelo útil para el descubrimiento de fármacos o drogas esfuerzos replanteamiento, ya que los efectos del fármaco sobre el reclutamiento de leucocitos a las heridas pueden ser estudiados con relativa facilidad en el contexto de un completo y funcional del sistema inmune innato. La única ventaja de nuestro enfoque es el hecho de que la herida química hace que la manipulación manual de las larvas obsoleto, lo que permite la automatización y detección en un formato de alto rendimiento.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Por otra parte, efectos adversos del fármaco o tóxico, así como fuertes efectos fuera del objetivo pueden ser fácilmente evaluados con la propuesta de puesta en marcha. La biblioteca aprobado por la FDA sin embargo, no contiene compuestos tóxicos a las concentraciones de cribado. Sin embargo, se propone para el aparentes compuestos tóxicos para comparar el conjunto de datos disponibles (por ejemplo, el fenotipo modulador inmune, la concentración de fármaco) entre los miembros de la misma clase de sustancias farmacológicas presentes en la biblioteca de la prueba. Miembros tóxicos de una familia de sustancias, que de otra forma ejerce un fenotipo prometedor modulador inmune, podría ser sometido a prueba con concentraciones más bajas, si es necesario.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Hemos demostrado la posibilidad de clasificar las drogas de forma automática de acuerdo a su sistema inmune modulador que ejerce efecto. Las drogas que pertenecen a la categoría de compuestos anti-inflamatorios puede ser validado en experimentos independientes, la mayoría de los compuestos que ejercen su efecto de manera dosis-dependiente. Cuatro compuestos identificados como potenciales resolución pro-fármacos así podría no lejos se confirmó como tal. Asimismo, indica que esta categoría especial modulador inmune es difícil de describir, ya que no sólo afectan a las drogas de resolución hasta la fecha han sido descritos en la literatura. Sin embargo, 3 de los 4 medicamentos reanalizada mostró una tendencia anti-inflamatorio en altas concentraciones molares. La optimización de los criterios mínimos definidos empíricamente debería ayudar a reducir el número de falsos positivos.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Además, la técnica presentada ofrece la posibilidad de ser utilizados para la identificación de las mutaciones en los genes que afectan al comportamiento migratorio de leucocitos<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; En conclusión, el método propuesto puede facilitar y acelerar el descubrimiento de fármacos o drogas reutilización de los esfuerzos de obtención de potenciales estructuras de plomo nuevas con la información disponible sobre la tolerancia a las drogas, la toxicidad, la dosis, así como los posibles efectos off-target. Por lo tanto, servir como una estrategia sencilla, económica y ahorro de tiempo en las primeras etapas de desarrollo de fármacos.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Sulfóxido de dimetilo </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co KG </td><td> A994.2 </td><td></td></tr><tr><td> Cobre (II) sulfato anhidro </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co KG </td><td> PO23.1 </td><td></td></tr><tr><td> Aprobado por la FDA biblioteca de drogas </td><td> Enzo Ciencias de la Vida </td><td> BML-2841-0100 </td><td></td></tr><tr><td> 384 placas de micropocillos no vinculante, μClear </td><td> Greiner </td><td> 781906 </td><td> negro </td></tr><tr><td> Olympus exploración R ^ </td><td> Olimpo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zephyr Liquid Compact Manejo de estación de trabajo </td><td> Caliper </td><td></td><td></td></tr></tbody>
 </table>

facilitar el descubrimiento de fármacos: un sistema automatizado de alta el contenido del ensayo la inflamación en el pez cebra

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Larvas de pez cebra son particularmente susceptibles de animal entero pequeña molécula 1,2 pantallas debido a su pequeño tamaño y relativa facilidad de manipulación y observación, así como el hecho de que los compuestos simplemente se puede añadir al agua de baño y se absorben fácilmente cuando se administra en una &lt;1% de DMSO solución. Debido a la claridad óptica de las larvas de pez cebra y la disponibilidad de las líneas transgénicas que expresan proteínas fluorescentes en los leucocitos, el pez cebra ofrece la ventaja única de seguimiento de una respuesta inflamatoria aguda in vivo. En consecuencia, utilizando el pez cebra de alta contenido pantallas pequeñas moléculas destinadas a la identificación de compuestos inmuno-moduladores con un alto rendimiento se ha propuesto 3-6, lo que sugiere escenarios inflamación de inducción, por ejemplo, muescas localizadas en el tejido de la aleta, el daño láser dirigido a la superficie de la yema embriones de 7 o amputación tailfin 3,5,6. El principal inconveniente de estos métodos sin embargo fueel requisito de la manipulación manual de larvas para inducir la herida, evitando así la selección de alto rendimiento. Introducción de la inflamación inducida químicamente (Chin) ensayo de ocho eliminados estos obstáculos. Desde que se inflige heridas químicamente el número de embriones que pueden ser tratados al mismo tiempo es virtualmente ilimitada. El tratamiento temporal de larvas de pez cebra con sulfato de cobre induce selectivamente la muerte celular en las células ciliadas del sistema de línea lateral y los resultados en la contratación rápida de granulocitos a neuromastos heridos. La respuesta inflamatoria se puede seguir en tiempo real mediante el uso de compuestos transgénicos cldnB :: GFP / lysC :: DsRed2 6,9 larvas de pez cebra que expresan una proteína verde fluorescente en las células neuromast, así como una roja granulocitos fluorescentes etiquetado de proteínas. Con el fin de diseñar una estrategia de cribado que permita a los dos análisis de alto contenido y de alto rendimiento se introdujo el manejo robótico de líquido y micr automatizado combinadooscopy con un guión de software a medida desarrollado. Este script permite la cuantificación automática de la respuesta inflamatoria al anotar el porcentaje de área ocupada por los leucocitos de color rojo fluorescente dentro de un área definida empíricamente que rodea heridos neuromastos fluorescentes verdes. Además, el procesamiento automatizado de datos, el manejo, visualización y almacenamiento de todos ellos basados ​​en la costumbre desarrollada MATLAB y scripts de Python. En resumen, presentamos un sistema automatizado de HC / HT pantalla que permite realizar pruebas de compuestos químicos por su efecto sobre la iniciación, progresión o resolución de una respuesta inflamatoria granulocítica. Este protocolo sirve un buen punto de partida para más análisis en profundidad de los mecanismos de drogas y rutas implicadas en la orquestación de la respuesta inmune innata. En el futuro, puede ayudar a identificar los intolerables efectos tóxicos o desviado-en las primeras fases de descubrimiento de fármacos y por lo tanto reducir los riesgos del procedimiento y los costes de desarrollo de fármacos.

Aquí se describe una novela de alto contenido de ensayo de la inflamación inducida químicamente con miras a la identificación de moduladores bioactivos inmune. Hemos combinado con éxito con la microscopía automatizada de scripts de software desarrollado que permite la cuantificación automática de la respuesta inflamatoria, así como el procesamiento de datos aún más, el análisis, la minería, y el almacenamiento.

Facilitar el descubrimiento de fármacos: Un sistema automatizado de alta el contenido del ensayo La inflamación en el pez cebra

Las larvas de pez cebra son particularmente adecuadas para el cribado de moléculas pequeñas en animales completos1,2 debido a su pequeño tamaño y a la relativa facilidad de manipulación y ...

El objetivo general de este procedimiento es realizar una cribado fenotípico para identificar la actividad inmunomoduladora de compuestos mediante un ensayo de inflamación en pez cebra in vivo. Esto se logra primero distribuyendo larvas de pez cebra en una placa de 384 pozos; a continuación, se añaden los compuestos que se van a cribar a las larvas para permitir la penetración en los tejidos.Luego se añade una solución de sulfato de cobre para inducir daño específico en el tejido. Finalmente, los compuestos y el sulfato de cobre se reemplazan por medio fresco. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el grado de afluencia específica de leucocitos al tejido a lo largo del tiempo mediante el análisis de datos de microscopía en vivo en tiempo real.La principal ventaja de esta técnica es que permite la inducción simultánea de inflamación en cientos de individuos y, por lo tanto, posibilita la automatización experimental y analítica. La demostración del procedimiento estará a cargo de Christina Whitman, estudiante de doctorado de mi laboratorio, para el ensayo de la barbilla. Realice apareamientos por grupos entre peces doble transgénicos homocigotos y peces AB de tipo silvestre, recolecte embriones mediante desove natural y críe de 50 a 70 por placa en medio E3 a 29 grados Celsius hasta tres días después de la fertilización.Revise todas las larvas bajo un estereoscopio fluorescente para detectar la expresión del reportero fluorescente, la inflamación espontánea y el desarrollo adecuado según la edad. Después de preparar el medio de tamizado y añadir 20 microlitros a los pocillos de una placa de 384 pocillos, transfiera una sola larva anestesiada en 74 microlitros de medio a cada pocillo. Utilice una punta de pipeta cortada hasta un tamaño de orificio de dos milímetros con una punta de micropipeta flexible.Oriente la larva en posición lateral dentro del pocillo. Realice todos los siguientes pasos de manipulación de líquidos con una estación de trabajo robótica de manipulación de líquidos para asegurar el tratamiento simultáneo de todas las larvas para la administración del fármaco. Pipetee hacia arriba y hacia abajo cinco veces para mezclar los compuestos en una placa de reserva de fármaco. Añada 16 microlitros de la placa de reserva de fármaco 7,5 x a la placa de cribado y mezcle cinco veces a 10 microlitros por segundo.Cubra la placa de tamizaje con papel de aluminio e incúbela durante una hora a 29 grados Celsius para inducir una herida química. Añada 10 microlitros de la solución de trabajo de sulfato de cobre 120 micromolar a cada una.Se acepta la mezcla de controles negativos cuatro veces e incubar nuevamente durante una hora a 29 grados Celsius. Lavar los embriones eliminando e intercambiando 80 microlitros de medio de cada pocillo dos veces, comenzando a los 90 minutos. Después del tratamiento inicial con cobre, adquirir imágenes en un microscopio automático invertido utilizando un objetivo Forex.Establezca el nivel Z inicial de modo que se visualice la masa neural de las líneas laterales posteriores derecha e izquierda, e image cada pocillo una vez por hora. Utilice el canal de campo claro tres y el canal GFP en cuatro planos focales. El software personalizado de vista de laboratorio crea imágenes de enfoque extendido a partir de cuatro planos focales para cada uno de los canales.Las imágenes se combinan luego para crear una imagen final superpuesta en RGB. Una herramienta de reconocimiento de patrones identifica neuromas dentro de las imágenes superpuestas en RGB y crea un área de interés definida empíricamente alrededor de los neuromas; los leucocitos fluorescentes rojos que rodean los neuromas lesionados se cuantifican, obteniendo como lectura principal el porcentaje de área ocupada por leucocitos o pálida. En promedio, se detecta adecuadamente al 95 % de las larvas, las cuales pueden posteriormente someterse a un procesamiento adicional de datos.El éxito de los experimentos individuales se evalúa utilizando mapas de inflamación o mapas oculares. Los datos pálidos se codifican con color verde brillante, que representa un índice inflamatorio inicial alto, y el negro indica ausencia de inflamación. Esta visión general rápida permite identificar de inmediato los experimentos fallidos, los cuales pueden excluirse entonces del análisis posterior de datos.iMaps en los tiempos 0,0 y 0,5 muestran claramente si un experimento debe incluirse en el procesamiento posterior de datos. Los controles de cobre aparecen en distintos tonos de verde, mientras que los pocillos de control con DMSO se observan en verde oscuro o negro en el tiempo 0,5. La inflamación está casi resuelta en los controles de cobre, que ahora se indican en tonos oscuros de verde o negro para procesar los controles.Se promedian los 32 replicados de control y se calcula la desviación estándar. Solo se incluyen los puntos de datos dentro de dos desviaciones estándar. El valor promedio del control negativo DMSO se establece en cero y el valor promedio más alto de PAOL para el control de cobre se establece en uno; el PAOL de cada compuesto se interpola o extrapola linealmente respecto a los controles correspondientes en la placa experimental.Los datos brutos normalizados procedentes de experimentos replicados se promedian, produciendo una lectura final: el índice inflamatorio debido a la resolución de la inflamación. Con el tiempo, se realiza un ajuste de regresión no lineal exponencial monótona hacia la inflamación inicial. Utilizando esta fórmula, donde un cero representa la medida de la respuesta inicial en el tiempo igual a cero y un uno se relaciona con la pendiente de la magnitud a lo largo del tiempo para generar el espacio de características, se aplica una regresión no lineal y un análisis de agrupamiento divide el espacio de características en regiones características, permitiendo así la identificación automatizada de candidatos interesantes de diferentes categorías inmunomoduladoras.Todos los parámetros se muestran en el gráfico 2D basado en los parámetros ACE de cero y ace de uno. Las rutinas de manejo de datos crean páginas web que proporcionan una visión general rápida de los resultados, así como una vista detallada solicitada por el usuario. También se integran enlaces simbólicos a otras bases de datos heterogéneas, biológicas y químicas relevantes para ofrecer un recurso valioso para estudios comparativos y novedosos mediante estas rutinas.Se establecieron normas adecuadas de datos e información meta para el almacenamiento a largo plazo de estos datos en una pantalla piloto; se realizó un análisis en una biblioteca de 640 compuestos bioactivos conocidos aprobados por la FDA, para evaluar su efecto sobre la iniciación, progresión o resolución de una respuesta inflamatoria granulocítica. Con base en los efectos observados, se clasificaron cuatro tipos de fenotipos inmunomoduladores que podrían indicar diferentes mecanismos de acción: antiinflamatorio, anti-resolución, proinflamatorio y pro-resolución. 45 de los 640 compuestos ejercieron efectos antiinflamatorios significativos al reducir el índice inflamatorio inicial a 50 % o menos.Dentro de esta categoría, se identificaron seis compuestos que pertenecen a la clase farmacológica de fármacos antiinflamatorios auténticos. Para confirmar la validez de este enfoque, tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo la selección fenotípica in vivo para la actividad de compuestos inmunomoduladores puede automatizarse en gran medida, lo que permite tanto la adquisición como el análisis consistentes de datos en un contexto de animal completo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Se presenta el desarrollo de un sistema automatizado de imágenes y análisis de pez cebra embriones transgénicos en placas de pocillos múltiples. Esto demuestra la capacidad de medir los efectos dependientes de la dosis de una molécula pequeña, BCI, el crecimiento de fibroblastos la expresión del gen del factor periodista y suministrar tecnología para el establecimiento de alto rendimiento de las pantallas de química de pez cebra.

Desarrollo de la imagen y el análisis automatizado de pantallas de química de pez cebra.

Nuestro laboratorio ha desarrollado un sistema automatizado de imágenes de alto rendimiento novedoso que es útil para la detección de varios comportamientos diferentes en-7 días de edad, las larvas de pez cebra. El sistema se puede utilizar para detectar cambios sutiles en el comportamiento después de las larvas han sido expuestos a sustancias tóxicas ambientales o productos farmacéuticos.

Automatizados análisis de comportamiento de alto rendimiento en larvas de pez cebra

Este artículo describe la tubería de vídeo de alto rendimiento que se ha establecido con éxito para infectar y analizar un gran número de embriones de pez cebra que proporcionan una nueva herramienta potente para las pruebas de compuesto y el descubrimiento de fármacos usando todo un organismo animal vertebrado.

Establecimiento y Optimización de una instalación de alto rendimiento para el Estudio<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Y<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; La infección como modelo para el descubrimiento de fármacos

El pez cebra es un organismo experimental excelente para estudiar los procesos de desarrollo de vertebrados y la enfermedad humana modelo. A continuación, describimos un protocolo sobre cómo realizar una pantalla manual de alto rendimiento químico en embriones de pez cebra con todo el montaje hibridación in situ (ojalá) de lectura.

Un manual de la pantalla pequeña molécula Acercarse De Alto Rendimiento Utilizando embriones de pez cebra

El protocolo describe intubating pez cebra adulto con un biológico; disección y preparación del intestino para microscopía confocal, citometría y qPCR. Este método permite la administración de compuestos bioactivos para controlar la absorción intestinal y el estímulo inmunológico local evocada. Es relevante para la dinámica intestinal de profilaxis orales de la prueba.

Intubación por vía oral de pez cebra adulto: un modelo para evaluar la absorción Intestinal de compuestos bioactivos

El objetivo de este protocolo es medir el tiempo de tránsito de fluorescencia etiquetada alimentos a través del intestino del pez cebra larval en forma de alto rendimiento.

Medida de alto rendimiento de tiempo de tránsito intestinal utilizando larvas peces cebra

Aquí, presentamos un protocolo para la detección de proteínas mediadas por anticuerpos fluorescentes en preparaciones enteras de embriones y larvas de peces cebra.

Inmunohistoquímica de montaje completo en embriones y larvas de pez cebra

Los modelos de xenoinjerto de pez cebra permiten la detección de fármacos de alto rendimiento y la toma de imágenes fluorescentes de células cancerosas humanas en un microambiente in vivo. Desarrollamos un flujo de trabajo para la detección automatizada de fármacos a gran escala en muestras de leucemia derivadas del paciente en peces cebra utilizando una unidad de imágenes automatizada equipada con microscopio de fluorescencia.

Examen de drogas de xenoinjertos de tumores derivados del paciente primario en peces cebra

Aquí, presentamos un protocolo detallado para la implantación automatizada de xenoinjertos tumorales en larvas de pez cebra utilizando un sistema de inyección robótica de última generación. Además, presentamos videos de inyección y datos de validación que demuestran el rendimiento exitoso del sistema.

Automatización de la implantación de tumores en larvas de pez cebra para la investigación y la medicina del cáncer

La analítica visual (AV) es un nuevo enfoque de análisis de datos de forma interactiva. En este video, se discute el problema de la sobrecarga de datos causada por experimentos de alto rendimiento biológico y proponer VA como una solución a tal problema. El video muestra el análisis dentro y entre los conjuntos de datos inmunológicos utilizando una herramienta llamada Tableau VA.

Facilitar el análisis de los datos inmunológicos con Visual técnicas analíticas

Aprende a realizar cribado fenotípico de alta capacidad para identificar compuestos inmunomoduladores utilizando larvas de pez cebra. Este método automatizado permite cuantificar respuestas inflamatorias mediante microscopía en tiempo real.

Facilitar el descubrimiento de fármacos: Un sistema automatizado de alta el contenido del ensayo La inflamación en el pez cebra

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