Name: Respuestas imágenes de calcio en las neuronas GFP-etiquetados de hipotalámicas rodajas de cerebro de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Aprende a monitorizar respuestas de calcio en neuronas GFP marcadas en rodajas de cerebro de ratón usando un indicador rojo no verde. Este método permite el análisis espacial y temporal de señales de calcio mediante microscopía confocal.

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Agradecemos a nuestros colegas que participaron en el trabajo resumido aquí. Este trabajo fue apoyado por becas de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 894), «Análisis Integral del olfato &#39;la DFG Schwerpunktprogramm 1392 y por la Fundación Volkswagen (TLZ). TLZ es profesor Lichtenberg de la Fundación Volkswagen.

<ol><li>Almholt, K., Arkhammar, P. O., Thastrup, O., Tullin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+the+translocation+of+protein+kinase+Calpha-green+fluorescent+protein+hybrids+and+intracellular+calcium+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of the translocation of protein kinase Calpha-green fluorescent protein hybrids and intracellular calcium concentrations.</a> Biochem. J. 337 (Pt 2), 211-218 (1999).</li>
<li>Bolsover, S., Ibrahim, O., O'Luanaigh, N., Williams, H., Cockcroft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorescent+Ca2%2B+dyes+with+green+fluorescent+protein+and+its+variants%3A+problems+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Use of fluorescent Ca2+ dyes with green fluorescent protein and its variants: problems and solutions.</a> Biochem. J. 356, 345-352 (2001).</li>
<li>Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+requirements+for+the+activation+of+vomeronasal+sensory+neurons+by+MHC+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides.</a> Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).</li>
<li>Wen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+identification+of+GnRH+receptor+neurons%3A+a+new+model+for+studying+neural+circuits+underlying+reproductive+physiology+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Genetic identification of GnRH receptor neurons: a new model for studying neural circuits underlying reproductive physiology in the mouse brain.</a> Endocrinology. 152, 1515-1526 (2011).</li>
<li>Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+pancreatic+beta-cells+in+the+intact+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, E1041-E1047 (2006).</li>
<li>Doherty, A. J., Coutinho, V., Collingridge, G. L., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+internalization+and+surface+expression+of+a+functional%2C+fluorescently+tagged+G-protein-coupled+glutamate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Rapid internalization and surface expression of a functional, fluorescently tagged G-protein-coupled glutamate receptor.</a> Biochem. J. 341 (Pt 2), 415-422 (1999).</li>
<li>Kurebayashi, N., Harkins, A. B., Baylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fura+red+as+an+intracellular+calcium+indicator+in+frog+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Use of fura red as an intracellular calcium indicator in frog skeletal muscle fibers.</a> Biophys. J. 64, 1934-1960 (1993).</li>
<li>Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadotropin-releasing+hormone+modifies+action+potential+generation+in+sheep+pars+distalis+gonadotropes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Gonadotropin-releasing hormone modifies action potential generation in sheep pars distalis gonadotropes.</a> Neuroendocrinology. 58, 646-654 (1993).</li>
<li>Leinders-Zufall, T. Technique for setting up the perfusion of a recording chamber for physiological studies with cultured and acutely dissociated cells. , Avaliable from: 
	 <a target="_blank" href="
	http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/perfusion_strategies.pdf">
	http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/perfusion_strategies.pdf</a> (1998).</li>
<li>Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+noninvasive+intracellular+pH+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator.</a> Biophys. J. 74, 1591-1599 (1998).</li>
<li>Wen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+genetically+labeled+gonadotropes%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of genetically labeled gonadotropes.</a> Endocrinology. 149, 2701-2711 (2008).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , 2nd edn, Academic Press. (2001).</li>
<li>Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+pheromones+to+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">From pheromones to behavior.</a> Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).</li>
<li>Kelliher, K. R., Wersinger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+regulation+of+the+sexual+behavior+and+reproductive+physiology+of+the+laboratory+mouse%3A+effects+and+neural+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Olfactory regulation of the sexual behavior and reproductive physiology of the laboratory mouse: effects and neural mechanisms.</a> ILAR J. 50, 28-42 (2009).</li>
<li>Yoon, H., Enquist, L. W., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+inputs+to+hypothalamic+neurons+controlling+reproduction+and+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Olfactory inputs to hypothalamic neurons controlling reproduction and fertility.</a> Cell. 123, 669-682 (2005).</li>
<li>Boehm, U., Zou, Z., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+loops+link+odor+and+pheromone+signaling+with+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Feedback loops link odor and pheromone signaling with reproduction.</a> Cell. 123, 683-695 (2005).</li>
<li>Wilson, J. M., Dombeck, D. A., Diaz-Rios, M., Harris-Warrick, R. M., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+network+activity+in+XFP-expressing+neurons+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of network activity in XFP-expressing neurons in the mouse.</a> J. Neurophysiol. 97, 3118-3125 (2007).</li>
<li>Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+near-atmospheric+concentrations+of+CO2+by+an+olfactory+subsystem+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Detection of near-atmospheric concentrations of CO2 by an olfactory subsystem in the mouse.</a> Science. 317, 953-957 (2007).</li>
<li>Perez, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+receptor+potential+channel+expressed+in+taste+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells.</a> Nat. Neurosci. 5, 1169-1176 (2002).</li>
<li>Trollinger, D. R., Cascio, W. E., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+loading+of+Rhod+2+into+mitochondria+shows+mitochondrial+Ca2%2B+transients+during+the+contractile+cycle+in+adult+rabbit+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Selective loading of Rhod 2 into mitochondria shows mitochondrial Ca2+ transients during the contractile cycle in adult rabbit cardiac myocytes.</a> Biochem Biophys. Res. Commun. 236, 738-742 (1997).</li>
<li>Properties of Asante Calcium Red - a novel ratiometric indicator with long excitation wavelength. Meshik, X. A., Hyrc, K. L., Goldberg, M. P. Neuroscience Meeting Planner, , Society for Neuroscience. San Diego, CA. (2010).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Una cuestión importante de la neurociencia es comprender cómo el cerebro procesa la información social. Una fuente principal de información necesaria para el reconocimiento social está codificada mediante señales olfatorias o feromonas. La detección de estas señales por poblaciones neuronales en la nariz y el reconocimiento de las señales en el cerebro, especialmente el hipotálamo, juegan un papel clave en muchos procesos sociales y hormonas y otros factores de influencia neuroendocrinos 13-16. Un obstáculo e...

There was a typo in the abstract of <a href="http://www.jove.com/video/4213">Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices</a>.

Erratum: Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Cat. N ° </td></tr><tr><td> Agar </td><td> Sigma </td><td> A1296 </td></tr><tr><td> Fura-red/AM </td><td> Invitrogen </td><td> F-3021 </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Sigma </td><td> P2443 </td></tr><tr><td> Sulfóxido de dimetilo </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP231 </td></tr><tr><td> Vibrante-Blade Micrótomo Hyrax V 50 </td><td> Zeiss </td><td> 9770170 </td></tr><tr><td> Dispositivo de enfriamiento CU 65 para Micrótomo Hyrax V 50 </td><td> Zeiss </td><td> 9920120 </td></tr><tr><td> O 2 / CO 2 incubadora, CB210-UL </td><td> Carpeta </td><td> 0019389 </td></tr><tr><td> Super Glue, Loctite 406TM </td><td> Henckel </td><td> 142580 </td></tr><tr><td> Espátulas dobles, forma de cuchara </td><td>Bochem </td><td> 3182 </td></tr><tr><td> Espátulas, forma cuchara Microspoon </td><td> Bochem </td><td> 3344 </td></tr><tr><td> Tijeras de primavera, Moria-Vannas-Wolff - Hojas 7mm </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 15370-52 </td></tr><tr><td> Tijeras Vannas - Primavera, Hojas 3mm </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 15000-00 </td></tr><tr><td> Tijeras Wagner </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 14071-12 </td></tr><tr><td> Medical Forceps, 7b Dumont </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 11270-20 </td></tr><tr><td> Gran cámara rectangular Open Bath (RC-27) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0238 </td></tr><tr><td> Microscopio Confocal Resplandor BioRad 2100 </td><td> Zeiss </td><td> na </td></tr></tbody></table>

respuestas imágenes de calcio en las neuronas gfp-etiquetados de hipotalámicas rodajas de cerebro de ratón

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

A pesar de un aumento enorme en nuestro conocimiento sobre los mecanismos subyacentes a la codificación de la información en el cerebro, una cuestión fundamental en relación con los pasos precisos molecular, así como la actividad de neuronas específicas en multi-funcional núcleos de áreas del cerebro tales como el hipotálamo permanecer. Este problema se incluye la identificación de los componentes moleculares implicados en la regulación de diversas neurohormonas cascadas de transducción de señales. Las elevaciones de Ca 2 + intracelular desempeñan un papel importante en la regulación de la sensibilidad de las neuronas, tanto en el nivel de transducción de señales y en los sitios sinápticos. Han surgido nuevas herramientas para ayudar a identificar las neuronas en la miríada de neuronas cerebrales mediante la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control de un promotor particular. Para supervisar tanto espacial como temporalmente estímulo inducido por Ca 2 + respuestas en GFP-etiquetados neuronas, un no-verde fluorescente Ca 2 + colorante indicador nEEDS para ser utilizado. Además, la microscopía confocal es un método preferido de formación de imágenes de las neuronas individuales en rodajas de tejido debido a su capacidad para visualizar las neuronas en distintos planos de profundidad dentro del tejido y para limitar fuera de foco de fluorescencia. El ratiométrica Ca 2 + indicador fura-2 se ha utilizado en combinación con GFP-etiquetados neuronas 1. Sin embargo, el colorante es excitado por la luz ultravioleta (UV). El coste del láser y la limitada profundidad de penetración óptica de la luz UV impedido su uso en muchos laboratorios. Además, la fluorescencia de GFP puede interferir con las señales de fura-2 2. Por lo tanto, se decidió utilizar un color rojo fluorescente Ca 2 + colorante indicador. El cambio Strokes enorme de fura-rojo multicolor permite el análisis de la fluorescencia de color rojo en combinación con GFP usando una longitud de onda de excitación única. Hemos tenido resultados buenos previamente utilizando fura-rojo en combinación con GFP-etiquetados neuronas olfativas 3. Los protocolos para cortes de tejido olfativo parecía funcionar equally bien en las neuronas hipotalámicas 4. Fura-red basada Ca 2 + de imágenes también fue combinado con éxito con GFP-etiquetados β pancreáticas y células GFP-etiquetados receptores expresados ​​en células HEK 5,6. Una peculiaridad de fura-red es que la intensidad de fluorescencia a 650 nm disminuye una vez que el indicador se une al calcio 7. Por lo tanto, la fluorescencia de las neuronas en reposo con baja concentración de Ca 2 + tiene una intensidad relativamente alta. Cabe señalar, que los otros rojos Ca 2 +-indicador tintes existen o se están desarrollando, que podría dar mejores resultados o mejores en las neuronas y áreas diferentes del cerebro.

En este protocolo, actualizamos los recientes avances en imágenes Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Señales de neuronas GFP-etiquetados en cortes de tejido cerebral con un rojo fluorescente Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Indicador de tinte.

Respuestas imágenes de calcio en las neuronas GFP-etiquetados de hipotalámicas rodajas de cerebro de ratón

A pesar del enorme incremento en nuestro conocimiento sobre los mecanismos que subyacen a la codificación de la información en el cerebro, una pregunta central relativa a la ...

El objetivo general de este procedimiento es monitorear las respuestas de calcio inducidas por un estímulo, tanto en neuronas marcadas con GFP como espacial y temporalmente, en cortes de cerebro mediante un colorante fluorescente de calcio no verde. Esto se logra primero extrayendo el cerebro de un ratón transgénico que expresa GFP en células específicas. El segundo paso consiste en preparar cortes de tejido con un microtomo.A continuación, se pipetea la solución de carga del colorante indicador de calcio sobre las secciones para permitir que las células cerebrales absorban el colorante. El paso final consiste en realizar una grabación con marca de tiempo de las células fluorescentes mediante microscopía confocal. En última instancia, las respuestas de calcio en neuronas marcadas con GFP se muestran utilizando un análisis de imágenes de calcio multicolor.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes de microscopía confocal es que podemos visualizar el calcio en neuronas verdes fluorescentes GFP mediante un colorante fluorescente de calcio desplazado hacia el rojo. El gran desplazamiento hacia el rojo permite realizar un análisis multicolor de la fluorescencia

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

El órgano vomeronasal (VNO) detecta señales químicas intraspecíficas que transmiten información social y reproductiva. Hemos realizado experimentos de imagen de Ca2+ utilizando ratones transgénicos que expresan G-CaMP2 en el tejido del VNO. Este enfoque nos permite analizar los complejos patrones de respuesta de las neuronas vomeronasales frente a un gran número de estímulos de feromonas.

Las respuestas de imagen neuronal en los preparativos de la rebanada del órgano vomeronasal Expresando un sensor de calcio genéticamente codificados

Source: Bancroft, E. A., et al. Cuantificación Espontánea Ca2+ Flujos y sus efectos posteriores en las neuronas primarias del mesencéfalo de ratón. J. Vis. Exp. (2020) &lt;p style='line-height:1.2;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;' dir='ltr'&gt;Este video demuestra la visualización en tiempo real de la afluencia de calcio en las neuronas ventrales del mesencéfalo derivadas de embriones de ratón. Utilizando un vector viral para expresar un indicador de calcio, las neuronas se visualizan bajo un...

Visualización de la afluencia de calcio en las neuronas ventrales del mesencéfalo derivadas de embriones de ratón

Se describe un procedimiento experimental para medir la actividad neuronal a través de dos ventanas ópticas arriba bilateral corticies somatosensorial primaria (S1) en Thy1-GCaMP6s de ratones transgénicos usando fotones 2 (2P) microscopia en vivo.

Imágenes de la actividad neuronal en la corteza somatosensorial primaria usando Thy1-ratones transgénicos GCaMP6s

Se presenta un método que combina grabaciones de celulares-abrazadera del remiendo y la proyección de la imagen de dos fotones para registrar a transitorios de Ca2 + en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro agudo.

Proyección de imagen de calcio de dos fotones en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro

Este protocolo detalla cómo implementar y realizar grabaciones de fotometría multifibra, cómo corregir artefactos independientes del calcio y consideraciones importantes para la toma de imágenes de fotometría de doble color.

Fotometría multifibra para registrar la actividad neuronal en animales en movimiento libre

Aquí presentamos cómo exponer el ganglio geniculado de un ratón de laboratorio vivo y anestesiado y cómo usar imágenes de calcio para medir las respuestas de conjuntos de estas neuronas a los estímulos del sabor, lo que permite múltiples ensayos con diferentes estimulantes. Esto permite comparaciones en profundidad de qué neuronas responden a qué saborantes.

Imágenes de calcio in vivo de las respuestas de las neuronas ganglionares geniculadas de ratón a los estímulos del gusto

Presentamos un protocolo para exponer el médula oblonga del ratón adulto del lado ventral. Mediante el uso de una lente de índice de refracción de gradiente con un microscopio en miniatura, las imágenes de calcio se pueden utilizar para examinar la actividad de los somatas neuronales oliva inferiores in vivo.

In vivo Imágenes de calcio en la aceituna inferior de ratón

Este protocolo describe la exposición quirúrgica del ganglio de la raíz dorsal (GRD) seguida de GCaMP3 (indicador de Ca2+ codificado genéticamente; Proteína fluorescente verde-Calmodulina-M13 Proteína 3) Imagen de Ca2+ de los conjuntos neuronales utilizando ratones Pirt-GCaMP3 mientras se aplica una variedad de estímulos a la pata trasera ipsilateral.

In vivo Imágenes de calcio de conjuntos neuronales en redes de neuronas sensoriales primarias en ganglios intactos de la raíz dorsal

Este protocolo detalla el procedimiento para obtener imágenes de las respuestas de calcio en el colículo superior (SC) de ratones despiertos, incluida la obtención de imágenes de la actividad de una sola neurona con microscopía de dos fotones mientras se deja la corteza intacta en ratones de tipo salvaje, y la obtención de imágenes de todo el SC con microscopía de campo amplio en ratones mutantes de corteza parcial.

Imágenes de calcio en el colículo superior de ratón

El presente protocolo describe imágenes de calcio in vivo para medir las respuestas de conjuntos de neuronas lumbar-6 DRG a estímulos somáticos y viscerales. Se pueden hacer comparaciones exhaustivas entre las neuronas que responden a diferentes estímulos. Este protocolo es valioso para investigar los mecanismos del dolor visceral y la estimulación somática, como la acupuntura.

in vivo Imágenes de calcio de la respuesta de las neuronas de los ganglios de la raíz dorsal a estímulos somáticos y viscerales

Este protocolo describe imágenes de calcio GCaMP in vivo de neuronas intactas del ganglio trigémino (TG). Esta descripción incluye cirugía de exposición TG, imágenes de microscopía confocal in vivo de neuronas TG, aplicación de estímulos somáticos durante imágenes microscópicas de neuronas TG y análisis de datos de imágenes de calcio GCaMP in vivo .

In vivo Imágenes de calcio de conjuntos neuronales en redes de neuronas sensoriales primarias en ganglios del trigémino intactos

Aprende a monitorizar respuestas de calcio en neuronas GFP marcadas en rodajas de cerebro de ratón usando un indicador rojo no verde. Este método permite el análisis espacial y temporal de señales de calcio mediante microscopía confocal.

Respuestas imágenes de calcio en las neuronas GFP-etiquetados de hipotalámicas rodajas de cerebro de ratón

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