Respuestas imágenes de calcio en las neuronas GFP-etiquetados de hipotalámicas rodajas de cerebro de ratón

El objetivo general de este procedimiento es monitorear las respuestas de calcio inducidas por un estímulo, tanto en neuronas marcadas con GFP como espacial y temporalmente, en cortes de cerebro mediante un colorante fluorescente de calcio no verde. Esto se logra primero extrayendo el cerebro de un ratón transgénico que expresa GFP en células específicas. El segundo paso consiste en preparar cortes de tejido con un microtomo.

A continuación, se pipetea la solución de carga del colorante indicador de calcio sobre las secciones para permitir que las células cerebrales absorban el colorante. El paso final consiste en realizar una grabación con marca de tiempo de las células fluorescentes mediante microscopía confocal. En última instancia, las respuestas de calcio en neuronas marcadas con GFP se muestran utilizando un análisis de imágenes de calcio multicolor.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes de microscopía confocal es que podemos visualizar el calcio en neuronas verdes fluorescentes GFP mediante un colorante fluorescente de calcio desplazado hacia el rojo. El gran desplazamiento hacia el rojo permite realizar un análisis multicolor de la fluorescencia roja en combinación con el GFP verde utilizando una única longitud de onda de excitación. Tuvimos la idea inicial de este método cuando nos enfrentamos al problema de monitorear señales de calcio en neuronas que solo podíamos identificar mediante una técnica fluorescente genética, que era la proteína verde fluorescente.

Ahora demostraré varios pasos críticos de este procedimiento. Comience el procedimiento vertiendo la solución de agar caliente en una placa de Petri cuadrada hasta una altura de un centímetro; después de enfriarse y endurecerse, el gel de agar al 4% se corta en bloques de un centímetro cúbico y se coloca en un frasco para su almacenamiento. Después de decapitar al ratón, corte el cuero cabelludo con una hoja de afeitar de filo único en dirección sagital central, desde el hueso frontal hasta la protuberancia occipital externa.

Posteriormente, abra más el corte en el cuero cabelludo primero en dirección lateral rostral. Luego, en dirección ventral. A continuación, realice dos cortes laterales y uno rostral.

En el foramen magno, con una tijera de muelle pequeña, corte cuidadosamente el cráneo. En este momento, los huesos occipital, interparietal y parietal deben separarse. Si aún está presente la duramadre, retírela cuidadosamente con un par de pinzas para evitar dañar el cerebro.

A continuación, retire el hueso escamoso, el foramen etmoidal anterior y el foramen frontal. Ahora el cerebro puede extraerse fácilmente con una espátula cucharilla microinvertida y se pueden seccionar los nervios craneales. El cerebro debe quedar apoyado sobre su cara ventral en una superficie resistente al corte, con la superficie ventral del cerebro hacia abajo.

Utilice una cuchilla de un solo filo para retirar el cerebelo. Esta superficie de corte recta servirá como base para montar el cerebro sobre una placa y permitir el corte de secciones cerebrales coronales. A continuación, pegue el cerebro con la superficie de corte sobre la placa base del microtomo utilizando una pequeña cantidad de adhesivo cianocrilato de alto rendimiento y curado rápido.

Posteriormente, pegue un bloque de gel de agar de un centímetro cúbico en la cara ventral del cerebro sobre la placa base del microtomo para sostener y fijar el cerebro durante el corte. Después de que la unión haya secado, coloque la placa en el baño del microtomo que contiene solución extracelular oxigenada a seis grados Celsius. Luego, corte el cerebro en rebanadas de 300 micrones de grosor con una velocidad de corte baja; se recolectan las secciones coronales del cerebro hasta que todo el cerebro haya sido seccionado.

Ahora prepare una solución al 20% de onic F1 27 en DMSO añadiendo solución de DMSO al polvo de onic F1 27. A continuación, disuélvalo sometiendo directamente la solución a ultrasonidos durante dos minutos. Después, agregue cinco microlitros de la solución al 20% de onic F1 27 a un tubo que contenga 50 microgramos de furred am permeable a células.

Mezcle la solución con una pipeta. Luego, agregue 45 microlitros de solución extracelular a la mezcla y vortexéela. Breve, agregue 325 microlitros adicionales de solución extracelular y someta el tubo a sonicación durante otros tres minutos.

Después de la sonicación, agregue 1.156 mililitros de solución extracelular oxigenada para obtener la solución final de carga con el indicador de calcio D. Transfiera las secciones coronales del cerebro a una placa de cultivo celular de seis pocillos con solución extracelular oxigenada, colocando hasta seis secciones por pocillo. Luego aspire la solución extracelular oxigenada de los pocillos, teniendo cuidado de no dañar las secciones cerebrales.

A continuación, pipetee 750 microlitros de la solución de carga del indicador de calcio D directamente en cada pocillo. Los cortes cerebrales deben quedar cubiertos por la solución que contiene rore am. Después, incube los cortes en el incubador de cultivo celular con oxígeno y dióxido de carbono durante 45 a 60 minutos a 37 grados Celsius.

Al final de la incubación, reemplace la solución de carga del indicador de calcio DI con una solución extracelular oxigenada fresca para evitar la sobrecarga de las células. Para monitorear los cambios inducidos por el estímulo en la señal fluorescente, transfiera una de las secciones cerebrales cargadas con fure rojo a una cámara de registro y colóquela en la posición deseada. Después de montar la cámara en el sistema de microscopía confocal, perfunda la sección durante 10 minutos con solución extracelular oxigenada para eliminar cualquier exceso de colorante del indicador de calcio extracelular.

Después de salir de la cámara de registro, el PERFUSE ocho se recoge en un frasco al vacío. Luego, observe la sección a través del microscopio con aumento bajo. Tome nota de la orientación de la sección y localice el área de interés en la sección; en nuestro caso, el área hipotalámica del cerebro.

A continuación, cambie a alta magnificación. Localice la célula de interés en el corte mediante la adquisición de imágenes GFP y verificando simultáneamente la intensidad de fluorescencia de la señal roja de URA. Ajuste la potencia del láser a un valor que permita medir los cambios en la intensidad de fluorescencia roja de URA y que evite el apagado de los dos fluoróforos.

A continuación, comience a adquirir imágenes a tasas entre 0,5 y dos hercios para recopilar las señales de fure y GFP. Esta figura muestra la imagen confocal de las neuronas GN, RHR Tau GFP en un corte coronal de cerebro. Esta es la señal de fluorescencia relativamente uniforme observada tras cargar el corte de cerebro con fure am, y esta es la imagen fusionada que muestra las neuronas cargadas con el colorante indicador de calcio.

A continuación se muestran ejemplos de respuestas de calcio inducidas por estímulos somáticos en neuronas individuales marcadas con GFP en distintas áreas cerebrales hipotalámicas. Las señales de calcio distintas entre las neuronas que expresan RHR de GN en núcleos hipotalámicos diferentes pueden compararse utilizando el área bajo la curva como una estimación del cambio total de calcio en una célula determinada durante un mismo período. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de 90 minutos, incluyendo la preparación del colorante indicador de calcio, la carga y la incubación de las secciones, si se realiza adecuadamente.