Respuestas imágenes de calcio en las neuronas GFP-etiquetados de hipotalámicas rodajas de cerebro de ratón

El objetivo general de este procedimiento es monitorear las respuestas de calcio inducidas por estímulos, tanto en neuronas marcadas con GFP, espacial como temporalmente en cortes de cerebro utilizando un tinte indicador de calcio fluorescente no verde. Esto se logra extrayendo primero el cerebro de un ratón transgénico que expresa GFP en células específicas. El segundo paso es preparar rodajas de tejido con un micrótomo.

A continuación, la solución de carga de colorante indicador de calcio se pipetea en las rodajas para permitir que las células cerebrales absorban el tinte. El paso final es realizar un registro de marca de tiempo de células fluorescentes mediante microscopía confocal. En última instancia, las respuestas de calcio en las neuronas marcadas con GFP se muestran mediante análisis de imágenes de calcio multicolor.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes de microscopía confocal es que podemos obtener imágenes del calcio en neuronas verdes fluorescentes de tecnología GFP utilizando un troquel indicador de calcio fluorescente desplazado al rojo. El enorme desplazamiento de la carrera de menos rojo nos permite hacer un análisis multicolor de la fluorescencia roja en combinación con la GFP verde utilizando una sola longitud de onda de excitación. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos enfrentamos al problema de monitorear las señales de calcio en las neuronas que solo podíamos identificar usando una tecnología genética fluorescente, que era la proteína de fluorescencia verde.

A continuación demostraré varios pasos críticos de este procedimiento. Comience el procedimiento vertiendo la solución de agar calentada en una placa de Petri cuadrada a una altura de un centímetro, después de enfriar y endurecer, el gel de agar al 4% se corta en bloques de un centímetro cúbico y se coloca en una botella para su almacenamiento. Después de decapitar al ratón, corte el cuero cabelludo con una cuchilla de afeitar de un solo filo en la dirección sagital central desde el hueso frontal hasta la protuberancia occipital externa.

Posteriormente, abra aún más el cuero cabelludo cortado primero en la dirección lateral rostral. Luego en dirección ventral. A continuación, haz dos cortes laterales y uno rostral.

En el foramen magnum con una pequeña tijera de resorte, corte con cuidado el cráneo. En este momento, los huesos occipital interparietal y parietal deben separarse. Si la duramadre aún está presente, retírela con cuidado con un par de fórceps para evitar daños en el cerebro.

A continuación, extirpe el hueso escamoso, el etmoidal anterior y el agujero frontal. Ahora el cerebro se puede extraer fácilmente con una espátula de microcuchara invertida y se pueden cortar los nervios craneales. El cerebro debe aterrizar sobre su lado ventral sobre una superficie resistente a los cortes con la superficie ventral del cerebro hacia abajo.

Use una hoja de afeitar de un solo filo para quitar el cerebelo. Esta superficie de corte recto será la base para montar el cerebro en una placa que permita el corte de secciones coronales del cerebro. A continuación, pegue el cerebro con la superficie cortada en la placa base del micrótomo utilizando una pequeña cantidad del superpegamento adhesivo de cianoacrilato de alto rendimiento de curado rápido.

Posteriormente, pegue un bloque de gel de agar de un centímetro cúbico en el lado ventral del cerebro en la placa base del micrótomo para sostener y fijar el cerebro mientras se corta. Después de que la unión se haya secado, coloque la placa en el baño del micrótomo que contiene seis grados Celsius de solución extracelular oxigenada fría. Luego corte el cerebro en rodajas de 300 micras de grosor con baja velocidad de corte, las rodajas de cerebro coronal se recogen hasta que se haya seccionado todo el cerebro.

Ahora prepare un 20%onic F1 27 en solución DMSO agregando solución de DMSO al polvo onic F1 27. A continuación, disuélvelo soniendos directamente la solución durante dos minutos. Después de eso, agregue cinco microlitros de solución F1 27 al 20% ónico a un tubo de 50 microgramos de ambra peluda permeable a las células.

Mezcle la solución con una pipeta. A continuación, añade 45 microlitros de solución extracelular a la mezcla y vórdela. Brevemente, agregue 325 microlitros adicionales de solución extracelular y sonique el tubo durante otros tres minutos.

Después de la sonicación, añadir 1,156 mililitros de solución extracelular oxigenada para obtener la solución final de carga del indicador de calcio D. Transfiera los cortes de cerebro coronal a una placa de cultivo celular de seis pocillos llena de solución extracelular oxigenada hasta seis rodajas por pocillo. A continuación, aspire la solución extracelular oxigenada de las cámaras teniendo cuidado de no dañar los trozos de cerebro.

A continuación, pipetee 750 microlitros del indicador de calcio D cargando la solución directamente a cada uno. Bueno, las rodajas de cerebro deben estar cubiertas por la solución que contiene rore am. Después de eso, incube las rodajas en la incubadora de cultivo celular de oxígeno y dióxido de carbono durante 45 a 60 minutos a 37 grados centígrados.

Al final de la incubación, reemplace la solución de carga de DI indicadora de calcio con una solución extracelular oxigenada fresca para evitar la sobrecarga de las células. Para monitorear los cambios inducidos por el estímulo en la señal fluorescente, transfiera uno de los cortes de cerebro cargados de rojo fure a una cámara de grabación y colóquelo como desee. Después de montar la cámara en la configuración del microscopio confocal, perfunda el corte durante 10 minutos con una solución extracelular oxigenada para eliminar cualquier exceso de tinte indicador de calcio extracelular.

Después de salir de la cámara de grabación, el PERFUSE eight se recoge en una botella de vacío. A continuación, observe el corte a través del microscopio con un aumento bajo. Toma nota de la orientación del corte y encuentra el área de interés en el corte, en nuestro caso el área hipotalámica en el cerebro.

Después, cambie a un aumento alto. Encuentre la célula de interés en el corte mediante la recopilación de imágenes GFP y la verificación simultánea de la intensidad de fluorescencia de la señal roja URA. Ajuste la potencia del láser a un valor que permita mediciones en el cambio de la intensidad de la fluorescencia roja URA y evite el blanqueo de los dos fluoróforos.

A continuación, comience a adquirir imágenes a velocidades entre 0,5 y dos hercios para recopilar las señales fure y GFP. Esta figura muestra la imagen confocal de las neuronas GN, RHR Tau GFP en un corte coronal del cerebro. Esta es la señal de fluorescencia relativamente uniforme que se observa después de cargar el corte de cerebro con fure am y esta es la imagen fusionada que muestra las neuronas cargadas con el tinte indicador de calcio.

Estos son ejemplos de las respuestas de calcio inducidas por estímulos somáticos de neuronas individuales marcadas con GFP en diferentes áreas del cerebro hipotalámico. Las distintas señales de calcio entre las neuronas que expresan GN RHR de diferentes núcleos hipotalámicos se pueden comparar utilizando el área bajo la curva como una estimación del cambio total en calcio en una célula dada durante el mismo período una vez dominado. Esta técnica se puede realizar en menos de 90 minutos, incluyendo la preparación del colorante indicador de calcio, la carga y la incubación de las lonchas si se realiza correctamente.