Análisis específico de célula de Arabidopsis Hojas usando citometría de flujo

El objetivo general de este procedimiento es aislar una población de protoplastos específicos de un tipo celular a partir de una hoja. Esto se logra primero cultivando plantas que expresan GFP en tipos celulares específicos de la hoja. El segundo paso consiste en recolectar hojas y generar protoplastos mediante una digestión enzimática.

A continuación, los protoplastos se filtran y separan mediante citometría de flujo activada por fluorescencia o FACS. El paso final consiste en confirmar la precisión de la separación utilizando microscopía de fluorescencia. En última instancia, los protoplastos separados pueden utilizarse para el análisis de la expresión génica específica de tipo celular, análisis proteómico o perfilado metabólico.

La clasificación fluorescente de células activada ha sido utilizada con éxito anteriormente en raíces, pero se utiliza para el aislamiento de células foliares. La marcación con GFP antes de este método ha sido limitada debido a la interferencia provocada por la fluorescencia de la clorofila. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la preparación rápida pero cuidadosa de la muestra es crucial para minimizar los cambios fisiológicos extensos que pueden ocurrir durante la clasificación celular.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque no sabrán cómo configurar el ordenador de células ni cómo confirmar una ordenación precisa. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de sistemas vegetales. El problema al identificar redes de regulación génica en órganos multicelulares complejos, como una hoja, es que los diferentes tipos celulares expresan grupos distintos de genes.

Esta información genética se pierde en el análisis de cosecha de una hoja entera al demostrar el procedimiento. A mi lado estarán Ellison As y Sanjeev Kuma, quienes brindan apoyo técnico para este trabajo en nuestro laboratorio. Primero, llene una placa de Petri redonda de nueve centímetros con 20 mililitros de la solución A que contiene enzimas protoplastolíticas y inhibidores de transcripción y ARN.

Luego, recolecte el material foliar deseado para muestras que contienen más de una hoja, como la muestra mostrada aquí. Organice las hojas en un apilamiento de hasta 15 hojas. A continuación, utilice una cuchilla de afeitar para cortar las hojas en tiras de un milímetro de ancho.

Transfiera inmediatamente las tiras de hoja al plato de Petri utilizando un par de pinzas planas, separe suavemente las tiras y luego realice una infiltración al vacío de las muestras dos veces, durante cinco minutos cada vez. A continuación, coloque el plato de Petri sobre un agitador orbital ajustado a 90 RPM a temperatura ambiente y deje incubar las muestras entre tres y cuatro horas. Durante la incubación, utilice las pinzas para separar las tiras de hoja entre sí a intervalos de media hora.

Después de la digestión, filtre suavemente la solución de protoplastos a través de un filtro celular de 70 micrones hacia un tubo de 50 mililitros. Para eliminar las tiras de hoja, las tiras se retendrán. Los protoplastos pasarán por filtración.

Ahora use cuatro mililitros de la solución A para enjuagar suavemente las tiras de hoja, recolectando el lavado en el tubo de 50 mililitros. Luego transfiera la suspensión de protoplastos a tubos cónicos y centrifugue los protoplastos durante cinco minutos a 300 ×g y temperatura ambiente. Teniendo cuidado de no perturbar el precipitado, aspire suavemente la mayor cantidad posible del sobrenadante, y luego lave los protoplastos con cinco mililitros de la solución A bajo las mismas condiciones de centrifugación.

Finalmente, después de eliminar el sobrenadante, use una punta cortada de P 1000 para resuspender los PROTOPLASTOS en un volumen adecuado de solución A para su clasificación inmediata antes de la ordenación. Utilice una punta de P 1000 sin corte para desagregar cualquier grumo en la solución de protoplastos. Disocie aún más las células filtrando los protoplastos hacia un tubo de origen a través de un filtro de filón de 50 micrones.

Luego, diluya la solución celular según sea apropiado para evitar la obstrucción de la boquilla de obtención de células. Tras determinar las condiciones óptimas de obtención de células, identifique los protoplastos positivos para GFP mediante un láser de argón de 488 nanómetros, utilizando la señal de salida del filtro paso banda 580/30 frente al filtro paso banda 530/40. Tenga en cuenta que los protoplastos positivos para GFP aparecerán en la población con señal alta a 530 y baja a 580.

Con los protoplastos no GFP en la población baja de 530 y baja de 580, los protoplastos muertos o en proceso de muerte y los restos celulares aparecen en la población alta de 580. Para la visualización de los protoplastos ordenados mediante microscopía de fluorescencia, ordene los protoplastos directamente en al menos ocho volúmenes de la solución A tras la concentración por ordenación. Los protoplastos pueden separarse en ocho volúmenes de la solución A mediante centrifugación y recogerse para su visualización en un microscopio de fluorescencia con el fin de verificar el enriquecimiento. Esta primera imagen muestra un ejemplo de enriquecimiento de la línea celular TP 382, que expresa GFP en las células oclusivas. En esta tabla se resumen ejemplos de rendimientos obtenidos con este método, tanto antes como después de la amplificación.

Las cantidades obtenidas entre 500 picogramos y 5 nanogramos son suficientes para la amplificación mediante el sistema ovation PICO WTA y el posterior análisis mediante PCR cuantitativa, secuenciación de próxima generación o microarreglo. Esta siguiente serie de imágenes muestra varios protoplastos de líneas celulares aislados y clasificados mediante el método recién descrito. Estos primeros protoplastos se derivaron de KC 2 74, hojas de una sección transversal de un KC 2 74.

La hoja muestra que la GFP se expresa en el sistema vascular. Estos protoplastos se aislaron de hojas KC 4 64 y una sección transversal de una hoja KC 4 64 muestra que la expresión de GFP se encuentra en el epitelio adaxial. Finalmente, estos protoplastos se derivaron de hojas TP 3 82 en hojas TP 3 82.

La GFP se expresa en las células oclusivas aquí. Se muestran gráficos de puntos típicos de adquisición de fax que ilustran la salida de los filtros de paso de banda de 5 80 30 nanómetros frente a los de 5 30 40 nanómetros. Las compuertas de clasificación mostradas son las que se utilizan típicamente durante la clasificación.

Este primer gráfico de dispersión de protoplastos derivados de hojas de coal cuatro, protoplastificados en ausencia de inhibidores, muestra una única población baja en 530 y baja en 580. Mientras tanto, este gráfico de dispersión de protoplastos derivados de hojas de tipo silvestre de coal cuatro, protoplastificados en presencia de inhibidores, demuestra el desplazamiento en la fluorescencia a 580 que ocurre debido al estrés y la coloración provocados por los inhibidores. Estos gráficos de dispersión corresponden a protoplastos derivados de hojas de las líneas KC siete cuatro, KC 4 64 y TP 3 82, respectivamente.

Estas muestras también se trataron con yeso en presencia de inhibidores, mostrando que la GFP se encontraba en las poblaciones altas de 530 y bajas de 580. Para este experimento representativo de PCR cuantitativa, primero se obtuvieron muestras para cada tipo de fracción. Luego, las muestras se amplificaron utilizando el sistema ovation PICO WTA y PCR cuantitativa.

Se realizó el uso de cebadores específicos para GFP. Los valores mostrados son los más altos en rojo y los más bajos en verde; los valores promedio o individuales, utilizando actina dos como gen de referencia, se indican mediante barras horizontales amarillas. Los resultados constituyen una verificación nuevamente de las evaluaciones ópticas del contenido celular de GFP en las fracciones ordenadas.

La población alta en 530 y baja en 580 presentó los niveles medibles más altos de expresión de GFP. Aunque la población alta en 530 y alta en 580 mostró una expresión de GFP aproximadamente 1000 veces menor, las poblaciones baja en 530 y baja en 580, así como baja en 530 y alta en 580, exhibieron bajos niveles de expresión de GFP comparables a los de las poblaciones de hoja entera control y protoplastos no ordenados. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cuatro a cinco horas, desde la planta hasta la población celular ordenada, si se lleva a cabo correctamente. Durante la realización de este procedimiento, es importante recordar monitorear constantemente el citómetro de células y recalcularlo si es necesario, con el fin de mantener la precisión en el ordenamiento.

Se encontró este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como el análisis de micromatrices, para comparar los niveles de expresión génica en diferentes tipos celulares. Ahora que se ha desarrollado esta técnica, estamos analizando la expresión génica en tipos celulares foliares específicos en distintas etapas de desarrollo, y compararemos estos datos con los obtenidos del tejido foliar completo generados en el proyecto de agronomía.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar tipos celulares individuales de hojas utilizando clasificación de células activadas por fluorescencia.