Name: Análisis espectrométrico de masas de Antígenos glicoesfingolípido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 9 s
Description: Aprenda a analizar antígenos glicoesfingolípido mediante espectrometría de masas en células inmunitarias. Este método sensible permite estudiar biomarcadores de cáncer con alta precisión molecular.

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DZ es apoyado por el MD Anderson Cancer Center y el NIH AI079232 subvenciones. MD Anderson Cancer Center es apoyado en parte por el NIH subvención CA16672.

1. Laboratorio de seguridad Preocupaciones <ol><li> Todos los disolventes orgánicos deben ser almacenados en áreas específicas con un etiquetado claro. Consulte las etiquetas de fabrica para los tipos de extintores necesarios. </li><li> Varios reactivos utilizados son potencialmente cancerígenos, y puede causar depresión mental. Estos reactivos deben ser manejados en una campana química con ventilación (Vea la tabla de reactivos y equipos específicos para detalles). </li><li> Se recomienda que cuando se trabaja con disolventes orgánicos y células, equipos de protección personal, como guantes, bata de laboratorio y gafas protectoras ser utilizados en todo momento. </li></ol> 2. La extracción de células de leucemia Glicoesfingolípidos de rata <ol><li> Tienda de células de rata RBL leucemia ocho (10 millones a 100 millones) en tubos de 16x100 mm de vidrio bajo -80 ° C. Las células se cuentan por un hemocitómetro después de tinción con azul de tripano. La viabilidad de las células debe ser superior a 95%. </li><li> Extraer los lípidos usando sonicat extensaion cuatro veces para cada 1-2 horas con los disolventes de polaridad mixtos. Use 6 ml de 1:1 de cloroformo-metanol (v / v) como el disolvente primero y el último. Seis mililitro de isopropanol: hexano: H 2 O 55:25:20 (v / v / v, quitar fase superior mediante aspiración antes de su uso), entonces se puede utilizar como disolvente segunda y tercera. Este disolvente se prepara mediante la mezcla de isopropanol: hexano: H 2 O en una proporción de 55:25:20, agitando vigorosamente, y permitiendo una fase superior que aparezca, que serán eliminados. Sigue la fase inferior para su uso. </li><li> Sigue a sonicación con centrifugación para sedimentar el material insoluble. Reunir los sobrenadantes. Secar en un Speedvac durante 4 horas. Corriente de nitrógeno o evaporador rotatorio se puede utilizar si no está disponible Speedvac. Use una buena trampa fría para sostener evaporados los solventes orgánicos. La contaminación de disolvente orgánico en el aceite de la bomba de vacío se degrada la eficiencia de la bomba de vacío. </li><li> Realizar un análisis preliminar con alto rendimiento cromatografía en capa fina (HPTLC). Para cuantificar glicolípidos, Preparar un orcinol 0,2% en solución de ácido sulfúrico al 50% (100 mg en 50 ml) y un estándar de galactosa (40 mg en 100 ml de solución madre). Preparar en 30 l de volumen de reacción de una serie de diluciones de usar como curva estándar (de 0 g / L a 20 g / L). Añadir 20 l de metanol a cada muestra de la serie de dilución. Disolver cada muestra glicolípido en 200 l de metanol, sonicado, y el uso de 20 l para la medición de la cantidad de glicolípidos. En 1,5 ml de tubos Eppendorf con tapones roscados (Sarstedt, 72.692.005), añadir 0,4 ml de 0,2% orcinol en solución de ácido sulfúrico al 50% a cada muestra, con una serie de galactosa-H 2 O-metanol soluciones que sirven para la curva patrón . Hervir durante 5 min en bloque de calentamiento a 100 ° C. Leer la densidad óptica de la reacción de color a 440 nm utilizando Amanecer Lector de Microplacas Tecan. Para realizar HPTLC, utilizar cloroformo: metanol: H 2 O 60:35:8 (v / v / v) como el disolvente para los lípidos neutros se trató con 1:1 de cloroformo-metanol (v / v). El uso de isopropanol: hexano: H 2 O 55:25:20 (v / v / v) comoel disolvente para los lípidos ácidos (gangliósidos). Los GSL neutros aislados se disolvió en 200 l de disolvente cloroformo: metanol 1:1 (v / v) y se cargó sobre gel de sílice Merck delgada placa de cromatografía en capa por Drummond Microcaps. Las placas se ejecuta en cloroformo disolvente: metanol: H 2 O 60:35:8 (v / v / v) y se secó. Los glicoesfingolípidos se visualizaron por orcinol-ácido sulfúrico a 300 ° C. </li><li> Con el fin de separar los lípidos neutros a partir de los ácidos lípidos, fracción a cabo los lípidos neutros y ácidos mediante cromatografía de intercambio aniónico sobre una pequeña columna de DEAE Sephadex A-25 [la resina DEAE Sephadex A25 se pueden preparar por remojo Sephadex A-25 resina polvo en cloroformo: metanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) durante la noche. Aspirar el sobrenadante hasta que la resina Sephadex A25 es todo lo que queda. Añadir fresco cloroformo: metanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) para lavar la resina. Repetir tres veces para eliminar los residuos de carga negativa de] resina Sephadex A25. </li><li> Disolver, Someter a ultrasonidos (durante no más de 10 min), y resuspender los lípidos del paso 2,1 en cloroformo: metanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) cuando sea necesario. </li><li> Preparar una pequeña columna de Sephadex DEAE A25 (Cl Form) de la columna utilizando lana de vidrio y un 9 &quot;pipeta Pasteur. Paquete de la lana de vidrio cuidadosamente para que el polvo de resina no pasa a través de la columna. Añadir DEAE Sephadex A25 (forma Cl) a la resina&quot; cuello &quot;del 9&quot; pipeta Pasteur sin dejar que la columna seca. Asegúrese de que usted no ve ninguna resina en eluyente. Las muestras disueltas en cloroformo: metanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) se disolvieron. La fracción de lípido neutro es el flujo a través de fracción. </li><li> Eluir la fracción de lípidos ácidos (unido a las resinas) con 8 ml de acetato de sodio en metanol. Seque tanto las fracciones neutras y ácidas, desalar ellos por diálisis, séquelos Speedvac y analizarlos por HPTLC. </li></ol> La fracción ácida contiene gangliósidos, que puede ser dializado para la Etapa 3 de reacción directamente.La fracción neutra contiene no sólo los glicoesfingolípidos neutros, sino también a fosfolípidos (fosfatidilcolina y esfingomielina), que debe ser eliminado por una reacción de acetilación. En nuestra experiencia, el método de un casete de diálisis, es más eficiente y conveniente que un tubo de diálisis o cromatografía de columna de fase inversa C18. <ol start="9"><li> El siguiente paso es la eliminación de los fosfolípidos de glicoesfingolípidos neutros mediante una reacción de acetilación y peracetilación. Secar el DEAE Sephadex A-25 de paso a través en la fracción Speedvac (con enfriamiento) durante 4 horas. Después de que las muestras estén secas, ponerlas de nuevo en el Speedvac y seco para otro 4 horas. Asegúrese de que estas muestras están completamente secas, como cualquier agua residual evitará que la reacción peracetilación. </li><li> Peracetylate las muestras con 1 ml de piridina y 0,5 ml de anhídrido acético en la oscuridad a temperatura ambiente o 37 ° C durante la noche. Esta cantidad de anhídrido acético y piridina es adecuado para un máximo dea 200 g de glicoesfingolípidos. Esta reacción se puede llevar a cabo a 37 ° C, como los GSL tienen mejor solubilidad. </li><li> Secar el material peracetilado por Speedvac durante 3 horas, con la adición de 1 ml de tolueno 3x (coevaporación) para asegurar la completa evaporación. Si las muestras no son todavía completamente seco, Speedvac hasta que se seque. </li><li> Preparar una Florisil (Sigma-Aldrich) columna (30-60 mesh, 10 × 80 mm) en una pipeta Pasteur con lana de vidrio, usando perlas de Florisil. Perlas de Florisil debe secarse completamente antes de su uso, por incubación en una estufa a 110 º C. Llenar las perlas en la pipeta Pasteur hasta el cuello, y se equilibra en 1,2-dicloroetano-hexano 4:1 (v / v). </li></ol> La elución de la columna de Florisil es muy rápido. Rapid volatilidad de los disolventes puede conducir a un secado columna. Así, todas las mezclas de disolventes deben estar preparados antes de ejecutar la columna, ya que no es posible detener la columna durante la elución. <ol start="13"><li> Aplicar el peracetilATED muestra en 1 ml de 1,2-dicloroetano-hexano 4:1 (v / v), y se lava la columna con 6 ml del mismo disolvente, seguido de 10 ml de 1,2-dicloroetano. Eluir los GSL neutros peracetilados con 6 ml de 1,2-dicloroetano-acetona 1:1 (v / v). Esta etapa elimina los fosfolípidos peracetilados de glicoesfingolípidos, porque los glicoesfingolípidos peracetilados se unen a la columna de Florisil, mientras que los fosfolípidos peracetilados no. </li><li> Secar las fracciones por Speedvac durante 2 horas y desacetilar con 2 ml de metóxido sódico 0,5 M [Sigma-Aldrich, 403067] en 2 ml de metanol durante 3 horas a temperatura ambiente. </li><li> Se neutraliza la mezcla con 3 ml de ácido acético metanólico [ácido acético / metanol 15/85 v / v], seco por Speedvac, desalar mediante diálisis [Disolver los productos secos en 3 ml de agua, y se inyecta en el Slide-A-Lyzer casete de diálisis, se dializa frente a agua durante 24 h. Cambiar el agua por lo menos dos veces]. Secar los GSL dializados (en solución acuosa) por Speedvac hasta que las muestras estén completamente secas. </li&gt; </ol> 3. Modificación química (permetilación) de glicoesfingolípidos 13 <ol><li> Introducir los GSL (1-20 g) a un tubo de vidrio con un tapón de rosca y forro de Teflon, y añadir sulfóxido de dimetilo (150 l) sin utilizar especiales condiciones de secado o la atmósfera de gas inerte. </li><li> Preparar hidróxido sódico en polvo (40-60 mg) de partículas de hidróxido de sodio por molienda en un mortero químico con una mano de mortero. Asegúrese de guardar los polvos en un ambiente muy seco y tener cuidado de hacer la molienda de la campana química para evitar la inhalación de los polvos. </li><li> A continuación añadir el polvo de hidróxido de sodio a la solución de la muestra con una espátula. Añadir yodometano (80 l) con una jeringa de 100 microlitros Halmilton, [o un VWR 100 microlitros pipeta calibrada vinculado a una jeringa a través de un tubo de goma se puede utilizar], y agitar la mezcla a temperatura ambiente durante 1 hr. </li><li> Se inactiva la reacción de metilación con agua (2 ml). Extraer los productos permetilados 3 veces porla adición de diclorometano (2 ml) [glicolípidos están en la fase de diclorometano, que es la fase más baja, por lo que la fase superior puede ser transferido a un nuevo tubo de vidrio, y se extrajo de nuevo con diclorometano]. </li><li> Se lava el diclorometano combinada extrae 3 veces con 2 ml de agua [la fase superior, que es el agua, entonces puede desecharse]. Tras el lavado final, transferir las muestras a un tubo nuevo y se secarán con el Speedvac. </li><li> Las muestras entonces se puede disolver en 100 a 200 l de metanol para ESI-MS análisis. </li></ol> 4. MALDI-TOF El análisis de los Gycosphingolipids permetilados <ol><li> Realizar MALDI-TOF-MS y MALDI-TOF/TOF-MS/MS experimentos en un espectrómetro MALDI TOF-TOF (Applied Biosystems 4700, Foster City, CA). Preparar la matriz mediante la mezcla de 50% de volumen de 10 mg / ml de ácido dihidroxibenzoico (DHB) en acetonitrilo y 50% en volumen del 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA) en agua. </li><li> La matriz DHB se pueden observar en la targe MALDIt (1 l), seguido de un l 1 (que contiene 100 ng de los GSL) lugar de la muestra disuelta en metanol. Aplique lentamente y deje que se seque antes del análisis. </li></ol> 5. Ion Trap MS El análisis de los glicoesfingolípidos permetilados <ol><li> Llevar a cabo la espectrometría de masas en un espectrómetro de masas de trampa de iones lineal (LTQ, ThermoScientific, San Jose, CA) utilizando una fuente de nanoelectropulverización, 0,30 l / min velocidad de flujo a 230 º C de temperatura capilar en el modo de ion positivo con energía de colisión 30-50%. Establecer energías de colisión para dejar un abundancia residual mínima de ion precursor. Detectar todos los iones como aductos de sodio. </li><li> Identificar el iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) en una mezcla isobárica de Gb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) y estándares de iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) mediante la comparación de los diferentes patrones de iones MS producto 4 del ion molecular sodiated a través del fragmento de glicano m / z 667 y el disacárido terminal 1 - eno ion m / z 445 (es decirX → 667 → 445 →, X significa que el ion molecular detecta en MS 1) de puros permetilados iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) las normas a través de ESI-LIT-MS con las de permetilada Gb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer). </li></ol>

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DZ es un consultor para Biotex, Houston, TX, y un inventor involucrado en patentes relacionadas con las tecnologías mencionadas en este artículo, emitidos o en su aplicación.

El glicoma, un término acuñado en analogía con el genoma y el proteoma, se refiere a todas las estructuras de sacárido de un organismo. Para comprender plenamente las múltiples funciones de la glicosilación requerirá un enfoque integrado que incluye tanto estudios glicómica funcionales y estructurales. Ambos se complica por la naturaleza no accionado plantilla de la biosíntesis de glicanos, la complejidad resultante y la diversidad de las estructuras de glicano, la frecuente participación de estructura de aglicona en la modulación de glicano ligando-receptor interacciones a nivel molecular, y la importancia funcional de los ligandos de baja abundancia. En general se acepta que la espectrometría de masas (MS) es un método indispensable para estudios glicómica estructurales, especialmente para identificar y caracterizar ligandos de baja abundancia. Para observar glicanos o glicoconjugados como especies moleculares, a menudo utilizar una alta eficiencia, baja energía de ionización método, llamado ionización electrospray (ESI). Para más detailed caracterización de la estructura de glicano, es esencial para seleccionar especies moleculares individuales y romper los glicanos en pedazos más pequeños. Esto se hace normalmente por disociación inducida por colisión, que implica la activación de los glicanos a través de colisión con moléculas de gas inerte. El aumento de la energía induce rotura del enlace, y el análisis sistemático de los fragmentos resultantes proporciona información acerca de la estructura molecular de la glicano. A menudo, &quot;firma&quot; pueden generarse fragmentos que son diagnósticos de determinadas características estructurales glicano. Junto con la masa molecular, estos fragmentos a veces puede ser suficiente para la identificación de glicanos, pero en el pasado mucha más información ha sido requerido para caracterizar plenamente ellos, particularmente si la estructura es novedosa. Estos métodos incluyen el análisis de azúcar en la composición, la masa de cromatografía de gases espectrometría de análisis parcialmente metilados acetatos alditol para análisis de ligamiento, digestión y glicosidasa específico 17. 18-19, múltiples rondas de fragmentación de baja energía, que puede llevarse a cabo eficazmente en un espectrómetro de masas de trampa de iones (IT-MS), mejora en gran medida el rendimiento de la información a partir del análisis espectral de masas glicano . Con cuatro o cinco rondas de fragmentación (que no se puede hacer con otros instrumentos MS), es posible distinguir glicanos isoméricas que contienen los componentes de azúcar mismos dispuestos en enlaces de azúcar diferentes, incluso cuando estos están presentes juntos en mezclas de componentes con la misma masa molecular (isobaras). Para este análisis, los glicanos se derivaron, en sustitución de los grupos hidroxilo libres con grupos metílicos, utilizando permetilación. Mientras asignación estructural de los glucanos es posible sin permetilación, la permetilación aumenta la sensibilidad 17. Levery y Zhou, se han combinado todas las ventajas potenciales de la TI-MS metodología, incluyendo la detección de isómeros estructures utilizando iones de firma de diagnóstico, sólo observables en MS 4 y 5, espectros de MS para la identificación y cuantificación altamente sensible de glicoesfingolípidos presentes en forma de múltiples mezclas isobáricas 7-9. En teoría, se puede ser capaz de identificar cada estructura glicolípido existente, a la espera de la disponibilidad de los glicolípidos estándar, que pueden ser sintetizados químicamente. Los pasos críticos de este análisis son la tasa de recuperación de los GSL de muestras biológicas. Típicamente 80 g de GSL se puede recuperar de 100 millones de células tumorales tales como RBL. Para generar suficientes iones moleculares de múltiples rondas de fragmentación en espectrómetros de masas de trampa de iones, al menos 10 microgramos de GSL tumorales se requieren. Bajo rendimiento de GSL durante la purificación dará lugar a la baja abundancia de iones, los cuales no podían ser sometidos a una mayor fragmentación. El éxito de análisis es dependiente de la cantidad de GSL que se recuperan. Típicamente, concentración finalentration de GSL permetilados debe llegar a 1 mg / ml, se disolvió en metanol, antes de ser analizados en una fuente de nano-electrospray. El límite para un análisis minucioso MS n es dependiente de la abundancia de ión específico en el perfil de MS 1. Un típico e 7 abundancia de iones es necesario para una completa MS análisis 5. El bajo rendimiento de los GSL durante la purificación puede ser causada por la pérdida de los GSL durante el paso peracetilación (que elimina los fosfolípidos), cuando los GSL por-acetilados debe estar enlazado a cromatografía en columna de Florisil resina, se lavó, y se eluyó posteriormente. Para asegurar la unión de por-acetilados GSL a gel de sílice, las muestras deben ser recargadas dos veces a la columna de cromatografía después de fluir a través de.

<table><tbody><tr><td>1,2 Diclor&amp;#8211;etano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34872</td><td>Carcinogénico </td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>VMR</td><td>JT9524-0</td><td></td></tr><tr><td>Anhídrido acético</td><td>Fluka</td><td>45830</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fischer</td><td>A18P-4</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo </td><td>Fischer</td><td>C606-1</td><td>Carcinogénico</td></tr><tr><td>DEAE Sephadex A25 (forma Cl)</td><td>GE Healthcare Biosciences</td><td>AB 17&amp;#8212;170-01</td><td>100 gramos</td></tr><tr><td>Decano (anhidro): </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>457116</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Ácido dicloroacético</td><td>Sigma</td><td>D54702</td><td>Carcinogénico</td></tr><tr><td>Cassette de diálisis </td><td>Fischer (Pierce)</td><td>66110</td><td>Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml </td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Scientific</td><td>20684</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de etilo </td><td>Fischer</td><td>UN1173</td><td></td></tr><tr><td>Florisil</td><td>Fluka</td><td>46384</td><td>para empaquetar columna de cromatografía</td></tr><tr><td>Hexanos </td><td>EMD</td><td>HX0290-6</td><td></td></tr><tr><td>Iodomethano </td><td>Riedel de Haen, Alemania</td><td>03810</td><td>estabilizado con hoja de plata, carcinogénico</td></tr><tr><td>Metanol </td><td>VWR/EMD</td><td>MXO475-1</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla Qualmix de glicoesfingolípidos neutros </td><td>Matreya</td><td>1505</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de monosialogangliósidos</td><td>Matreya</td><td>1508</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de disialogangliósidos </td><td>Matreya</td><td>1509</td><td></td></tr><tr><td>Lactosilceramida y derivados sialilados </td><td>Matreya</td><td>1510</td><td></td></tr><tr><td>Gangliotetraosilceramida y derivados sialilados </td><td>Matreya</td><td>1511</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de Pasteur</td><td>Fischer</td><td>13-678-6A</td><td>9"''</td></tr><tr><td>Piridina: </td><td>Sigma</td><td>270407</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio: </td><td>BDH</td><td>0292</td><td>500 gramos</td></tr><tr><td>Metóxido de sodio </td><td>Sigma</td><td>404367</td><td>Solución 0,5 M en metanol</td></tr><tr><td>Tolueno </td><td>J.T. Baker</td><td>9351-03</td><td>4 L</td></tr><tr><td>Pipetas de Pasteur</td><td>Fischer</td><td>13-678-6A</td><td>9"''</td></tr><tr><td>Fibra de vidrio (lana de vidrio)</td><td>Corning Incorporated</td><td>3950</td><td>Pyrex 9989 vidrio</td></tr><tr><td>Tubos de vidrio de 12x75 mm</td><td>Fischer</td><td>14-962-10B</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas calibradas (100 microlitros)</td><td>VMR</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>Tubos desechables de borosilicato de 16x100 mm x1.000 </td><td>Fischer</td><td>14-961-29</td><td>Con tapas roscadas</td></tr><tr><td>Tapas para tubos de vidrio</td><td>Kimble</td><td>40566C</td><td>tamaño/13-415 </td></tr><tr><td>Placas TLC Merck</td><td>Sigma</td><td>Z 29, 301-6</td><td></td></tr><tr><td>Tanque de vidrio para TLC</td><td>Sigma</td><td>Z 12,619-5</td><td></td></tr><tr><td>Microcápsulas Drummond </td><td>Drummond Scientific Company</td><td>1-000-0100</td><td>10 &amp;mu;l, para carga de muestras en TLC</td></tr><tr><td>Lector de absorbancia Sunrise Microplate</td><td>Tecan</td><td>A-5082</td><td></td></tr><tr><td>Papel para cromatografía Whatman</td><td>Fischer</td><td>05-716-3E</td><td>18 cm x 34 cm para tanque TLC</td></tr><tr><td>Reactivo en spray de orcinol cloruro férrico</td><td>Sigma</td><td>O7875</td><td>Para detectar glicoesfingolípidos en placas TLC</td></tr><tr><td>Unidad de pulverización Prevel</td><td>Sigma</td><td>Z 36,555-6</td><td></td></tr><tr><td>Sonicador</td><td>Fischer</td><td>FS20</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Sorvall</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>Speedvac</td><td>Savant</td><td>AS160</td><td>Con trampa química para disolventes orgánicos</td></tr><tr><td>Espectrómetro de masas MALDI TOF-TOF</td><td>Applied Biosystems</td><td>Proteomics 4700</td><td></td></tr><tr><td>Espectrómetro de masas con trampa iónica</td><td>Thermo</td><td>LTQ</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis espectrométrico de masas de antígenos glicoesfingolípido

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Glicoesfingolípidos (GSL) pertenecen a la clase glicoconjugado de biomacromoléculas, que llevan información estructural de importantes procesos biológicos tales como el desarrollo embrionario, la transducción de señales, y el reconocimiento del receptor inmune 1-2. Ellos contienen restos de azúcar complejas en forma de isómeros, y restos lipídicos con variaciones que incluyen la longitud de cadena de acilo graso, insaturación, y la hidroxilación. Ambas porciones de hidratos de carbono y la ceramida puede ser base de importancia biológica. Por ejemplo, tri-hexosylceramides incluyen globotriaosilceramida (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) y isoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer), que tienen masas moleculares idénticas pero diferentes vínculos de azúcar del resto carbohidrato, responsable de las funciones biológicas completamente diferentes 3-4. En otro ejemplo, se ha demostrado que la modificación de la parte de ceramida de la alfa-galactosilceramida, un ligando agonista potente para invariablementehormigas células NKT, cambios de sus perfiles de secreción de citoquinas y la función en modelos animales de cáncer y enfermedades autoinmunes-5. La dificultad en la realización de un análisis estructural de isómeros en los órganos inmunes y células sirven como una barrera para la determinación de muchas funciones biológicas 6. Aquí, se presenta una versión visualizada de un método para el análisis relativamente simple, rápido y sensible de los perfiles de glucoesfingolípidos en las células inmunes 7-9. Este método se basa en la modificación de extracción y química (permetilación, ver más abajo la Figura 5A, todos los grupos OH de hexosa fueron reemplazados por MeO después de la reacción permetilación) de glicoesfingolípidos 10-15, seguido por análisis posterior mediante láser asistida por matriz de desorción / ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF/MS) y espectrometría de masas de trampa de iones. Este método requiere de 50 millones de células inmunes para un análisis completo. Los experimentos se puede completar en una semana. La abundancia relativa de los glicoesfingolípidos diferentes pueden ser delineadas por comparación con estándares sintéticos. Este método tiene una sensibilidad de medición de 1% iGb3 entre Gb3 isómeros, cuando 2 fmol del total iGb3/Gb3 mezcla está presente 9. Trampa de iones de espectrometría de masas puede utilizarse para analizar los isómeros. Por ejemplo, para analizar la presencia de globotriaosilceramida y isoglobtriaosylceramide en la misma muestra, se puede utilizar la fragmentación de moléculas estructuralmente glucoesfingolípidos para discriminar entre los dos (véase más adelante la figura 5). Además, la modificación química de los restos de azúcar (a través de una reacción permetilación) mejora la eficiencia de ionización y fragmentación para una mayor sensibilidad y especificidad, y aumenta la estabilidad de los residuos de ácido siálico. La modificación química de extracción y glicoesfingolípidos se puede realizar en una campana química clásica certificado, y la espectrometría de masas puede ser realizada por núcleoinstalaciones con instrumentos de trampa de iones MS.

Un ejemplo de un análisis de MALDI-MS de los glicoesfingolípidos de rata RBL línea celular de leucemia (un antígeno presentando tipo de célula que presenta antígenos a las células NKT glucoesfingolípidos) se muestra en la Figura 3. Los iones pueden ser asignados a las estructuras específicas de glucoesfingolípidos (Figura 3A). En las células tratadas con RBL NB-DGJ 16, un fármaco que inhibe la síntesis de glicoesfingolípidos, reducción significativa de todos los glicoesfingolípidos se observó (Figura 3B). Isómeros estructurales no pueden ser distinguidos. La capacidad de MS / MS de la Applied Biosystems 4700 permite la fragmentación de iones MS1 a MS 2 fragmentos, permitiendo que la información estructural limitada a ser generado. Sin embargo, el análisis de MS2 a menudo no es suficiente para discriminar isómeros de oligosacáridos. El análisis de trampa de iones-MS de glicoesfingolípidos permite el estudio de isómeros, tales como iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) y Gb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) que puede existir como los iones trihexosylceramide detectados en la Figura 3A. Para detectar tales isómeros, estándar iGb3 y Gb3 se analizaron mediante múltiples rondas de fragmentación, hasta que se encontraron diferencias (Figura 4A y 4B). En el ejemplo presentado aquí (Figura 5C) iGb3 y Gb3 podría ser discriminados mediante la comparación de la norma iGb3 y Gb3. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama de flujo del procedimiento de extracción de glicoesfingolípidos, y la modificación química de los glicoesfingolípidos (permetilación). Glicoesfingolípidos se extrajeron a partir de células mediante disolventes orgánicos. Para expulsar a los no glicoesfingolípidos, los lípidos pueden ser peracetilado y desacetilada. En segundo lugar, glicoesfingolípidos se modifican químicamente mediante una reacción permetilación, que mejora la sensibilidad y la especificidad de MS Detection. Finalmente, los perfiles de glucoesfingolípidos se determinaron utilizando MALDI-TOF espectrometría de masas y espectrometría de masas de trampa de iones. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig2.jpg" /> Figura 2. Cuantificación de glicoesfingolípidos por el Método de orcinol ácido sulfúrico: Cuantificación de los glicoesfingolípidos utilizando un 0,2% orcinol en solución de ácido sulfúrico al 50% y una curva patrón de glucosa. <img alt="Figura 3" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3.jpg" /> Figura 3. Glycosphingolipidomics de células leucémicas de rata A. Representante de espectro de masas MALDI;. Cada ion representa una estructura de glicoesfingolípido específico, isómeros estructurales no pueden ser distinguidos B. NB-DGJ, un fármaco que inhibe la síntesis de glicoesfingolípidos, s.ignificantly reduce todos los glicoesfingolípidos producidas en células RBL. <img alt="Figura 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4.jpg" /> Figura 4. La espectrometría de masas en tándem de los isómeros de los glicoesfingolípidos. A. vías de descomposición característicos de la espectrometría de masas de iones positivos modo de trampa de GSL permetilados 3 Gb Cer y Cer iGb 3. 3 Gb y 3 iGb están claramente separadas por sus patrones de fragmentación. Las diferencias en la unión se refleja en los iones producto de MS 4 consistentes con los isobárico m / z 445 precursores. B. Los resultados representativos que muestran iGb3 se puede medir en una mezcla de isómeros iGb3/Gb3. Las estrellas indican los iones de diagnóstico para iGb3 solamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para</a>ampliar figura. <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5.jpg" /> Figura 5. Ion trampa MS permite el análisis de isómeros de glicoesfingolípidos. A. Norma iGb3 y la diferencia Gb3 muestra de perfil fragmentación después de 4 rondas de fragmentación en una trampa de iones espectrómetro de masas LTQ. B. Características MS 4 perfil de iones derivados de iGb3 o Gb3 C.. Trihexosyleramides son mezclas de isómeros Gb3 iGb3 y que pueden ser identificados por trampa de iones MS método (Figura Dapeng por Zhou). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> .

Un método específico y sensible para profundizar en el perfil de expresión de los antígenos de glucoesfingolípidos en órganos y células inmunes se describe. El método se aprovecha de la espectrometría de masas de iones trampa permitiendo paso a paso fragmentación de las moléculas de glucoesfingolípidos para el análisis estructural, en comparación con los estándares de síntesis química.

Análisis espectrométrico de masas de Antígenos glicoesfingolípido

Los glucoesfingolípidos (GSL) pertenecen a la clase de biomacromoléculas de glucoconjugados, que contienen información estructural para procesos biológicos significativos...

El objetivo general de este procedimiento es crear un método específico y sensible para obtener información sobre el perfil de expresión de los antígenos lipídicos de glico-finger en órganos y células inmunitarios. Esto se logra primero extrayendo los lípidos de glico-finger de las células. El segundo paso consiste en separar los lípidos glicofingolípidos neutros de los lípidos glicofingolípidos ácidos.Después de que los fosfolípidos se eliminan de los lípidos neutros, los lípidos glicídicos extraídos se modifican químicamente mediante una reacción de permetilación en la que todos los grupos hidroxilo de las hexosas se sustituyen por grupos metoxi. Finalmente, los lípidos glicídicos extraídos se analizan utilizando espectrometría de masas con desorción por láser asistida por matriz, tiempo de vuelo, abreviada como MALDI-TOF MS, y espectrometría de masas con trampa de iones. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la HPLC analítica y la tinción con anticuerpos, es que la espectrometría de masas es más sensible y mide con precisión la masa de las moléculas.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como la medición de glicolípidos antigénicos de baja abundancia. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia o el diagnóstico del cáncer, ya que muchos antígenos glicolípidos, como GD dos y globo H, se expresan como biomarcadores del cáncer. Demostraré el procedimiento como estudiante de pregrado del laboratorio de la profesora DA pen Zoe.El Dr. David Hawk realizará procedimientos en los instrumentos de espectrometría de masas. Antes de comenzar este procedimiento, prepare células de leucemia basófila de rata contando las células mediante un hemocitómetro. Después de la tinción con azul de tripano, la viabilidad celular debe ser superior al 95 %. Extraiga los lípidos añadiendo primero seis mililitros de una relación volumétrica uno a uno de cloroformo-metanol a las células.Utilice sonicación prolongada durante una a dos horas con el disolvente de polaridad mixta. Repita este procedimiento dos veces con una relación volumétrica de 55 a 25 a 20 de isopropanol, hexano y agua preparada según se describe en el procedimiento escrito como extracción final. Añada seis mililitros de cloroformo, metanol y someta a sonicación previamente.Después de la sonicación, realice una centrifugación para pelotar el material insoluble a 4.000 RPM durante cinco minutos. Retire la fase superior antes de secar las muestras en un evaporador al vacío durante cuatro horas. Con el fin de separar los lípidos neutros de los lípidos ácidos, utilice cromatografía de intercambio aniónico en una columna pequeña de de A e sedex A 20.Después de preparar el DEAE SEDEX A 25 según se describe en el procedimiento escrito que acompaña a este video, prepare la columna utilizando una pared de vidrio y una pipeta de pasta de nueve pulgadas. Empaquete cuidadosamente la pared de vidrio para que el polvo de resina no atraviese la columna. Añada resina de DEAE sedex A 25 al cuello de la pipeta de aire de pasta de nueve pulgadas sin permitir que la columna se seque.Asegúrese de que no haya resina en el eent. Disuelva, sonicar y re-suspender los lípidos en una relación volumétrica de 30:60:8 de cloroformo, metanol y agua, y aplique las muestras disueltas a la columna. Los lípidos neutros atravesarán la columna, mientras que los lípidos cargados permanecerán en ella; eluya la fracción de lípidos ácidos con ocho mililitros de acetato de sodio en metanol.Se muestra aquí la fracción cargada negativamente y seca tras ser tratada con acetato de sodio. Desaline las fracciones mediante diálisis utilizando el cassette de diálisis Slide-A-Lyzer. Seque las fracciones mediante evaporación al vacío antes del análisis preliminar de los lípidos mediante cromatografía en capa fina de alto rendimiento o H-P-T-L-C; para realizar la H-P-T-L-C, disuelva los lípidos neutros glicosilados aislados o GSL en 200 microlitros de un disolvente de cloroformo-metanol en una relación volumétrica uno a uno.Cargue la muestra en una placa de cromatografía en capa fina de gel de sílice. Corra las placas en una relación volumétrica de 60:35:8 de cloroformo-metanol-agua después de secar la placa. Visualice los lípidos de glicodactilar con ácido sulfúrico de arsenal a 300 grados Celsius para los lípidos ácidos o gangliósidos.Utilice una relación volumétrica de 55 a 25 a 20 de isopropanol, hexano y agua como disolvente y realice la corrida en la H-P-T-L-C de la misma manera. En este punto, la fracción neutra contiene no solo glicolípidos neutros, sino también fosfolípidos, los cuales deben eliminarse mediante una reacción de acetilación y paraacetilación. Primero, seque la fracción que pasa por DEAE sedex A 25 en el speed VAC con enfriamiento durante cuatro horas.Una vez que las muestras estén secas, colóquelas nuevamente en el speed vac y seque durante otras cuatro horas. Asegúrese de que estas muestras estén completamente secas, ya que cualquier residuo de agua impedirá la reacción de paraacetilación. Añada un mililitro de PERINE y 0,5 mililitros de anhídrido acético a las muestras para la reacción de paraacetilación de hasta 200 microgramos de lípidos glico fing, incubando en la oscuridad a 37 grados Celsius durante la noche.Una temperatura a la cual los GSL tienen mejor rendimiento, añada un mililitro de tolueno para asegurar la evaporación completa y seque el material paracético mediante vacío rápido durante tres horas. Si las muestras aún no están completamente secas, utilice el vacío rápido hasta que estén secas; aquí se muestra la muestra paracética seca. Mientras tanto, prepare una columna de Florisil secando completamente las perlas de Florisil mediante incubación en un horno a 110 grados Celsius.Luego prepare la columna en una pipeta Pasteur con algodón de vidrio, llenando la pipeta con las perlas hasta el cuello y equilibrando en una relación volumétrica de cuatro a uno de dicloroetano y hexano. La elución a partir de una columna de célula de flujo es muy rápida. La volatilidad rápida de los disolventes puede provocar el secado de la columna. Por lo tanto, todas las mezclas de disolventes deben prepararse antes de correr la columna.Dado que no es posible detener la columna durante la elución, aplique la muestra al 100 % en un mililitro a una relación volumétrica de cuatro a uno de dicloroetano a hexano. Lave la columna con seis mililitros del mismo disolvente, seguido de 10 mililitros de dicloroetano para la elución.El percet neutro con seis mililitros de una relación volumétrica uno a uno de acetona de dicloro uno dos. Este paso elimina los fosfolípidos de percet de los lípidos de glicosilación porque los lípidos de glicosilación de percet se unen a la columna de fluorol mientras que los fosfolípidos de percet no lo hacen. Después de secar las fracciones mediante centrifugación al vacío durante dos horas, desacetilar con dos mililitros de metóxido de sodio 0,5 molar y dos mililitros de metanol durante tres horas a temperatura ambiente.Tras la incubación, neutralice la mezcla con tres mililitros de metanol, ácido acético y seque mediante centrifugación al vacío, diálisis mediante un casete de diálisis Eliza, disolviendo los productos secos en tres mililitros de agua e inyectándolos en el casete de diálisis Eliza, seguido de diálisis contra agua durante 24 horas, cambiando el agua al menos dos veces. Seque el GSL dializado mediante evaporación al vacío hasta que las muestras estén completamente secas. Para la metilación completa. Primero introduzca el GSL en un tubo de vidrio con tapa roscada y revestimiento de teflón junto con 150 microlitros de dimetilsulfóxido sin utilizar condiciones especiales de secado ni atmósfera de gas inerte. En la campana química, prepare hidróxido de sodio en polvo a partir de partículas de hidróxido de sodio moliéndolas en un mortero químico con un pistilo. A continuación, añada el polvo de hidróxido de sodio a la solución de la muestra con una espátula.Luego, agregue 80 microlitros de metano IO con una jeringa Hamilton de 100 microlitros. Agite la mezcla a temperatura ambiente durante una hora, luego detenga la reacción de metilación con dos mililitros de agua y extraiga los productos perm-metilados mediante la adición de dos mililitros de diclorometano. Los glicolípidos se encuentran en la fase de diclorometano, que es la fase inferior, por lo que la fase superior puede transferirse a un nuevo tubo de vidrio.Los productos metilados per se pueden extraerse nuevamente con clorometano, para un total de tres extracciones. Lave los extractos combinados de clorometano tres veces con dos mililitros de agua, eliminando la fase acuosa superior tras cada lavado. Tras el lavado final, transfiera las muestras a un tubo nuevo y séquelas. Las muestras secadas con vacío de alta velocidad pueden disolverse entonces en 100 a 200 microlitros de metanol para el análisis por espectrometría de masas, realizado según se describe en el procedimiento escrito. Las muestras se enviaron a la instalación de proteómica del Centro de Cáncer MD Anderson de la Universidad de Texas y se analizaron mediante un espectrómetro de masas MALDI-TOF/TOF, así como mediante un espectrómetro de masas con trampa iónica LTQ.Se muestra aquí un ejemplo del análisis por MS con MALDI de los lípidos de glicodeditos de la línea celular de leucemia de rata RBL, un tipo de célula presentadora de antígenos que presenta antígenos de lípidos de glicodeditos a las células NKT. Los iones pueden asignarse a estructuras específicas de lípidos de glicodeditos en células RBL tratadas con el fármaco que inhibe la síntesis de lípidos de glicodeditos. Se observó una reducción significativa de todos los lípidos de glicodeditos.Los isómeros estructurales no pueden distinguirse. La capacidad msms del biosistemas 4,700 aplicado permite la fragmentación de iones MS uno en fragmentos MS dos, lo que permite obtener información estructural limitada. Sin embargo, el análisis MS dos a menudo no es suficiente para discriminar isómeros de oligosacáridos, mientras que el análisis por MS de trampa de iones de lípidos de glicohuellas permite el estudio de isómeros de oligosacáridos para detectar dichos isómeros.El IGB tres y el GB tres estándar se analizaron mediante múltiples rondas de fragmentación hasta encontrar diferencias, como se muestra en esta característica. Se puede elaborar una curva estándar basada en la abundancia iónica de los iones distintivos derivados de cada isómero, a partir del perfil MS cuatro de iones derivados del IGB tres o del GB tres cuando se mezclan diferentes proporciones de IGB tres y GB tres. En el ejemplo presentado aquí, se pudo discriminar entre el IGB tres y el GB tres comparándolos con los estándares.Este espectro representa el análisis MS cuatro de 1 3 2 5, el hierro molecular que representa los IMR de GB tres y los iones característicos de IGB tres para IGB tres, y los iones característicos para GB tres fueron detectados, lo que sugiere la presencia de una mezcla de los dos isómeros. La proporción de IGB tres a GB tres se calculó mediante comparación con una curva patrón. Al realizar este procedimiento, es importante recordar recuperar completamente los glicolípidos durante la cromatografía antes de la pro-metilación de los glicolípidos.Asegúrese de recuperar al menos 80 microgramos de glicolípidos durante la purificación. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar glicolípidos mediante un método semicuantitativo de espectrometría de masas. Dominará los pasos clave de la extracción de glicolípidos, la separación en fracciones neutras y ácidas, la modificación mediante reacción de permetilación y el envío de los glicolípidos modificados al servicio de espectrometría de masas.No olvide que trabajar con uno dos dicloro etano, cloroformo, ácido cloroacético y yodometano puede ser extremadamente peligroso y carcinogénico, y se deben tomar precauciones como el uso de guantes y bata de laboratorio durante la realización de este procedimiento. Respete las normas y disfrute de su descubrimiento.

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