Name: Extracción de los antígenos tisulares para Ensayos funcionales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprende a preparar extractos tisulares humanos para ensayos inmunológicos funcionales mediante homogeneización en BAW y liofilización. Este método libre de solventes tóxicos permite medir respuestas de células T con seguridad.

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Este trabajo es apoyado por becas de la Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC # 559007) y la Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF 4-2006-1025) y el Plan de Infraestructuras de Operaciones del Gobierno de Victoria. Damos las gracias a los miembros del equipo Tom Mandel Islet Programa de Trasplante de aislamiento de islotes para la prestación de los tejidos humanos. Los tejidos humanos fueron recogidos y utilizados con la aprobación ética local (Hospital de San Vicente HREC-A 011/04 y de la Salud de San Vicente HREC-A 135/08).

1. Preparación de tejido de bazo <ol><li> Nota-todo el material humano debe ser tratado como potencialmente infeccioso y todos los procedimientos deben llevarse a cabo en un gabinete de flujo laminar clase II. El uso de tijeras y pinzas estériles, quitar grasa y tejido fibroso a partir de secciones de bazo (~ 1-2 cm de tamaño) y recortar la mayor cantidad de material de la cápsula exterior como sea posible. </li><li> Cortar un trozo pequeño (1-2 cm 3) de tejido de bazo y colocar cada pieza en un tubo estéril Falcon de 50 ml. </li><li> Snap-congelar los trozos de tejido por inmersión en N 2 líquido. </li><li> Conservar a -80 ° C. Un protocolo similar es adecuado para otros tejidos (s). </li></ol> 2. Preparación de islotes humanos para almacenamiento <ol><li> Islotes Cultura CMRL medios de comunicación. Recoger islotes en un tubo de fondo cónico de 10 ml y lavar dos veces en PBS mediante centrifugación a 1.500 rpm durante 5 min. Retirar el PBS y drenar el buffer residual colocando el tubo invertido brevemente sobre una toalla de papel. Tenga cuidado de nopara desalojar a los islotes. </li><li> Una vez escurrido, vuelva a tapar el tubo y la presión por congelación en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C. </li></ol> 3. Preparación de Extracto <ol><li> Preparar BAW mix (10:30:60% v / v) y se almacena a 4 ° C. </li><li> Retire el tubo de -80 ° C. Descongelar a temperatura ambiente. </li><li> Añadir suficiente helado BAW para cubrir la pieza de tejido. Para usar islotes 3-5 ml. Para utilizar el tejido de bazo 10-20 ml, dependiendo del tamaño de la pieza de tejido. </li><li> Montar el homogeneizador de tejidos. Limpiar por &#39;homogeneizar&#39; 10-20 ml de 70% etanol / agua. </li><li> Homogeneizar el tejido en múltiples ráfagas, después de colocar la sonda en el tubo homogeneizador con el tejido y la solución BAW. Mantenga el tubo en un cubo de hielo a partir de entonces. </li><li> Limpiar a fondo el homogeneizador entre las muestras, por homogeneización de 10-20 ml de 70% de etanol / agua y luego tampón BAW. Esto evita la contaminación cruzada de tejido entre samples.Dismantleand limpia con 70% de etanol / agua después de nosotrose. </li><li> Si un extracto que contiene sólo el material soluble se requiere, centrifugar extracto de tejido homogeneizado a 4.000 rpm a temperatura ambiente durante 10 min. Si un extracto crudo se requiere más, centrifugar a 1.000 rpm a temperatura ambiente durante 5 min. La técnica más adecuada para la extracción de las proteínas insolubles en BAW depende del análisis de aguas abajo de las proteínas. Para uso en ensayos inmunológicos funcionales que sugeriría intentar disolver la fracción insoluble en urea 8 M como previamente hemos encontrado que esto se tolera bien 6. </li><li> Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y ponerlo en hielo. </li><li> Determinar la concentración de proteína en el extracto usando un ensayo de BCA o similar. </li></ol> 4. Congelar los extractos de secado <ol><li> Dependiendo de la masa de proteína requerida (es decir, 100 g por tubo), se diluye el homogeneizado en consecuencia y dispensar alícuotas en un recipiente etiquetado estéril 5,0 ml, Falcon (12x75 mm) tubos. Con frecuencia se utilizan 100 mg / tubo. </li><li> Utilice un 18-20 aguja jeringa estéril para hacer 3 agujeros en la tapa de cada tubo. </li><li> Congelar los tubos ya sea colocándolas en hielo seco durante ~ 10 min o en un congelador -80 ° C durante&gt; 1 h. Conservar a -80 ° C hasta el momento de poner en el liofilizador. </li><li> Conectar el liofilizador y permitir que se equilibre (-100 ° C). Esto tarda aproximadamente 30 min. </li><li> Dependiendo del volumen, el secado por congelación puede ser completado dentro de 3 horas, pero de manera rutinaria dejar las muestras durante la noche. </li><li> Después de la terminación del ciclo de secado, desconectar la bomba de vacío y lentamente permitir que la presión en la cámara. Quite la parrilla. </li><li> En una campana estéril, retire los tapones de los tubos perforados y sustituirlos por otros nuevos (Falcon 352.032). </li><li> Tienda de tubos a -20 ° C. Las muestras se pueden reconstituir en medios de cultivo, o tampones otros, y se utiliza en la función o ensayos bioquímicos. </li></ol> 5. Los resultados representativos La Figura 1 muestra la tinción de una proteínagel cargado con extracto de bazo y de islotes empobrecido tejido pancreático (etiquetado acinar) y se purificó islotes humanos (islotes marcados). Los resultados muestran una buena representación de las proteínas de peso molecular diferente para cada tejido. La capacidad de los extractos de tejido humano para estimular la proliferación de células T se ensayó usando un ensayo de proliferación de CFSE basado en 7 (Figura 2). El PBMC utilizado en este ensayo fueron aisladas de un individuo con diabetes tipo 1. La magnitud de la respuesta se expresa como una relación del número de células CFSE dim por 5.000 CD4 +, células CFSE brillantes sin antígeno: de células CFSE dim por 5.000 CD4 +, células CFSE luminosas con antígeno de 7 muestras por triplicado. Los resultados muestran una débil, pero la proliferación detectable, en respuesta a acinar (CD1 = 3,5) y una respuesta más fuerte con el extracto de islote (6,8). Virus de la influenza inactivado (CDI = 142,6) se incluye como unacontrol positivo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4230/4230fig1.jpg" /> Figura 1. Gel de proteína. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4230/4230fig2.jpg" /> Resultados de la figura 2. De un ensayo de proliferación CFSE basado contra acinar y extracto de islotes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4230/4230fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> .

<ol><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+approaches+to+measuring+human+islet-antigen+specific+T+cell+function+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).</li>
<li>Beckhove, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+T+cell-based+identification+of+human+tumor+tissue+antigens+by+automated+two-dimensional+protein+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation.</a> J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).</li>
<li>Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+insights+into+CD4%2B+T-cell+specificity+and+function+in+Type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+A-chain+of+insulin+is+a+hot-spot+for+CD4%2B+T+cell+epitopes+in+human+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insulin+A-chain+epitope+recognized+by+human+T+cells+is+posttranslationally+modified%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified.</a> J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).</li>
<li>Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+extracting+tissue+proteins+for+use+in+lymphocyte+function+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays.</a> Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+Cell+Proliferation+in+Response+to+GAD+and+Proinsulin+in+Healthy%2C+Pre-diabetic%2C+and+Diabetic+Donors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).</li>
<li>Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+T-cells+recognise+N-terminally+Fmoc-modified+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide.</a> Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).</li>
<li>Peakman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+preparations+of+GAD65%2C+proinsulin%2C+and+the+islet+tyrosine+phosphatase+IA-2+for+use+in+detection+of+autoreactive+T-cells+in+type+1+diabetes%3A+report+of+phase+II+of+the+Second+International+Immunology+of+Diabetes+Society+Workshop+for+Standardization+of+T-cell+assays+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).</li>
<li>Honey, K., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+cysteine+proteases+regulate+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Este protocolo fue desarrollado porque queríamos generar un extracto de tejido humano que estaba libre de productos químicos tóxicos como detergentes. Específicamente, se han utilizado para preparar los extractos de tejido humano que se pueden utilizar en ensayos de la función inmune humano in vitro. Los extractos preparados usando este protocolo también se puede reconstituir en cualquier tampón y se utiliza para muchos análisis bioquímicos, tales como la cromatografía de Western Blot o líquido. Esto hace que e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> 5 ml 12 x 75 mm tubos de poliestireno estériles </td><td> BD Falcon </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> Tapones para tubos de tubos de poliestireno (arriba) </td><td> BD Falcon </td><td> 352032 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de 50 ml estériles </td><td> Becton Dickinson </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> Acetonitrilo </td><td> Mallinckradt Químicos </td><td> 2856-10 </td><td></td></tr><tr><td> Butan-1-ol </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 537993-IL </td><td></td></tr><tr><td> Homogeneizador: PRO200 </td><td> Bio-estrategia </td><td> 01-01200 </td><td> 10 x 115 mm de diente de sierra generador </td></tr><tr><td> Liofilizador </td><td></td><td></td><td> Virtis, Benchtop 4K </td></tr><tr><td> Aguja estéril de calibre 18-20 </td><td> Becton Dickinson </td><td> REF 302032 </td><td></td></tr><tr><td> CMRL-1066 Medium </td><td> Sigma </td><td> C0422 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Reactivos y equipos específicos.

extracción de los antígenos tisulares para ensayos funcionales

Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

Muchos de los objetivos de antígeno de la respuesta inmune adaptativa, reconocidos por células B y T, no se han definido 1. Esto es particularmente cierto en las enfermedades autoinmunes y el cáncer 2. Nuestro objetivo es investigar los antígenos reconocidos por las células T en la enfermedad de tipo 1 autoinmune diabetes 1,3,4,5. Para analizar humanos respuestas de células T contra el tejido en el que los antígenos reconocidos por las células T no se identifican hemos desarrollado un método para extraer antígenos de proteínas a partir de tejido humano en un formato que es compatible con los ensayos funcionales 6. Respuestas previamente, las células T a los extractos de tejido no purificados no se pudo medir debido a que los métodos de extracción de producir un lisado que contiene detergentes que eran tóxicas para las células humanas mononucleares de sangre periférica. Aquí se describe un protocolo para la extracción de proteínas de los tejidos humanos en un formato que no es tóxico para las células T humanas. El tejido se homogeneizó en una mezcla de butan-1-ol, acetonitrilo y water (BAW). La concentración de proteína en el extracto de tejido se mide y una masa conocida de la proteína se dividió en alícuotas en tubos. Después de la extracción, los disolventes orgánicos se eliminan por liofilización. Extractos de tejidos liofilizadas pueden almacenarse hasta que se necesite. Para uso en ensayos de la función inmunitaria, una suspensión de células inmunes, en medios de cultivo apropiados, se puede añadir directamente al extracto liofilizado. La producción de citocinas y la proliferación de PBMC, en respuesta a los extractos preparados con este método, se mide fácilmente. Por lo tanto, nuestro método permite la rápida preparación de lisados ​​de tejidos humanos que se pueden utilizar como fuente de antígenos en el análisis de las respuestas de células T. Se sugiere que este método facilitará el análisis de la respuesta inmune adaptativa a los tejidos en el trasplante, el cáncer y la autoinmunidad.

Un protocolo simple de preparar los extractos de tejido humano para ser utilizado como una fuente de antígenos funcionales en ensayos de células T se describe. Este método permite respuestas de células T a los antígenos derivadas de tejido a medir<em&gt; In vitro</em&gt;.

Extracción de los antígenos tisulares para Ensayos funcionales

Muchos de los antígenos diana de la respuesta inmunitaria adaptativa, reconocidos por las células B y T, no han sido definidos 1. Esto es particularmente cierto en las enfermedades autoinmunes...

El objetivo general de este procedimiento es preparar un extracto tisular compatible con ensayos inmunológicos funcionales. Esto se logra primero recolectando una muestra del tejido de interés. A continuación, se homogeniza la muestra de tejido en una mezcla de butanol, aceto, nitrilo y agua, o BAW.Tras determinar la concentración de proteína, el extracto se distribuye y liofiliza para eliminar los disolventes. Finalmente, el extracto reconstituido se utiliza como fuente de antígeno en ensayos de proliferación de linfocitos T humanos o de secreción de citoquinas. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la lisis con detergentes es que el extracto obtenido está libre de disolventes tóxicos y detergentes.En este protocolo, todos los materiales humanos deben manejarse como potencialmente infecciosos, y todos los procedimientos deben realizarse en una cabina de flujo laminar de clase dos. Utilizando tijeras y pinzas estériles, retire la grasa y el tejido fibroso de secciones de bazo de aproximadamente uno a dos centímetros de tamaño. Elimine la mayor cantidad posible del material de la cápsula externa.Corte pequeños fragmentos de tejido esplénico y coloque cada fragmento en un tubo estéril Falcon de 50 mililitros con tapa hermética. Congele los fragmentos de tejido por inmersión en nitrógeno líquido y almacene a menos 80 grados Celsius. Para iniciar el procedimiento de preparación de fragmentos oculares humanos para cultivo de almacenamiento.Incube los orificios en medio CMRL a 37 grados Celsius. Recolecte los orificios en un tubo cónico de 10 mililitros y centrifugue a 1.500 RPM durante cinco minutos. Deseche el medio y lave dos veces con PBS tras el segundo lavado.Vierta el PBS y drene el tampón residual colocando brevemente el tubo boca abajo sobre una toalla de papel. Tenga cuidado de no desalojar los orificios. Una vez drenado, coloque la tapa del tubo, congélelo rápidamente en nitrógeno líquido y almacénelo a menos 80 grados Celsius.Para preparar un extracto de tejido, primero retire un tubo que contenga el tejido de menos 80 grados Celsius y déjelo a temperatura ambiente. El tejido se homogenizará en una mezcla de butanol, acetonitrilo y agua, o BAW, que se ha preparado previamente y almacenado a cuatro grados Celsius. Añada suficiente BAW frío con hielo para cubrir el trozo de tejido; para el tejido de bazo utilizado en esta demostración, use de 10 a 20 mililitros de BAW.Arme el homogenizador de tejidos. Limpie el homogenizador homogenizando 20 mililitros de etanol al 70% en agua. A continuación, coloque la sonda del homogenizador en el tubo con el tejido y la solución BAW y homogenice el tejido en múltiples pulsos.Mantenga el tubo en un buen recipiente posteriormente para evitar la contaminación cruzada entre muestras de tejido. Limpie cuidadosamente el homogenizador entre muestras homogeneizando de 10 a 20 mililitros de etanol al 70% en agua, seguido de centrifugación con tampón BAW. El extracto de tejido homogeneizado a temperatura ambiente.Si se requiere un extracto que contenga únicamente material soluble, centrifugue a 4.000 RPM durante 10 minutos. Si se requiere un extracto más crudo, después de la centrifugación, centrifugue a 1.000 RPM durante cinco minutos, transfiera el sobrenadante a un tubo limpio y colóquelo en hielo. Posteriormente, se determina la concentración de proteína en el extracto mediante un ensayo BCA o similar.El paso más importante de este protocolo es medir con precisión la concentración de proteína en el extracto para que se pueda liofilizar un volumen adecuado del extracto. Para obtener la masa deseada de proteína, primero se debe diluir el homogenato según la cantidad de proteína requerida y distribuir alícuotas en tubos estériles de cinco mililitros etiquetados. En este ejemplo, se asignan 100 microgramos de proteína por tubo.Utilice una aguja estéril de calibre 18 a 20 para hacer tres orificios en la tapa de cada tubo. Enfríe los tubos colocándolos sobre hielo seco durante aproximadamente 10 minutos. Encienda el liofilizador y déjelo equilibrar hasta alcanzar menos 100 grados Celsius. Esto tomará unos 30 minutos. Cuando el liofilizador esté listo, coloque los tubos en el liofilizador y encienda la bomba de vacío.Dependiendo del volumen del extracto, la liofilización puede completarse en tres horas, aunque habitualmente las muestras se dejan durante la noche. Una vez finalizado el ciclo de secado, apague la bomba de vacío y permita lentamente la entrada de presión en la cámara.Retire el soporte de tubos en una cabina estéril. Retire las tapas perforadas de los tubos y sustitúyalas por tapas nuevas. Almacene los tubos a menos 20 grados Celsius.Las muestras pueden ser posteriormente reconstituidas en cultivo, medio o tampones adicionales y utilizadas en función de ensayos bioquímicos. Esta figura muestra la tinción de un gel de proteínas cargado con extractos de tejido pancreático del que se han eliminado los islotes esplénicos, y de islotes humanos purificados. Estos resultados muestran una buena representación de proteínas de diferentes pesos moleculares para cada tejido; se evaluó la capacidad de los extractos de acinos e islotes para estimular la proliferación de linfocitos T humanos mediante un ensayo de proliferación en el que se marcaron células mononucleares de sangre periférica, o PBMC, con el colorante fluorescente CFSE; las células que proliferaron en respuesta al antígeno, con la consiguiente reducción en la intensidad de CFSE, se midieron directamente mediante citometría de flujo.Las PBMC utilizadas en este ejemplo se aislaron de un individuo con diabetes tipo uno. La magnitud de la respuesta de células C se expresó como la razón entre el número de células CFSE tenues por cada 5.000 células CD4 positivas CFSE intensas sin antígeno y el número de células CFSE tenues por cada 5.000 células CD4 positivas CFSE intensas con antígeno, provenientes de muestras en triplicado. Los resultados muestran una proliferación débil pero detectable en respuesta a Asana, con un índice de división celular o CDI de 3,5.Hubo una respuesta más intensa al extracto de tejido con un CDI de 6,8. El virus de la influenza inactivado se incluyó como control positivo siguiendo este procedimiento. Otros métodos como Ali Spot o e Iza pueden utilizarse para responder preguntas adicionales, como qué citocinas se secretan en respuesta a antígenos derivados de tejidos.

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Investigación

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Biología

Un protocolo para la preparación de los sólidos, los pequeños extractos nucleares HeLa se describe. Este protocolo es muy valioso para los ensayos que requieren el uso de pequeñas poblaciones de células, como las células tratadas con drogas o RNAi. El método debe ser aplicable a una amplia variedad de ensayos de expresión de genes y otros tipos de células, incluyendo células del paciente.

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