Name: Colmatar a interface Bio-eletrônico com Biofabrication (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 38 s
Description: Aprenda a técnica de biofabricação para depositar filmes polissacarídeos em eletrodos e funcionalizá-los com proteínas e células. Este método simplifica a criação de interfaces bio-eletrônicas para aplicações em dispositivos lab-on-a-chip.

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Reconhecemos o financiamento de DTRA de apoio do manuscrito e do ONR, DTRA, e NSF para apoio parcial da pesquisa subjacente.

1. Eletrodeposição de alginato <ol><li> Conecte uma fonte de alimentação para os eletrodos fabricados sob medida através de patch cords utilizando jacaré. Um óxido de estanho índio (ITO) coberto lâmina de vidro irá atuar como o ânodo (eletrodo de trabalho) e folha de platina servirá como catodo (contra-eletrodo). Posicionar os eléctrodos de modo a superfície de ITO para ser funcionalizada se opõe ao contra-eléctrodo e está posicionado verticalmente para ser mergulhada em uma solução ou horizontalmente de modo que a solução de deposição está contido na superfície. </li><li> Preparar uma solução de alginato de deposição através da mistura de alginato de 1% e 0,5% CaCO 3 (em peso) em água destilada e, em seguida, a autoclavagem a solução. Recomenda-se a agitar a solução continuamente quando não em uso. </li><li> Submergir os dois eléctrodos para a solução de deposição. O alginato utilizado pode ser marcado por fluorescência com Fluoroesferas (Invitrogen), como por Cheng et al. 14, para permitir fluorescence formação de imagens do filme resultante. </li><li> Aplicar uma densidade de corrente constante (3 A / m 2) durante 2 minutos; tensão irá deslocar dentro da gama de 2-3 V. </li><li> Desligue o eléctrodo e remover a solução não depositadas. Suavemente enxaguar o filme com NaCl (0,145 M) para remover alginato supérflua. </li><li> Incubar a brevemente película (~ min 1) em CaCl2 (0,1 M) para reforçar o gel. Lavar com NaCl (0,145 M) e incubar em uma solução desejada suplementado com CaCl2 (1 mM). </li><li> Imagem utilizando um microscópio de fluorescência (Figura 1B). </li></ol> 2. Codeposição de populações de células comunicantes em alginato <ol><li> A cultura de células sinal remetente (W3110 Escherichia coli em peso), cultivados em meio LB, e uma cultura de células sinal do receptor-(MDAI2 + pCT6-LSRR - amp r + pET-dsRed - kan r), cultivados em meio LB + 50 ug / ml cada de canamicina e ampicilina, deve ser crescido durante a noite umand re-inoculado para o crescimento até uma densidade óptica (a 600 nm) de 1. Ajustar a densidade óptica da cultura de células receptor para 0,4-0,6 com LB antes da utilização. </li><li> Prepara-se uma solução de deposição de alginato a 2% e 1% de CaCO 3, e misturar com cada cultura de células em uma proporção de 1:1 para uma concentração final de alginato de 1%, 0,5% de CaCO 3, com as células diluídas para uma densidade de cerca de meia a densidade de cultura. </li><li> Usar uma lâmina de vidro modelado com dois eléctrodos de ITO contidos por um polidimetilsiloxano (PDMS) bem (preparado de acordo com as instruções Sylgard e cortado no tamanho desejado) e um contra-eléctrodo de platina. Ligue um eléctrodo ITO a uma fonte de alimentação com a platina como descrito no Processo 1 (electrodeposição alginato). </li><li> Mergulhar os eléctrodos em uma solução de deposição contendo as células do receptor. Ajuste o fornecimento de energia para uma corrente constante a uma densidade de 3 A / m 2, onde a dimensão área de superfície é definida pela único eléctrodo em que Deposition vai ocorrer. </li><li> Aplicar a corrente durante 2 minutos para permitir a codeposição das células na matriz de alginato. </li><li> Lavar o filme, tal como descrito no Passo 1,5. </li><li> Mude a conexão anódica para o segundo, eletrodo, adjacente ITO. </li><li> Repetir o procedimento de deposição (Passos 2,4 - 2,7), mas desta vez a introdução da solução contendo as células de remetente. </li><li> Incubar o chip 2-eléctrodo contendo células codeposited e de alginato de cálcio durante a noite a-37 ° C em tampão fosfato salino (PBS) suplementado com meio LB a 10% e 1 mM de CaCl2. </li><li> Após incubação da imagem, utilizando um microscópio de fluorescência (Figura 2B). </li></ol> 3. Eletrodeposição Chitosan <ol><li> Conecte a fonte de alimentação para os eletrodos através jacaré. Um chip de silício revestido de ouro irá atuar como o catodo (eletrodo de trabalho) e uma folha de platina servirá como o ânodo (contra-eletrodo). Posicione a superfície do eletrodo de ouro, de modo ªem que se opõe ao contra-eléctrodo e ambos estão posicionados verticalmente para ser mergulhada em uma solução ou horizontalmente de modo que a solução de deposição está contido na superfície. </li><li> Prepara-se uma solução de quitosano por mistura de quitosano flocos em água e adicionando lentamente HCl 2 M para dissolver os polissacarídeos (pH final 5,6), certificando-se a seguir o procedimento descrito por Meyer et al. 15. </li><li> Colocar os eléctrodos em uma solução de quitosano (0,8%), completamente submergindo a área desejada para a deposição. A quitosana utilizada pode ser marcado por fluorescência com 5 - (e-6)-carboxyrhodamine 6G succinimidil éster (Invitrogen), como por Wu et al 8, para a imagem da película electricamente por microscopia de fluorescência.. </li><li> Aplicar uma densidade de corrente constante (4 A / m 2) durante 2 minutos. Voltagem irá deslocar dentro da gama de 2-3 V. Calcular a densidade de corrente como uma função da área de superfície de ouro do eléctrodo de trabalho exposto ao Depositiosolução de n. </li><li> Lavar o eléctrodo com água DI para remover supérfluo quitosana. O chip pode ser armazenado em água ou PBS (10 mM, pH 7,0). </li><li> Imagem utilizando um microscópio de fluorescência (Figura 3C). </li></ol> 4. Eletroquímica Transdução com um filme de quitosana funcionalizada <ol><li> Codeposit oxidase de quitosano e glicose (GOx) de uma solução (1% de quitosano, 680 U / mL GOx, pH 5,6) com uma densidade de corrente de 4 A / m 2 para um eléctrodo modelado de acordo com o Procedimento 3 (electrodeposição quitosana). Uma película de quitosano aprisionado em GOx será gerado. </li><li> Anexar o eléctrodo tratada para um sistema de eléctrodos de três como o eléctrodo de trabalho, um fio de platina como o contra-eléctrodo e Ag / AgCl como o eléctrodo de referência, tal como descrito na Figura 4A. </li><li> Mergulhar os eléctrodos em uma solução tampão de fosfato (0,1 M, pH 7,0) contendo NaCl (0,1 M). </li><li> Electroquimicamente conjugar a proteína para a quitosanapelícula através da aplicação de uma tensão constante (0,9 V) por 60s usando cronoamperometria 10. </li><li> Colocar o chip em tampão de fosfato (0,1 M, pH 7,0) e lava-se durante 10 minutos num agitador orbital para remover qualquer GOx que não reagiu de NaCl e não conjugado. </li><li> Voltar a ligar para o sistema de eléctrodo de três conforme descrito no passo 4,2 e imerso numa solução de glucose a 5 mM. Usando voltametria cíclica, varrer o potencial numa direcção positiva para 0,7 V. Use uma película de controlo não contendo oxidase de glicose como uma comparação para a quantidade de oxidação visto na varrimento (Figura 4B). </li><li> Remover os eléctrodos a partir da solução de glucose e lavar com tampão de fosfato (0,1 M, pH 7,0), em seguida, se os eléctrodos para um copo de 10 ml contendo 8 ml de tampão fosfato (0,1 M, pH 7,0). Viés o chip GOx-funcionalizado a 0,6 V para servir como o eléctrodo de trabalho (Figura 4C). </li><li> Adicionar alíquotas de glicose para o tampão (cada alíquota aumenta a concentração de glucose por4 mM). </li><li> Gerar uma curva padrão entre a corrente de estado estacionário ea concentração de glucose para o filme de quitosano GOx-funcionalizado. </li></ol> 5. Funcionalização proteína enzimática usando assembly <ol><li> Usar uma lâmina de vidro modelado com uma ouro adjacente e eléctrodo ITO contido dentro de um poço PDMS. Polarização do eletrodo de ouro com um potencial catódico para electrodeposit quitosana como mostrado anteriormente. Lavar filme brevemente em água Dl e, em seguida, PBS, com uma pipeta. </li><li> Adicionar uma solução de 3 uM azul fluorescente etiquetado &quot;Sintase AI-2&quot; 16 (usando um kit de rotulagem DyLight) + 100 U / mL de tirosinase em PBS. </li><li> Incubar durante 1 h à temperatura ambiente, em seguida, lavar o filme com PBS. </li><li> Aplicar um potencial anódico para o eléctrodo ITO para codeposit uma solução de deposição de alginato contendo células de receptor (tal como preparado no passos 2.1-2.2). Siga os passos de 2,3-2,6 de Processo 2 (codeposição de populações de células em alginato). </li><li> Para geraro sinal transmitido (AI-2) enzimaticamente, após enxaguamento dos filmes adicionar uma solução de 500 uM de homocisteína S-adenosil-(HAS) em PBS suplementado com 10% LB meios de comunicação e CaCl 1 mM 2. Cobrir os eléctrodos, para evitar a evaporação da solução e incubar durante a noite a 37 ° C. Isto irá permitir a uma resposta de células receptor através da geração de uma proteína fluorescente vermelha (dsRed). </li><li> Eléctrodos adjacentes podem ser trabalhada com microscopia de fluorescência, ajustando os filtros para capturar a fluorescência azul do Sintase AI-2 e fluorescência vermelha expressos pelas células do receptor codeposited (Figura 5B). </li></ol> 6. Os resultados representativos Impostas sinais eléctricos pode criar microambientes localizadas (por exemplo, campos e gradientes) perto de uma superfície do eléctrodo e estes estímulos pode desencadear a auto-montagem de polissacáridos tais como alginato e quitosana para depositar como uma película de hidrogel na superfície do eléctrodo. Porque ta sua transição sol-gel ocorre na superfície do eléctrodo, o filme resultante é electroaddressed, com a sua geometria correspondente ao padrão de eléctrodo (Figuras 1B, 3C). Filmes biocompatíveis tais como alginato e quitosano proporcionar superfícies que podem ser funcionalizados com componentes biológicos. Usando alginato, as populações de células únicas foram codeposited em endereços separados. Prova da sua electroaddressment é observada na interação entre o emissor eo receptor população de células. A molécula autoinducer-2 (AI-2) difunde-se a partir das células remetente e é absorvido pelas células do receptor, resultando na expressão da proteína de vermelho dsRed fluorescente (Figura 2A). Na Figura 2B, fluorescência vermelha é observado apenas no eléctrodo onde os receptores são tratados. Os grupos amina presentes na quitosana fornecê-lo com a capacidade de resposta pH requerido para a electrodeposição, bem como uma superfície adequada para funcionalização. Nósutilizaram estas propriedades únicas por electroquimicamente conjugando a glicose oxidase biosensoriamento enzima (GOx) para electrodepositados quitosano filmes. Esta enzima, em seguida, fornece a capacidade para a detecção de glucose através de uma reacção enzimática (Figura 4A) produção de peróxido de hidrogénio que pode então ser oxidado para produzir electroquimicamente uma corrente de saída. Desta forma, um sinal químico pode ser transduzida para Figura eléctrica. 4B mostra que os filmes em que GOx foi electroquimicamente conjugado produzir um sinal forte anódico na presença de glicose, em oposição a estas películas não contendo GOx. Estes resultados indicam GOx pode ser montado sobre uma película de quitosano depositados e irá reter a actividade catalítica. Além disso, a Figura 4C mostra um passo no aumento-corrente anódica produzida em resposta a concentrações de glicose crescentes. A curva padrão também presente na Figura 4C mostra que os aumentos passo-prosseguiu em uma fas quase linearhion dependente da quantidade de glucose adicionada. Estes resultados mostram que a enzima também retém a sua sensibilidade para aumentar as concentrações de glucose em cima de conjugação com o filme de quitosano. O limite inferior de detecção não foi estudada aqui como foi anteriormente caracterizados para este sistema na obra de Meyer et. ai. Nós também têm demonstrado a imobilização covalente de uma enzima de interesse, engenharia para conter uma marca de penta-tirosina personalizado, a quitosana de uma forma enzimaticamente controlada. Especificamente, este processo é mediado pela enzima tirosinase. Como representado pelo esquema na Figura 5A (superior), uma enzima, AI-2 Sintase inclui uma marca penta-tirosina. Tirosinase actua sobre a marca de tirosina, oxidando os resíduos dos grupos de fenol a O-quinonas, que então covalentemente se ligam a aminas de quitosano de. Evidência de quitosano funcionalização película com a Sintase AI-2 por tirosinase montagem é observado na Figura 5B </strong&gt;, onde a Sintase AI-2 foi marcado por fluorescência azul. Devido AI-2 Sintase gera AI-2 a partir do substrato S-adenosil-homocisteína (HAS), da mesma forma como as células de remetente, a sua proximidade com as células do receptor codeposited na presença de HSA também faz com que as células receptoras para responder fluorescentemente expressando dsRed (Figura 5A (inferior)). Fluorescência vermelha das células do receptor (Figura 5B) demonstra novamente interacção entre os endereços devido à difusão de AI-2 a partir de um para o outro, e indica ainda que as enzimas imobilizadas para quitosano mantenham a actividade de uma vez ligado covalentemente. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4231/4231fig1.jpg" /> Figura 1. Electrodeposição alginato. (A) Mecanismo de electrodeposição alginato: Como um eléctrodo é anodicamente enviesada, a electrólise da água ocorre na sua superfície, gerando um pH baixo localizada. Partículas de carbonato de cálcio reagem com o excedentede protões, libertando catiões de cálcio como as partículas se dissolvem. Na presença de cadeias de polímero de alginato, os iões tornam-se quelatado em um &quot;eggbox&quot; rede, formando um hidrogel reticulado no eléctrodo. À medida que a distância a partir dos aumentos de eléctrodos, alginato tem uma maior tendência para permanecer em solução, devido à presença reduzida de iões de cálcio. (B) Uma forma de L modelado eléctrodo ITO foi utilizado para alginato electrodeposit. Um PDMS poço foi fixada ao eléctrodo para conter um alginato verde fluorescentemente marcado com (1%) e CaCO 3 (0,5%) de solução de deposição. Após eletrodeposição durante 2 min. a uma densidade de corrente de 3A / m 2, o hidrogel de alginato electroaddressed foi fotografada por microscopia de fluorescência. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4231/4231fig2.jpg" /> Figura 2. Codeposição de populações de células. (A) Esquema mostrando a interação entre dois E. cepas de Escherichia: Uma população produz autoinducer-2 (AI-2), Uma molécula de sinalização, e é denominado &quot;remetente AI-2.&quot; A outra população, chamada de &quot;receptor AI-2,&quot; é um repórter do AI-2; após o recebimento do AI-2 pela difusão do remetente, que expressa a proteína fluorescente vermelha dsRed. (B) Red imagem da fluorescência de par de eletrodos com a população AI-2 remetente codeposited com alginato no eletrodo à esquerda e AI-2 receptor população codeposited com alginato sobre um eletrodo de direito. Vista ampliada mostrando a expressão dsRed de apenas os receptores AI-2. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4231/4231fig3.jpg" /> Figura 3. Electrodeposição quitosana. (A) Esquema mostrando a electrodeposição dependente do pH do quitosano. Electrólise água a um eléctrodo de catodicamente enviesada faz com que um pH localizada elevada (mostrada por uma mudança de cor localizada de um corante indicador de pH próximo do cátodo na micrografia), que estimula a transição sol-gel de quitosano nesta região. (B) As aminas apresentar em quitosana dar it pH responsivos propriedades. Acima de um pH de 6,3 (pKa do quitosano) as aminas são desprotonados, facilitando uma transição a partir da sua forma protonada solúvel para a sua forma de gel insolúvel. (C) Um eléctrodo de ouro modelado foi utilizado para electrodeposit quitosano. O eléctrodo, ligado catodicamente à fonte de alimentação, foi imerso em um verde fluorescente marcada com quitosana (0,8%) de solução de deposição. Após eletrodeposição durante 2 min. a uma densidade de corrente de 4 A / m 2, o filme de quitosano electroaddressed foi fotografada por microscopia de fluorescência. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/4231/4231fig4.jpg" /> Figura 4. Transdução Electrochemical com uma película de quitosano funcionalizado. (A) esquemático, mostrando a configuração de um sistema de eléctrodo três. Película de quitosano funcionalizado serve como eléctrodo de trabalho, um fio de platina como o eléctrodo contador e Ag / AgCl como o eléctrodo de referência. Eletroquímica transdução das receitas de glicose através ªelectrónicos reacções enzimáticas e electroquímico mostrados onde o peróxido de hidrogénio produzido pode ser oxidado e detectado no eléctrodo de trabalho. (B) Cyclic voltammagram (CV) com eléctrodo com uma película contendo quitosana da glicose-oxidase electroquimicamente conjugado (GOx) mostra um sinal forte anódica em uma solução de glicose 5 mM. Uma película contendo nenhum GOx serviu como um controlo e exibido nenhum sinal na mesma solução. (C) Uma curva padrão entre a corrente anódica e da concentração de glucose apresenta uma relação quase linear (cada alíquota aumentou a concentração de glicose por 4 mM e também aumentou a amplitude da corrente no gráfico de inserção de uma forma passo a passo). <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/4231/4231fig5.jpg" /> Figura 5. Funcionalização proteína utilizando montagem enzimática. (A, superior) Esquema mostrando-tirosina com a tag &quot;AI-2 Sintase&quot; sendo covalentemente ligado a um filme de quitosana por montagem tirosinase. Os resíduos de tirosina-se óxidozada a O-quinonas por acção da tirosinase e pode reagir com grupos amina sobre o filme de quitosano, formando uma ligação covalente. (A, inferior) A Sintase AI-2 gera AI-2 a partir de um substrato (HAS), as células do receptor relatar o gerado AI-2 por expressão de fluorescência dsRed. (B) imagens de fluorescência mostrando um filme de quitosana em ouro, funcionalizadas com azul marcado Sintase AI-2. Adjacente, AI-2 células receptoras são codeposited com alginato sobre ITO. Após a adição do substrato enzimático para o poço e incubação, as células AI-2 receptor expresso dsRed.

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Produção e acesso gratuito a este artigo é patrocinado pela Agência dos Estados Unidos Defesa Redução de Ameaças.

Nossos procedimentos demonstrar a eletrodeposição e funcionalização de filmes de biopolímeros, um processo que chamamos biofabrication. Através funcionalização com células e biomoléculas que criar superfícies biológicas capazes de interagir com o outro eo endereço do eléctrodo são montados em cima. O primeiro passo, a electrodeposição, tem lugar através da desencadeada a auto-montagem de biopolímeros alginato, e quitosano nos nossos estudos, em resposta a um sinal eléctrico. Como afirmado anteriormente um gradiente de pH é gerada, que pode ser controlada pela densidade de corrente e do tempo de deposição, proporcionando controle adicional sobre as dimensões de película e as propriedades 6,17. Verificou-se que uma variedade de densidade de corrente e combinações tempo de deposição pode ser usado para os eléctrodos indicados na Tabela 1. Embora o uso de outros eléctrodos é viável, os ajustes do procedimento seria necessário. Em comparação com outras técnicas de formação de película, o processo de electrodeposição é simples, rápido e reagentless. Não há necessidade de um extenso repertório de equipamento caro e preparações laboriosos. Importante, o processo pode suportar menores desvios experimentais e pode ser facilmente começou tudo de novo se ocorrer um problema. O quitosano é capaz de responder a um gradiente de pH elevado devido à catódica importantes propriedades funcionais atribuídas a ela por um elevado teor de aminas primárias. A pH elevado (maior do que o seu pKa de ~ 6,3) as aminas são desprotonados e quitosana torna-se insolúvel, permitindo a formação do filme. Após a deposição, os filmes continuarão a ser ligado ao eletrodo. No entanto, a capacidade existe para delaminar-los, se desejado. Os filmes irá manter-se estável, enquanto o pH da solução não cair abaixo do pKa. Soluções ácidas protonar as aminas e os repulsões electrostáticas subsequentes inchar o gel até que se dissolva 18. Ou seja, o processo de montagem / desmontagem é reversível com a demanda e alows para remoção de filmes depositados e reutilização dos eletrodos. Convenientemente, o intervalo de pH em que a transição sol-gel tem lugar é próximo daquele em que os componentes mais biológicos funcionar optimamente. Isto torna o processo ideal para a retenção de funcionalidade durante a montagem 6. Formação do filme de alginato é facilitada pela electrólise anódica de água, bem como a presença de carbonato de cálcio 7. O pH baixo localizada no ânodo solubiliza o carbonato de cálcio que conduz para os catiões de cálcio de libertação. Estes iões são quelados com alginato, formando uma rede de ligações cruzadas na superfície do eléctrodo. Filmes de alginato são notavelmente reversível por competição para os iões de cálcio a partir de outros compostos quelantes tais como citrato ou de EDTA, que podem ser utilizados para dissolver os filmes, que permitem a reutilização dos eléctrodos subjacentes. Assim, os filmes de alginato são relativamente frágeis quando submetido a condições fisiológicas, porque os iões de cálcio são facilmente scavenged a partir da matriz de gel, enfraquecendo sua estrutura e promovendo filme delaminação ou redissolução. Para superar esta limitação, incluímos um passo de incubação para o filme em 1 M de CaCl2 para reforçar o gel. Além disso, é recomendável que a solução do filme de incubação (meio de células, etc) ser suplementado com CaCl2 a uma concentração de 500 mM iM-3. O segundo procedimento importante é a funcionalização do filme depositado com relevantes componentes biológicos. Isto pode ser conseguido de duas formas, sendo a primeira conjugação electroquímica, uma estratégia que permite a montagem rápida, reagentless de proteínas com controlo espacial excepcional 10. No entanto, funcionalização desta maneira é limitada pela difusão de Cl - iões através da película para o eléctrodo, bem como a difusão de HOCl, o reactivo gerado intermediário, de volta para fora para a solução. A capacidade das moléculas de electroquimicamente activas para passaratravés da película permite a transdução de produtos químicos e biológicos em sinais fácil de ler eléctricos sinais 15. Nós mostramos tirosinase acoplamento mediado como uma segunda estratégia para funcionalização enzima para quitosano, demonstrada por ligação covalente AI-2 sintase. Esta estratégia permite que o processo de funcionalização de ser controlada e selectiva - dependente de um reagente específico, a tirosinase, que actua sobre as proteínas discriminately contendo uma marca de tirosina 9. Nós mostramos a utilidade e biocompatibilidade dos sistemas multi-endereço, replicando vias naturais em um chip. Primeiro, organizou duas populações de células (ou seja, &quot;remetentes&quot; e &quot;receptores&quot;) em endereços distintos, e mostrou que eles interagiram através de eletrodos adjacentes para entregar AI-2 e gerar uma resposta de fluorescência. Este conceito também tem sido demonstrada por Cheng et al. em um chip microfluídico 14. Nós também imitou a interação, mas sim usadouma enzima para sintetizar AI-2 para a entrega. Desta forma, uma via de síntese intracelular, AI-2 de síntese, foi replicado através biofabrication e funcionava muito como seria na solução. Em ambos os casos, a montagem de vários endereços apresenta o desafio de evitar a ligação não específica entre endereços porque cada solução de deposição deve ser introduzido no conjunto de eléctrodos inteiro, mesmo que a electrodeposição destina-se apenas a um endereço. Lavagem suave ainda completa pode remover a maioria da solução residual de enviesadas não-eléctrodos, a utilização de escoamento em canais microfluídicos pode minimizar ainda mais a especificidade de retenção. Particularmente para o biofabrication adjacente de quitosano e endereços de alginato, é recomendável depositar a película de quitosano em primeiro lugar, seguindo este com passos biofunctionalization, e depois deste, eletrodeposição alginato. Embora não tenhamos feito isso aqui, descobrimos que o bloqueio do filme de quitosana com proteínas inertes (como milk, BSA, etc) diminui grandemente a ligação não específica de moléculas indesejadas a superfície aminada quitosana da. Foram encontradas utilidade no estabelecimento de eletrodos padronizados, freqüentemente encontrados em dispositivos BioMEMS, como os &quot;Blueprints&quot; para um arranjo complexo de células e biomoléculas. Os usos da quitosana eletrodepositado em bioMEMS dispositivos podem ir muito além dos exemplos mencionados aqui 19. O quitosano pode ser depositado em várias geometrias microescala - tais como em microcanais e sobre superfícies não planares 20,15. Os filmes podem também ser modificadas com outros polímeros e uma variedade de proteínas, ADN, nanopartículas, e redox-activas de moléculas de novas propriedades 21,22,23. Nos dispositivos BioMEMS, os filmes de quitosano foram utilizados para a entrega da droga, a detecção de molécula pequena redox e, biocatálise, e os estudos de células 20,23,24,25. Do mesmo modo, o alginato é amplamente usado como uma matriz de células aprisionamento e tem sido explorada para contenção fluídica reversível dapopulações celulares e no filme-imunológicos 26,27,28. Filmes compósitos para aplicações em engenharia de tecidos têm sido fabricadas usando eletrodeposição de alginato, com componentes como com hidroxiapatita para implantes ortopédicos 29. Nas nossas demonstrações de biofabrication, mostrámos as interacções entre ambos os componentes biológicos e em toda a interface bio-electrónica seja igualmente aplicável; isto traz em alcançar a perspectiva de integração de todas as variedades de interacções para o desempenho sofisticado em on-chip de transmissão de sinal. Assim, biofabrication pode facilitar a fabricação de dispositivos com a redução &quot;recurso tamanhos mínimos&quot; como sequência directa sobre a rápida evolução de microfabricação, como muitas vezes motivados por eletrônicos de consumo. Ou seja, próximos a próxima geração de dispositivos podem, na verdade lábeis incluem componentes biológicos que oferecem montagem requintada da natureza e recursos de reconhecimento de mesmo comprimento menor scales que sistemas feitos pelo homem. Nós encaramos a curto prazo aplicações em instrumentação analítica, sensores ambientais, e até mesmo biocompatíveis dispositivos implantáveis.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do componente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Fonte de alimentação </td><td> Keithley </td><td> SourceMeter 2400 </td></tr><tr><td> Três potenciostato eletrodo </td><td> CH Instruments </td><td> Potenciostato / galvanostato 600D </td></tr><tr><td> RE-5B eletrodo de referência Ag / AgCl com conector flexível </td><td> BASI </td><td> MF-2052 </td></tr><tr><td> Ouro bolacha de silício revestido, 500um Si, 12nM Cr, Au 120 nM, SiO2 para o isolamento </td><td> personalizado fabricado </td><td></td></tr><tr><td> Óxido de índio e estanho lâmina de vidro revestido, retangular, 8-12 ohm resistir </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 578274 </td></tr><tr><td> Folha Platinum / folha (0,002 in) </td><td> Chemetals Surepure </td><td> 1897 </td></tr><tr><td> Slim linha 2 &quot;Clips jacaré </td><td> RadioShack </td><td> 270-346 </td></tr> &lt;tr&gt; <td> Multi-Stacking Banana Plug-Patch Cord </td><td> TSElectronic </td><td> B-36-02 B-24-02 </td></tr><tr><td> SYLGARD 184 kit elastômero de silicone </td><td> A Dow Corning </td><td> NC9020938 De Fischer </td></tr><tr><td> Estereomicroscópio Fluorescecence </td><td> Olimpo </td><td> MVX10 MacroView </td></tr><tr><td> cellSens Padrão </td><td> Olimpo </td><td> versão 1.3 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Eletrodeposição e equipamento de visualização de fluorescência. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> A quitosana, peso molecular médio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 448877 </td></tr><tr><td> Ácido clorídrico, ARISTAR. ACS, NF, FCC Grau </td><td> VWR </td><td> BDH3030 </td></tr><tr><td> Hidróxido de sódio em solução. 10.00N </td><td>VWR </td><td> VW3247 </td></tr><tr><td> O ácido algínico, sal de sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 180947 </td></tr><tr><td> Multifex-MM precipitada Carbonato de cálcio, partículas de 70nm </td><td> Especialidade Minerals Inc. </td><td> 100-3630-3 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Quitosana e reagentes solução de alginato. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> O cloreto de cálcio di-hidratado, </td><td> JT Baker </td><td> 0504 </td></tr><tr><td> Cloreto de Sódio, Certified ACS cristalina </td><td> Fischer Científico </td><td> S271 </td></tr><tr><td> Fosfato de potássio monobásico, anidro </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td></tr><tr><td> De fosfato de potássio dibásico, anidro </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3786 </td></tr><tr><td> Tampão fosfato salino </td><td> Sigma- Aldrich </td><td> P4417 </td></tr></tbody></table> Tabela 3. Outros componentes da solução e dos reagentes de tampão. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Empresa / Fonte </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Oxidase de glicose a partir de Aspergillus niger </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2133 </td></tr><tr><td> Tirosinase de cogumelo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T3824 </td></tr><tr><td> LB caldo, Miller (granulado) </td><td> Fischer Scientific </td><td> BP9723-2 </td></tr><tr><td> &quot;EA2-sintase&quot; (HGLPT) </td><td> Lab estoque 16 </td><td></td></tr><tr><td> W3110 células tipo selvagem </td><td> Lab estoque 30 </td><td></td></tr><tr><td> MDAI2 + pCT6-LSRR - amp r + pET- <em&gt; dsRed - kan células r </td><td> Lab estoque 30 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoroesferas: 1μm diâmetro, Ex / Em: 505/515 </td><td> Invitrogen </td><td> F8765 </td></tr><tr><td> 5 - (e-6)-carboxyrhodamine 6G succinimidil éster, Ex / Em: 525/560 </td><td> Invitrogen </td><td> C-6157 </td></tr><tr><td> Anticorpo DyLight rotulagem kit, 405 </td><td> Thermo Scientific </td><td> PI-53.020 </td></tr></tbody></table> Tabela 4. Enzimas, células e reagentes de funcionalização outros.

colmatar a interface bio-eletrônico com biofabrication

Bridging the Bio-Electronic Interface with Biofabrication

Avanços em lab-on-a-chip promessa tecnologia para revolucionar a pesquisa e medicina através de custos mais baixos, melhor sensibilidade, portabilidade e maior rendimento. A incorporação de componentes biológicos em sistemas biológicos microeletromecânicos (bioMEMS) tem mostrado grande potencial para atingir esses objectivos. Microfabricated chips eletrônicos permitem micrômetro em escala recursos, bem como uma conexão elétrica para a detecção e actuação. Funcionais componentes biológicos dar ao sistema a capacidade para a detecção específica de analitos, funções enzimáticas, e de células inteiras capacidades. Processos de microfabricação padrão e bio-analíticas técnicas têm sido utilizados com sucesso durante décadas nas indústrias de computadores e biológicas, respectivamente. Sua combinação e interface em um ambiente de lab-on-a-chip, no entanto, traz novos desafios. Há uma chamada para as técnicas que podem construir uma interface entre o eletrodo ea COMPON biológicaent que é suave e é fácil de fabricar e padrão. Biofabrication, descrito aqui, é uma abordagem de tal forma que tem mostrado grande promessa para a sua incorporação de fácil montagem de componentes biológicos com versatilidade nas funções on-chip que são habilitados. Biofabrication usa materiais biológicos e os mecanismos biológicos (auto-montagem, montagem enzimática) para montagem de baixo para cima hierárquica. Enquanto nossos laboratórios têm demonstrado estes conceitos em vários formatos 1,2,3, aqui demonstrar o processo de montagem com base em eletrodeposição seguido de aplicações múltiplas de sinal baseadas em interações. O processo de montagem consiste na electrodeposição de biocompatíveis filmes estímulos responsivos de polímero sobre eléctrodos ea sua funcionalização subsequente com componentes biológicos, tais como ADN, enzimas, ou células vivas 4,5. Electrodeposição tira vantagem do gradiente de pH criado na superfície de um eléctrodo enviesada a partir da electrólisede água 6,7. O quitosano e alginato são estímulos de polímeros biológicos sensíveis que podem ser accionados para a auto-organizar em filmes de hidrogel em resposta a sinais eléctricos impostas 8. A espessura destes hidrogéis é determinada pelo grau em que o gradiente de pH estende-se desde o eléctrodo. Isto pode ser modificada usando densidades de corrente variando e tempos de deposição 6,7. Este protocolo irá descrever como filmes de quitosano são depositados e funcionalizada por ligação covalente de componentes biológicos para as abundantes grupos amina primária presentes no filme, quer através de métodos enzimáticos ou electroquímica 9,10. Filmes de alginato ea sua aprisionamento de células vivas também será dirigida 11. Finalmente, a utilidade do biofabrication é demonstrada através de exemplos de sinal baseado interacção química, incluindo-a-eléctrico, a célula-célula, e também enzima-a-célula de transmissão de sinal. Tanto a eletrodeposiçãoe funcionalização pode ser realizada sob condições fisiológicas próximo-sem a necessidade de reagentes e, assim, poupar lábeis componentes biológicos a partir de condições adversas. Além disso, tanto a quitosana e alginato têm sido muito utilizados para fins biologicamente relevantes 12,13. Em geral, biofabrication, uma técnica rápida que pode ser simplesmente realizada em uma bancada, pode ser usado para a criação de padrões de escala mícron de funcionais componentes biológicos sobre eléctrodos e pode ser usado para uma variedade de lab-on-a-chip aplicações.

Este artigo descreve uma abordagem biofabrication: deposição de estímulos responsivos polissacáridos, na presença de eléctrodos enviesados ​​para criar filmes biocompatíveis que podem ser funcionalizados com células ou proteínas. Nós demonstramos uma estratégia de bancada para a geração dos filmes assim como as suas utilizações básicas para criar superfícies interactivos biofunctionalized para lab-on-a-chip aplicações.

Colmatar a interface Bio-eletrônico com Biofabrication

Os avanços na tecnologia de lab-on-a-chip prometem revolucionar tanto a pesquisa quanto a medicina por meio de custos reduzidos, melhor sensibilidade, portabilidade e ...

O objetivo geral do seguinte experimento é depositar eletricamente filmes biopoliméricos e funcionalizá-los com componentes biológicos, como proteínas e células. O eletrodepósito é obtido aproveitando a mudança de pH que ocorre localmente em um eletrodo polarizado em combinação com uma solução de polissacarídeo sensível ao pH. Após escolher uma estratégia de deposição catódica ou anódica, o eletrodo é polarizado para desencadear uma transição sol-gel, o que gera um filme fino com um padrão definido pela geometria eletroquímica.Além disso, componentes biológicos como proteínas e células podem ser introduzidos durante todo o processo de deposição do eletrodo. Para funcionalizar biologicamente o filme, são obtidos resultados que demonstram a localização dos componentes biológicos nas películas com base em imagens de fluorescência. Adicionalmente, os componentes são funcionais e capazes de interagir com seu ambiente, conforme demonstrado pela detecção eletroquímica de atividade enzimática e pelo uso da resposta de células repórter.A biofabricação fornece uma caixa de ferramentas inovadora para construir a interface entre biologia e eletrônica. Acreditamos que suas principais vantagens são a simplicidade e a capacidade de montagem em condições próximas às fisiológicas. A biologia é especialista na fabricação em escala nanométrica por meio de autoorganização e processos enzimáticos. Ao recrutarmos essas capacidades, contornamos métodos de síntese complexos, perigosos e demorados utilizados por outras técnicas de montagem.Nossa equipe colaborativa teve a ideia de construir a interface do dispositivo BioD usando materiais e mecanismos biológicos ao observar que suas pipetas poderiam ter depósito eletroquímico. O quitan é um polissacarídeo formador de filme com resposta ao pH que pode reconhecer sinais elétricos impostos pelo dispositivo e se depositar como uma película fina. Assim que verificamos que o quitan poderia ser eletrodepositado, percebemos que poderíamos acessar um conjunto mais amplo de ferramentas da bioquímica e da biologia molecular para construir uma interface de dispositivo BioD.A aplicação de tal técnica estende-se a configurações de laboratório em chip onde são necessários componentes biológicos funcionais, pois eles oferecem uma maneira barata e simples de localizar esses componentes em um eletrodo onde podem permanecer viáveis. A demonstração visual deste método é fundamental, pois um filme biofabricado pode ser delicado e facilmente danificado. Assim, deve-se ter cuidado para não ser muito rigoroso durante a lavagem ou manipulação do filme.Como o filme pode ser facilmente perturbado. No entanto, como vantagem, os eletrodos podem ser reutilizados porque o filme é facilmente removido. Para iniciar este protocolo, conecte uma fonte de alimentação aos eletrodos fabricados sob encomenda por meio de cabos de conexão usando clipes de jacaré.Um lâmina de vidro revestida com óxido de estanho e índio, ou ITO, atuará como ânodo ou eletrodo de trabalho; uma folha de platina servirá como cátodo ou eletrodo auxiliar. Posicione os eletrodos de modo que a superfície do ITO a ser funcionalizada fique voltada para o eletrodo auxiliar, de forma que a superfície do ITO seja posicionada verticalmente para ser mergulhada na solução ou horizontalmente, de modo que a solução possa ser contida sobre a superfície. Em seguida, prepare uma solução de deposição de alginato misturando 1% de alginato e 0,5% de carbonato de cálcio em água destilada e autoclavando a mistura. Então, marque o alginato com fluorescência utilizando esferas fluoradas, misturando e agitando em vórtex.Isso permitirá a imagem de fluorescência do filme resultante. Após a autoclave, submergir ambas as eletrodos na solução de deposição preparada e aplicar uma densidade de corrente constante de três amperes por metro quadrado durante dois minutos. A voltagem variará na faixa de dois a três volts. Após dois minutos, desconecte o eletrodo e remova a solução com os depósitos não aderidos. Enxágue suavemente o filme com cloreto de sódio para remover alginato em excesso.Incube brevemente a película em cloreto de cálcio 0,1 molar para fortalecer o gel. Em seguida, incube a película na solução de armazenamento desejada. Prossiga para obter a imagem da película utilizando microscopia de fluorescência antes da co-deposição.Cultive uma cultura celular emissora de sinal e uma cultura celular receptora de sinal conforme indicado no protocolo escrito que acompanha este vídeo. Em seguida, prepare uma solução de deposição de alginato e carbonato de cálcio. Misture a solução com cada cultura celular em uma proporção de um para um, até uma concentração final de 1% de alginato e 0,5% de carbonato de cálcio, com as células diluídas a cerca de metade da densidade de cultivo.Utilize uma lâmina de vidro com um padrão contendo dois eletrodos de ITO confinados por um poço de silano de poli dimetil e um eletrodo contraponto de platina. Conecte um dos eletrodos de ITO e o eletrodo de platina a uma fonte de alimentação. Como antes, imerja os eletrodos na solução de deposição contendo as células receptoras.Configure a fonte de alimentação para uma corrente constante com uma densidade de três amperes por metro quadrado, em que a dimensão da área superficial é definida pelo único eletrodo no qual a deposição ocorrerá. Aplique a corrente por dois minutos para permitir a coprecipitação das células na matriz de alginato. Enxágue o filme com cloreto de sódio como anteriormente e troque a conexão antic para o eletrodo ITO adjacente.Repita o procedimento de deposição, mas desta vez introduza a solução contendo as células doadoras. Incube o chip com dois eletrodos contendo as células co-depositadas e arginato de cálcio durante a noite a 37 graus Celsius em solução salina tamponada com fosfato.Suplementado com meio LB 10% e cloreto de cálcio de um milimolar. Após a incubação, visualize o chip utilizando um microscópio de fluorescência para iniciar a deposição do eletrodo de quitosana. Conecte a fonte de alimentação aos eletrodos.Conecte as pinças de jacaré. Um chip de silício revestido com ouro atuará como cátodo e uma folha de platina servirá como ânodo. Posicione a superfície do eletrodo de ouro de modo que deposite o eletrodo contrário como antes.Prepare uma solução de Kato sand misturando as lâminas de Kato sand em água e adicionando lentamente ácido clorídrico dois molar para dissolver os polissacarídeos. Seguindo o procedimento referenciado no texto, a solução de Kato sand pode ser marcada com fluorescência para visualizar o filme depositado no eletrodo por microscopia de fluorescência. Em seguida, coloque os eletrodos na solução de kaizan, submergindo completamente a área desejada para deposição.Durante dois minutos, aplique uma corrente constante calculada com densidade de quatro amperes por metro quadrado com base na área de superfície do eletrodo de trabalho. Neste caso, uma corrente de 16 microamperes é aplicada a um eletrodo de ouro de quatro milímetros quadrados; a tensão se deslocará na faixa de dois a três volts. Após enxaguar o eletrodo com água deionizada para remover o quitosano em excesso, prossiga para imagens do filme utilizando um microscópio de fluorescência, depositando quitosano e glicose oxidase a partir de uma solução com densidade de corrente de quatro amperes por metro quadrado sobre um eletrodo padronizado.De acordo com o procedimento de deposição eletroquímica de Quitosana, será gerada uma película de Kaizan imobilizada com glicose oxidase. Fixe o eletrodo tratado a um sistema de três eletrodos, utilizando-o como eletrodo de trabalho, um fio de platina como eletrodo auxiliar e prata/cloreto de prata como eletrodo de referência. Mergulhe os eletrodos em uma solução tampão fosfato contendo cloreto de sódio. Conjugue eletroquimicamente a proteína à película de Kaizan aplicando uma tensão constante durante 60 segundos, utilizando cronopirômetria após a conjugação.Coloque o chip em tampão fosfato e lave por 10 minutos em agitador orbital para remover qualquer cloreto de sódio não reagido e glicose oxidase não conjugada. Reconecte o sistema de três eletrodos e imerja em uma solução de glicose cinco milimolar. Em seguida, ajuste os parâmetros desejados para voltametria cíclica para varrer o potencial no sentido positivo até 0,7 volts.Remova os eletrodos da solução de glicose e enxágue com tampão fosfato. Em seguida, coloque os eletrodos em um béquer de 10 mililitros contendo oito mililitros de tampão fosfato sobre uma placa de agitação magnética com viés. Aplique no chip funcionalizado com GOX uma tensão de 0,6 volts para atuar como eletrodo de trabalho.Após ajustar os parâmetros desejados, realize um registro de linha de base. Adicione alíquotas de glicose ao tampão para aumentar a concentração de glicose em quatro milimolares por alíquota. Neste experimento, são adicionadas ao tampão alíquotas de 400 microlitros de glicose 80 milimolares. Correlacione a saída de corrente a cada concentração de glicose para gerar uma curva padrão. Para realizar a funcionalização proteica, utilize uma lâmina de vidro com um eletrodo de ouro e ITO adjacentes, contidos dentro de A-P-D-M-S.Polarize o eletrodo de ouro com um potencial catódico para eletrodepositar o tizen conforme demonstrado anteriormente. Após enxaguar o filme, adicione uma solução de autoindutor fluorescente azul marcado, suplementada com a enzima tirosinase. Incube por uma hora à temperatura ambiente.Lave a película com PBS como antes, aplique um potencial anódico ao eletrodo de ITO imerso em uma solução de deposição de alginato contendo células receptoras. Prossiga com os mesmos passos descritos na co-deposição de populações celulares em alginato para gerar o sinal transmitido enzimaticamente. Após lavar as películas, adicione uma solução de cinco micromolar, SAH e PBS suplementada com meio LB a 10% e um milimolar.Cloreto de cálcio cobre os eletrodos para prevenir a evaporação da solução e incubar durante a noite a 37 graus Celsius. Isso permitirá uma resposta nas células receptoras por meio da geração de uma proteína fluorescente vermelha DS red; eletrodos adjacentes podem ser analisados por microscopia de fluorescência ajustando os filtros para capturar a fluorescência azul do indutor também sintetase e a fluorescência vermelha expressa pelas células receptoras cooptadas. Sinais elétricos impostos podem criar microambientes localizados próximos à superfície do eletrodo, e esses estímulos podem desencadear a automontagem de polissacarídeos, como alginato e razan, depositando-se como um filme de hidrogel na superfície do eletrodo.Como essa transição sol-gel ocorre na superfície do eletrodo, o filme resultante é eletroendereçado com sua geometria correspondendo ao padrão do eletrodo. Utilizando alginato, populações celulares únicas foram coprecipitadas em endereços separados. A evidência de seu eletroendereçamento é observada mediante a interação entre as populações celulares emissora e receptora.A molécula indutora automático dois difunde-se a partir das células emissoras e é absorvida pelas células receptoras, resultando na expressão da proteína fluorescente vermelha DS. Aqui, a fluorescência vermelha é observada apenas no eletrodo onde as células receptoras estão localizadas. Por outro lado, a enzima biossensora glicose oxidase confere a capacidade de detecção de glicose por meio de uma reação enzimática que produz peróxido de hidrogênio, o qual pode então ser eletroquimicamente oxidado para gerar uma corrente de saída.Dessa forma, um sinal químico pode ser transduzido em um sinal elétrico. Este gráfico mostra que filmes nos quais o Geo X foi quimicamente conjugado produzem um forte sinal antic na presença de glicose, ao contrário dos filmes que não contêm Geo X. Esses resultados indicam que o Geo X pode ser montado sobre um filme de zam depositado e ainda reter atividade catalítica. Além disso, um aumento em degrau na corrente otica é produzido em resposta ao aumento das concentrações de glicose.A curva padrão também apresentada mostra que os aumentos ocorreram de forma quase linear, dependente da quantidade de glicose adicionada. Esses resultados demonstram que a enzima mantém sua sensibilidade mesmo após a conjugação ao filme Razza, como ilustrado aqui, em que a I dois sintase inclui uma etiqueta de penta tirosina. A tirosinase atua sobre a etiqueta de tirosina, oxidando os grupos fenóis dos resíduos a o-quinonas, que então se ligam covalentemente às evidências de aminas do filme Kazan. Há evidência de funcionalização do filme Kazam pela montagem da I dois sintase mediada por tirosinase, observada nesta imagem de fluorescência que mostra um filme kaza sobre ouro, onde a I dois sintase funcionalizada foi marcada fluorescentemente em azul. Como a I dois sintase gera I dois a partir do substrato SAH da mesma maneira que as células emissoras, sua proximidade com células receptoras recrutadas na presença de SAH também faz com que essas células respondam fluorescentemente, expressando ds.A fluorescência vermelha das células receptoras novamente demonstra a interação entre as unidades devido à difusão do ai-2 de uma para a outra, e indica ainda que as 10 enzimas imobilizadas ao tizen retêm atividade após ligação covalente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como eletrodepositar filmes de polissacarídeos e como funcionalizá-los utilizando diversas técnicas. Demonstramos a versatilidade dessas etapas de funcionalização, permitindo-nos trabalhar com uma grande variedade de componentes biológicos em testes posteriores.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em apenas alguns minutos, a fim de gerar padrões bem definidos de filme sobre os quais componentes biológ游戏副本Nossa expectativa é que as ferramentas de biofabricaoção sirvam de ponte entre dois campos distintos — a Biotecnologia e a Microeletrônica —, cada um dos quais já revolucionou nossas vidas individualmente. Ao integrar essas duas áreas, acreditamos que poderemos criar novas soluções para alguns dos problemas mais urgentes da sociedade. Por exemplo, imaginamos que a Biofabricaoção possa oferecer métodos simples e versáteis para novas formas de detecção, no ponto de atendimento, no diagnóstico de doenças e na detecção de ameaças biológicas e químicas.Um exemplo de grande alcance seria que o stent arterial da próxima geração também pudesse monitorar seu perfil metabólico, além de manter sua artéria aberta.

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