Medición de los efectos de anticuerpos en la función celular de cardiomiocitos aislados

El objetivo general del siguiente experimento es detectar los anticuerpos cardiotrópicos en el plasma de pacientes con miocardiopatía dilatada u otras enfermedades cardíacas con antecedentes autoinmunes. Esto se logra mediante una miniabsorción inmunológica inicial del plasma del paciente en columnas de esferones anti IgG para purificar la inmunoglobulina G como segundo paso. Los cardiomiocitos ventriculares se aíslan de ratas wistar adultas, lo que proporciona la base celular para este bioensayo.

A continuación, se permite que los cardiomiocitos se adhieran a los cubreobjetos de la cámara y se tiñen con URA 2:00 AM para permitir la observación del transitorio de calcio intracelular durante las contracciones, luego se prueba la IgG del paciente para observar su efecto sobre la contractilidad de los cardiomiocitos. Los resultados demuestran si la IgG de un paciente contiene anticuerpos trópicos en función de los cambios en la contractilidad y el transitorio de calcio en los cardiomiocitos aislados. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como los inmunoensayos estándar para la detección de anticuerpos, es que es independiente de un antígeno concreto y que permite discriminar entre anticuerpos estimulantes y bloqueantes.

La demostración del procedimiento bera Google y experimentará la asistencia técnica de nuestro laboratorio. Para comenzar este procedimiento, prepare las mini columnas de inmunoabsorción llenando tres mililitros de esferones anti IgG por dos mililitros de plasma EDTA del paciente en una columna econopak vacía. A continuación, coloque un filtro encima de los esferones anti IgG.

Corte la punta inferior de la columna y presione el filtro para alcanzar un caudal de aproximadamente una gota por segundo. A continuación, lavar la columna tres veces con un volumen de plasma de cloruro de sodio al 0,9%pipetear el plasma de la columna cuando el plasma se haya sumergido completamente en el anti IgG Spheros lavar con el mismo volumen de cloruro de sodio al 0,9%. A continuación, pipetee un volumen plasmático de clorhidrato de glicina 0,2 molar a pH 2,8 en la columna y déjelo sumergir en el foso.

Luego agregue otro volumen de clorhidrato de glicina a la columna. Recoja el flujo en un tubo de 15 mililitros y ajuste el pH a 7.3 con clorhidrato de tris molar 0.5 a p pH 8.0 para regenerar la columna. Lavarlo con tres volúmenes plasmáticos de clorhidrato de glicina después de un lavado final con dos volúmenes de cloruro de sodio al 0,9%.

La columna se puede utilizar para la siguiente muestra de plasma para su uso en cardiomiocitos. La fracción de IgG recolectada debe dializarse contra el tampón experimental llenando primero la fracción de IgG en un tubo de membrana de diálisis de éster de celulosa con un corte de peso molecular de 100 kilodaltons. Luego coloque el tubo en un litro de EB y revuelva lentamente con un movimiento magnético a cuatro grados centígrados Después de ocho horas, transfiera el tubo de diálisis a tres litros de EB fresco y dializado durante otras 20 horas a cuatro grados centígrados después de la diálisis.

Hervir la muestra durante 30 minutos a 57 grados centígrados en un baño de agua. Para inactivar los factores del complemento, determine la concentración total de IgG y prepare alícuotas con cada una que contenga 330 microgramos de IgG. En este procedimiento, prepare un tampón de aislamiento libre de calcio de acuerdo con el manuscrito adjunto.

A continuación, llene 80 mililitros de IB en el depósito superior de un sistema de perfusión de termostato y mantenga el tampón a 37 grados centígrados y airee con un 95% de oxígeno y un 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos. Disuelva aproximadamente de 7.000 a 10.000 unidades de colagenasa tipo dos y 174 miligramos de BSA sin ácidos grasos en 20 mililitros. IB que contiene cloruro de calcio 112,5 micromolares y ajuste el pH del tampón de aislamiento en el depósito superior si es necesario.

A continuación, anestesiar una rata wistar de 175 a 200 gramos con tiopental a 375 microgramos por kilogramo con 2.500 UI de heparina añadida a la solución de tiopental. Después de la toracotomía, extirpe el corazón cuidadosamente con un arco aórtico intacto y transfiéralo a cloruro de sodio helado con cero puntos porcentuales en cloruro de sodio helado. Extraer la sangre y el tejido circundante del corazón.

A continuación, transfiéralo a cloruro de sodio fresco al 0,9% y exponga la aorta. Encienda el reductor de flujo del sistema langor para obtener una velocidad de caída de dos a tres por segundo. A continuación, conecte el corazón a la cánula.

Perfundirlo durante un máximo de tres minutos con un caudal de una gota por segundo para lavar la sangre restante. Después de eso, haga circular el IB en el sistema LOR. Ahora retire 20 mililitros de tampón del depósito superior.

Llene el depósito con la solución de colagenasa y rellene la cantidad de tampón necesaria para alcanzar los 80 mililitros. A continuación, haga circular la solución de digestión durante otros 27 minutos. A continuación, separe el corazón de la cánula.

Extirpa las aurículas y la aorta, luego pica los ventrículos en pedazos pequeños. Permita que el tampón de digestión corra hacia el depósito inferior. Reduzca el volumen a un máximo de 40 mililitros para digerir aún más los ventrículos picados durante 10 a 15 minutos bajo la aireación continua con 95% de oxígeno, 5% de dióxido de carbono.

A continuación, filtre la suspensión celular a través de una gasa de tamaño de malla de 200 micras en un tubo de 50 mililitros. Por último, restaure el contenido de calcio de las células centrifugando la suspensión celular a 40 3G durante dos minutos. A temperatura ambiente, vuelva a suspender las células en 10 mililitros.

IB que contiene 200 micromolares de cloruro de calcio centrifugar de nuevo y resuspender las células en 10 mililitros. IB con 500 micromolares de cloruro cálcico. Después de una centrifugación final, resus, suspender los cardiomiocitos en EB filtrado estéril a una densidad de 50.000 células por mililitro.

Cubra los cubreobjetos en una cámara de cuatro pocillos con 10 microgramos de laminina por pocillo y espere hasta que esté completamente seco. A continuación, llene un mililitro de la suspensión de cardiomiocitos en cada pocillo. Usando una micropipeta con una punta cortada y dejando que las células se adhieran durante una hora a temperatura ambiente, diluya 10 microlitros de la solución madre de un miligramo por mililitro fira 2:00 AM en cinco mililitros, eb, y mantenga la solución de tinción en la oscuridad.

A continuación, retire el tampón y las células no adheridas de los cubreobjetos pipetea 0,5 mililitros de la solución de tinción. En cada uno, incubar bien las células durante 10 minutos bajo una agitación moderada. Posteriormente, retire la solución de tinción y lave las células una vez con un mililitro eb.

A continuación, añada 0,5 mililitros de EB a cada pocillo en este procedimiento, coloque el cubreobjetos bajo un microscopio de fluorescencia inversa conectado a un sistema de registro de calcio y contractilidad de miocitos. Coloque un electrodo hecho a medida con un tubo de entrada y afluencia en el primer pozo y super. Fusionar los cardiomiocitos con un mililitro por minuto eb.

Comience la estimulación eléctrica a 20 voltios, un hercio y cinco milisegundos de duración por pulso, y permita que las células se adapten a la estimulación durante unos dos minutos. Elija un cardiomiocito intacto en forma de bastón con estrías claras y contracción constante y colóquelo en el centro del campo visual. A continuación, abra el canal de la cámara y oriente la célula horizontalmente dentro del área de vídeo girando el adaptador de encuadre de la célula y moviendo la platina del microscopio.

Ajuste el límite de los elementos de control de detección de la zona de vídeo. Encienda el canal fluorescente y registre de 10 a 15 contracciones para obtener el acortamiento celular inicial y el transitorio de calcio. Después de eso, apague el canal de luz del microscopio para evitar el blanqueo de la mancha fluorescente.

Cambie el flujo de EB a la derivación de la muestra con una válvula de tres vías y superfusione los cardiomiocitos con un mililitro de IgG del paciente. Detenga la bomba justo antes de que el aire llegue al canal de luz y registre otras 10 a 15 contracciones para obtener la respuesta celular aguda. Luego detenga la grabación y apague el canal de luz nuevamente, repita las grabaciones después de dos y cinco minutos y retire el electrodo del pozo cuando terminen al final, analice el acortamiento de la celda y el transitorio de calcio con el software del asistente de iones utilizando la longitud de borde y la ventana de relación de barra reducida numérica URA dos numéricas respectivamente.

A continuación, calcule los cambios porcentuales para las respuestas agudas, de dos minutos y de cinco minutos desde el acortamiento celular inicial y la altura del pico transitorio de calcio. A continuación se muestra un ejemplo representativo de la medición de control. El acortamiento celular y el transitorio de calcio se monitorizaron en línea antes de la superfusión con IgG e inmediatamente dos minutos y cinco minutos después de la superfusión con IgG.

Y aquí hay un ejemplo de la medición de una muestra de IgG que contiene anticuerpos cardiodepresivos. El acortamiento celular y el transitorio de calcio se midieron en línea antes de la superfusión con IgG e inmediatamente dos minutos y cinco minutos después de la superfusión con IgG. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo detectar anticuerpos de tráfico cardiovascular en el plasma del paciente midiendo el efecto de la IgG aislada en el acortamiento celular en el transitorio de calcio de cardiomiocitos rojos adultos aislados.