Name: Rápido aislamiento de células tumorales viables de circulación de muestras de sangre del paciente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprende a aislar células tumorales circulantes viables de muestras sanguíneas mediante un dispositivo de microtubos funcionalizado con E-selectina. Esta técnica biomimética captura CTCs sin daño celular para desarrollar terapias oncológicas personalizadas.

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El trabajo descrito fue apoyada por el Centro de Cornell sobre el microambiente y la metástasis a través Número U54CA143876 Premio del Instituto Nacional del Cáncer. El contenido es responsabilidad exclusiva de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional del Cáncer o el Instituto Nacional de Salud. Este trabajo fue financiado, además, en parte por la National Science Foundation Graduate Research Fellowship (ADH).

El protocolo siguiente es para la producción de un dispositivo microtubo clave. 1. Preparación de la solución de nanotubos de halloysita <ol><li> Baño de ultrasonidos (10-13 W (RMS)) 250 l solución de nanotubos de halloysita (6,6% en peso en agua) 30 seg. Solución de enfriamiento con agua fría y ultrasonidos repetir una vez. Enfriar de nuevo. </li><li> Dibujar solución sonicado en una jeringa, colocar un filtro de 0,45 micras jeringa, y solución de filtro en el tubo de microcentrífuga limpio. Vortex la solución ocasionalmente para mantener la homogeneidad. </li></ol> 2. El recubrimiento de la superficie interior con microtubos de nanotubos de halloysita <ol><li> Obtener 50 cm de sección larga de la Micro-Renathane microtubing (300 m de diámetro interior, 35,3 l volumen interior). Corte un extremo del microtubo en una diagonal y se insertan en un pedazo pequeño adaptador IDEX. Insertar la aguja de una jeringa 3/10 cc 29G en el otro extremo del microtubo. </li><li> Para limpiar el microtubo, colocar el extremo abierto del microtubo (el extremocon el adaptador) en etanol al 70% y un empate ~ 50 l de etanol en la jeringa para llenar microtubo. </li><li> Lavar el etanol a partir del microtubo dibujando un volumen suficiente de agua destilada en la jeringa. </li><li> Retire la jeringa del microtubo, vaciar la jeringa, y luego vuelva a colocar en el microtubo. </li><li> Preparar una solución de 0,02% w / v de poli-L lisina en agua. Extraer 50 l en el microtubo y dejar reposar durante 5 min a temperatura ambiente (TA). </li><li> Dibuja 100 l solución filtrada de nanotubos en el microtubo y dejar incubar durante 3 min a temperatura ambiente. </li><li> Dibuja de agua de 100 l por el microtubo para enjuagar la solución de nanotubos. Permitir microtubo recubierto para sentarse, lleno de agua, durante la noche a temperatura ambiente. </li></ol> 3. Preparación de Microtubos para el aislamiento de la célula <ol><li> Preparar una solución de 10 mg / ml de proteínas G en fosfato 1X Dulbecco (PBS, pH 7,0 a 7,2). Extraer 50 l de PBS a través microtubo y luego dibujar 50 l dela solución de proteína-G y permitir a incubar durante 1,5 horas a temperatura ambiente. </li><li> Prepare una solución que contenía 5 mg / mL de E-selectina-IgG y 50 ug / ml de anticuerpos (anti-EpCAM para las muestras de cáncer de la mayoría de los anti-PSMA de muestras de cáncer de la próstata) en PBS. Extraer 50 L de la E-selectina y solución de anticuerpos en el microtubo y dejar incubar durante 2 horas a temperatura ambiente. </li><li> Adhesión celular no específica se bloquearon con proteínas de la leche al 5%. Preparar una solución de 5% (w / v) de proteína de la leche en PBS. Dibujar 50 l solución proteína de la leche en el microtubo y permitir a incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Extraer 50 l de PBS en el tubo y dejar a temperatura ambiente hasta que las muestras de sangre o de la capa leucocitaria están listos para su procesamiento. </li><li> 10 minutos antes de usar el microtubo para el aislamiento, dibujar 50 l de PBS que ha sido saturada con Ca 2 + (&quot;PBS +&quot;) para activar las moléculas de selectina. </li></ol> 4. Preparación de muestras para el aislamiento de células <ol><li> Dibujar o obtener 10 ml de sangre del paciente en heparinizadatubo. </li><li> Colocar 10 ml de Ficoll-Paque solución de aislamiento de linfocitos en 50 ml tubo de centrífuga. Suavemente la capa 10 ml de sangre entera en la parte superior de Ficoll para que no se mezcle la sangre y Ficoll. </li><li> Se centrifuga a 2000x g durante 15 min a 4 ° C con una desaceleración mínima. </li><li> Retire la capa de la capa leucocitaria y el lugar en el nuevo tubo. </li><li> Lavado de la capa leucocitaria con PBS (centrifuga a 230x g durante 10 minutos, descartar el sobrenadante). </li><li> Resuspender las células con 1 ml de solución amortiguadora de lisis de glóbulos rojos y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente para lisar los eritrocitos. </li><li> Añadir 10 ml de PBS, mezclar suavemente, y se centrifuga a 230x g durante 10 minutos. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado con cuidado en 3 a 4 ml de PBS +. </li></ol> 5. Celda de aislamiento <ol><li> Conecte un extremo del microtubo funcionalizado a una jeringa de 5 ml con adaptadores de IDEX. </li><li> Insertar la jeringa en una bomba de jeringa. </li><li> Sumergir el extremo abierto del microtubo funcionalizado en la célula suspension. </li><li> Procesar la suspensión celular a través de la microtubo de 1 a 4 ml / h. </li><li> Transferir el extremo abierto del microtubo a un tubo que contenía PBS + y dibujar 300 L + PBS en jeringa a 0,016 ml / min para eliminar las células no unido y débilmente ligados desde el microtubo. </li><li> Coloque el extremo abierto del microtubo en un tubo limpio. Desconecte la jeringa del microtubo y adjuntar una jeringa precargada con Accutase. Suavemente perfundir Accutase suficiente en el microtubo para llenar (~ 50 l) y se deja incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. </li><li> Coloque una jeringa precargada con 1 ml de medio de crecimiento (79% de RPMI, FBS al 20%, 1% de penicilina estreptomicina) y perfundir en microtubo, recogiendo efluente en cultivo de tejidos tratados bien placa. </li><li> Las células de cultivo a 37 ° C y 5% de CO 2 bajo condiciones de humedad. </li></ol> 6. Los resultados representativos El objetivo de esta técnica consiste en aislar células viables de cáncer de la sangre de pacientes con cáncer. Existen varios métodos para identificar las células cancerosas en la cultura, la verificación necesaria para el éxito del dispositivo. Hemos elegido para teñir las células en cultivo con anticuerpos contra restos epiteliales tales como EpCAM (molécula de adhesión celular epitelial) o PSMA (antígeno prostático específico de membrana), además de DAPI para identificar los núcleos de células intactas (Fig. 2 y 3). El número de células cancerosas capturados utilizando esta técnica es necesariamente una función del número de CTC en la muestra de partida, y la variabilidad del paciente puede ser alto. En el procesamiento de las muestras tomadas de pacientes diagnosticados con cáncer en estadio IV, que habitualmente capturan entre 100 y 500 células cancerosas por el tubo de sangre, en el grado de pureza&gt; 50%. Inmediatamente después de aislamiento, un mayor número de leucocitos contaminantes pueden estar presentes. Sin embargo, estos números se agota después de incubación en medio de cultivo durante un máximo de 5 días. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig1.jpg" /> <strong&gt; Figura 1. Esquema de microtubo funcionalizado para el aislamiento de la CTC, mostrando selectina mediada por laminación seguido mediada por anticuerpos adhesión estática. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig2.jpg" /> Figura 2. Los datos representativos de aislamiento CTC de muestras de sangre extraídas de un paciente con cáncer de mama y un paciente de cáncer de pulmón. El número de células viables positivamente identificados como CTC basado en la tinción EpCAM está representado por las barras de sólidos y se refieren a la ordenada izquierda y el porcentaje de células que fueron identificadas como CTC en comparación con el número total de células capturadas está representado por las barras abiertas y medido en la ordenada derecha. Los resultados son los siguientes cinco días de cultivo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig3.jpg" /> Figura 3. Micrografías representativas de los donantes separados (A y B) de CTC en la cultura 5 días posteriores a isolatien una muestra de cáncer de la sangre del paciente. Las células fueron teñidas con fluorescencia para EpCAM con AlexaFluor 488 (verde) y 4 &#39;,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) para visualizar el núcleo (azul).

<ol><li>Allard, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cells+circulate+in+the+peripheral+blood+of+all+major+carcinomas+but+not+in+healthy+subjects+or+patients+with+nonmalignant+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases.</a> Clin. Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).</li>
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</ol>

MRK es asesor científico de la CellTraffix, Inc. (Rochester, NY).

A menudo es el caso de que los primeros pasos en el descubrimiento de nuevos agentes terapéuticos del cáncer utilizan líneas celulares de cáncer, que se parecen a las células cancerosas cuestionable primarios todavía permanecen en uso debido a su facilidad de uso en el laboratorio. La investigación sobre el desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer podría ser más rápida si las células cancerosas humanas primarias se utilizaron a principios de la investigación novela. CTC son el tipo más fácilmente accesible de células cancerosas, debido a su presencia en la sangre y la facilidad de una extracción de sangre estándar. Además, las células tumorales circulantes representan un paso necesario en el proceso de metástasis 5,6, por lo que su importancia para la enfermedad y de utilidad para la orientación de nuevos fármacos es clara. Aislamiento de CTC de la sangre in vitro se complica por sus bajas concentraciones: del orden de un millón de leucocitos por uno o por billón de eritrocitos 7. La mayoría de los métodos actuales para la detección de CTC en la sangre, incluyendo el de la célula única técnica aprobada por la FDA<html> Buscar (Veridex), dañar o destruir las células en el proceso de detección, lo que impide su uso más allá de la enumeración. El método descrito anteriormente no pone en peligro la viabilidad celular y por lo tanto abre la puerta a futuras investigaciones clínicas sobre el cáncer. A medida que la recuperación de células intactas es el objetivo de esta técnica, es imperativo que las células se maneja con cuidado, especialmente durante las etapas de separación de sangre. Hay un número de parámetros sintonizables en este sistema que pudiera ser alterada para lograr un mejor rendimiento dependiendo de las características críticas tales como el tipo de cáncer. En los pasos descritos anteriormente, se había optado por utilizar EpCAM como un anticuerpo específico de CTC para todos los tipos de cáncer, excepto cuando se procesan las muestras de cáncer de próstata, en el que lucha contra la PSMA se utilizó. Sustituciones adicionales de cáncer de anticuerpos específicos ciertamente puede ser utilizado para mejorar el rendimiento de los pacientes individuales. Además, las concentraciones de selectina y el anticuerpo se puede alterar para mejorar la captura de 8. &quot;&gt; Una característica esencial del dispositivo es la incorporación de E-selectina moléculas sobre la superficie. E-selectina se expresa normalmente en la superficie luminal de las células endoteliales y la función de reclutar rápidas leucocitos se desplazan a sitios de inflamación. Leucocitos que fluyen a enlazar de forma transitoria moléculas de selectina, dando como resultado una más lenta, el comportamiento rodadura que facilita la unión más lenta y más fuerte de la célula al endotelio por integrinas. evidencia experimental convincente que hace que existe el caso que CTC puede extravasación por un mecanismo similar 9,10. La inclusión de selectina también permite que el dispositivo para operar a velocidades de flujo mayores, las tasas que de otro modo prevenir las células de la unión a anticuerpos 11. Así, nuestro dispositivo fisiológicamente imita una vénula para capturar biomimetically fluye CTC sin causar daño celular. Rendimiento del dispositivo mejorado se puede atribuir a la adición de la capa de nanotubos halloysita a la superficie luminaldel dispositivo. Estudios anteriores han demostrado que hay tres componentes principales de la capa de nanotubos que permite una funcionalidad mejorada. En primer lugar, el revestimiento nanotubo proporciona mayor área superficial, lo que permite una mayor deposición de proteínas en la superficie 4. En segundo lugar, en la realización de microscopía de fuerza atómica en el recubrimiento de nanotubos se ha determinado que los nanotubos individuales sobresalen de la superficie en el flujo. Esto permite que las moléculas de selectina para ser presentado tanto como una micra por encima de la superficie para que las células pueden ser capturados y reclutados a la superficie anterior en su trayectoria a través del tubo 4. Por último, el recubrimiento de nanotubos halloysita es capaz de prevenir la adhesión de leucocitos y la difusión en la superficie, lo que permite una reducción del número de leucocitos capturados junto con el CTC y por tanto, mayores subsiguientes purezas CTC 3.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> 300 tubos de ID de mensajería unificada </td><td> Braintree Científico </td><td> MRE025 </td></tr><tr><td> Aumentar la tubería para la conexión a la jeringa </td><td> IDEX de Salud y Ciencia </td><td> 1507L </td></tr><tr><td> Jeringa de 5 ml para la bomba </td><td> BD </td><td> 309603 </td></tr><tr><td> Conector pequeño a un tubo grande </td><td> IDEX de Salud y Ciencia </td><td> P-770 </td></tr><tr><td> Conector gran tubo a la jeringa </td><td> IDEX de Salud y Ciencia </td><td> F-120 y P 659- </td></tr><tr><td> Jeringa para microtubo (jeringa de insulina U-100 3/10cc 29G 1/2 &#39;) </td><td> BD </td><td> 309301 </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> MP Biomedicals LLC </td><td> 1000449 </td></tr><tr><td> Ficol-Paque Plus </td><td> GE Healthcare Bio-Sciences AB </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> RBC Lysis Buffer (Buffer EL, 1.000 ml) </td><td> Qiagen </td><td> 1014614 </td></tr><tr><td> Proteína G, 5 mg </td><td> Calbiochem (calbiochem.com) </td><td> 539303 </td></tr><tr><td> Anticuerpo Humano EpCAM/TROP-1 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> MAB960 </td></tr><tr><td> PSMA anticuerpos (GCP-04) </td><td> abcam </td><td> ab66911 </td></tr><tr><td> Placas de 96 pocillos (Microtest 96) </td><td> BD Falcon </td><td> 35-3072 </td></tr><tr><td> Blotting Bloqueador de Grado no leche en polvo, 300 g </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> 216005508 </td></tr><tr><td> Los nanotubos de halloysita </td><td> NaturalNano </td><td> NN-HNT200 </td></tr><tr><td> Carbonato de Calcio, 5g </td><td> Aldrich Química </td><td> 481807 </td></tr><tr><td> rhE-Selectin/Fc ug Quimera, 100 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 724-ES </td></tr><tr><td> Medio RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 22400-089 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-095 </td></tr><tr><td> Poli-L lisina 0,1% w / v en agua </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8920-100ML </td></tr><tr><td> De Sonic Dismembrator </td><td> Fisher Scientific </td><td> Modelo 100 </td></tr><tr><td> Suero Bovino Fetal </td><td> Atlanta bioquímicos </td><td> S11056H </td></tr><tr><td> La penicilina estreptomicina </td><td> Sigma vida Siiences </td><td> P0781 </td></tr></tbody></table>

rápido aislamiento de células tumorales viables de circulación de muestras de sangre del paciente

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Las células tumorales circulantes (CTC) son células que difunden de un tumor primario en todo el sistema circulatorio y que en última instancia, pueden formar tumores secundarios en sitios distantes. CTC cuenta se puede utilizar para seguir la progresión de la enfermedad sobre la base de la correlación entre la concentración de CTC en la sangre y la gravedad de la enfermedad 1. Como una herramienta de tratamiento, CTC podría ser estudiado en el laboratorio para desarrollar terapias personalizadas. Para este fin, el aislamiento CTC debe causar ningún daño celular, y la contaminación por otros tipos de células, particularmente leucocitos, debe evitarse tanto como sea posible 2. Muchas de las técnicas actuales, incluida la única aprobada por la FDA para la enumeración de dispositivos CTC, destruir CTC como parte del proceso de aislamiento (para más información ver ref. 2). Un dispositivo de microfluidos para capturar viables CTC se describe, que consta de una superficie funcionalizada con E-selectina glicoproteína además de anticuerpos contra marcadores epiteliales 3. Para mejorar el rendimiento del dispositivoMance una capa de nanopartículas se ha aplicado consiste en nanotubos de halloysita, una de nanopartículas de arcilla aluminosilicato cosechado 4. Las moléculas de E-selectina proporcionar un medio para capturar movimiento rápido CTC que se bombea a través del dispositivo, dando una ventaja sobre los dispositivos de microfluidos alternativos en los que los tiempos de procesamiento ya son necesarios para proporcionar células diana con el tiempo suficiente para interactuar con una superficie. Los anticuerpos contra objetivos epiteliales proporcionar CTC-especificidad para el dispositivo, así como proporcionar un parámetro fácilmente ajustable para sintonizar aislamiento. Por último, el recubrimiento de nanotubos de halloysita permite el aislamiento significativamente mayor en comparación con otras técnicas, ayudando a capturar rápidamente las células en movimiento, proporcionando una mayor superficie para la adsorción de proteínas y leucocitos contaminantes repeler 3,4. Este dispositivo se produce por una técnica sencilla utilizando fuera de la plataforma materiales, y ha sido utilizado con éxito para capturar las células cancerosas de la sangre de metastásicopacientes con cáncer. Las células capturadas se mantienen durante un máximo de 15 días de cultivo después del aislamiento, y estas muestras suelen consistir en&gt; 50% de células viables de cáncer primario de cada paciente. Este dispositivo ha sido utilizado para capturar viables CTC tanto de sangre diluida conjunto y muestras de la capa leucocitaria. En última instancia, se presenta una técnica con la funcionalidad en un entorno clínico para desarrollar terapias personalizadas contra el cáncer.

Células tumorales circulantes son aislados de la sangre de pacientes con cáncer sin causar daño celular. El aislamiento de las células tumorales se logra usando una superficie bimolecular de E-selectina además de anticuerpos contra marcadores epiteliales. Un recubrimiento de nanotubos específicamente promueve la adhesión de las células cancerosas que resulta en purezas de captura altas.

Rápido aislamiento de células tumorales viables de circulación de muestras de sangre del paciente

Las células tumorales circulantes (CTC) son células que se diseminan desde un tumor primario a través del sistema circulatorio y que, en última instancia, pueden formar tumores secundarios...

El objetivo general de este procedimiento es aislar células tumorales circulantes viables a partir de muestras de sangre. Comience con la preparación de los microtubos de aislamiento, luego aísle la capa leucocitaria (buffy coat) de las muestras de sangre. A continuación, procese la capa leucocitaria mediante el dispositivo de microtubo funcionalizado.Recoger las células capturadas del tubo micro y mantener el cultivo utilizando un dispositivo que imita fisiológicamente un vaso sanguíneo para capturar biomiméticamente las CTC en flujo sin causar lesión celular. Esta técnica ofrece funcionalidad en un entorno clínico para desarrollar terapias oncológicas personalizadas. Las principales ventajas son que se trata de una técnica sencilla que utiliza materiales comúnmente disponibles y que recrea el proceso natural de tejido sólido que ocurre en los vasos sanguíneos.Soy Mike King, profesor asociado de ingeniería biomédica en la Universidad de Cornell, y quien demostrará el procedimiento será Jeff Madison, un técnico sénior de mi laboratorio. El siguiente protocolo es para la producción de un solo dispositivo de microtubo: sonicar 250 microlitros de una solución al 6.6 % de nanotubos Halo site durante 30 segundos, y enfriar la solución con agua fría.Después de una segunda sonicación, aspire la solución en una jeringa. Filtre la solución a través de un filtro de jeringa de 0,45 micrones hacia un tubo microfuger limpio y vortexee periódicamente la solución de nanotubos en sitio halo.Para mantener la homogeneidad, obtenga un tramo de 50 centímetros de longitud de tubo micro rehan. Corte la entrada del tubo micro en diagonal e inserte un extremo del tubo micro en una pieza adaptadora pequeña de IDEXX, e inserte una aguja de jeringa en el otro extremo del tubo micro. Para limpiar el tubo micro, coloque el extremo abierto del tubo micro en etanol al 70 % y aspire aproximadamente 50 microlitros de etanol en la jeringa para llenar el tubo micro y enjuagarlo, expulsando el etanol del tubo micro.Aspire un volumen generoso de agua destilada en la jeringa. Ahora desacople la jeringa del tubo micro, vacíe la jeringa y luego vuélvala a acoplar al tubo micro. Aspire 50 microlitros de 0,02 peso por volumen.Añada poliol lisina al tubo micro y incube durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego, aspire 100 microlitros de solución filtrada de nanotubo al tubo micro e incube durante tres minutos a temperatura ambiente. Para enjuagar la solución de nanotubo, aspire 100 microlitros de agua a través del tubo micro e incube durante la noche a temperatura ambiente; luego aspire 50 microlitros de PBS a través del tubo micro, seguidos de 50 microlitros de 10 microgramos por mililitro.Equilibrar la solución de proteína G durante 90 minutos a temperatura ambiente. A continuación, introducir 50 microlitros de una solución de IgG de E-selectina a cinco microgramos por mililitro y 50 microgramos por mililitro en el tubo micro. Incubar durante dos horas a temperatura ambiente y bloquear la adhesión celular no específica con proteína de leche al 5%.Luego incubar PBS a temperatura ambiente hasta que las muestras de sangre o capa leucocitaria estén listas para su procesamiento, 10 minutos antes de usar el tubo micro para el aislamiento celular. Aspirar 50 microlitros de PBS saturado con calcio para activar las moléculas de selectina en un tubo heparinizado. Recolectar una muestra de sangre de 10 mililitros de un paciente para el aislamiento de linfocitos.Coloque 10 mililitros de la solución de paquete de folículos en un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Deposite cuidadosamente encima la muestra de 10 mililitros de sangre completa y centrifugue a 2000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados Celsius con desaceleración mínima. A continuación, transfiera la capa de buffy coat a un tubo nuevo.Lave el capa leucocitaria con PBS y centrifugue para lisar los eritrocitos. Re suspenda suavemente los pellet celulares en un mililitro de tampón de lisis de GR y incube durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego agregue 10 mililitros.Mezcle suavemente la PBS y las células del paladar mediante centrifugación. Reuspenda suavemente las células en PBS más utilizando adaptadores IDEXX. Sujete un extremo del microtubo funcionalizado a una jeringa de cinco mililitros.Inserte la jeringa en una bomba de jeringa y sumerja el extremo abierto del microtubo funcionalizado en la prevención de células. Pase la suspensión celular a través del microtubo para eliminar las células no unidas y débilmente unidas. Transfiera el extremo abierto del microtubo a un tubo que contenga PBS más.Aspire 300 microlitros de PBS más al interior de la jeringa. A continuación, coloque el extremo abierto del microtubo en un tubo limpio. Desconecte la jeringa del microtubo y conecte una jeringa que contenga acuato, perfundiendo suavemente el acuato para llenar el microtubo.Tras una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente, coloque una jeringa que contenga un mililitro de medio de crecimiento, perfunda el microtubo y recoja el efluente en el tejido adecuado. Proceda al cultivo en placas. Las células tumorales circulantes aisladas se obtuvieron de muestras de sangre de un paciente con cáncer de mama y de un paciente con cáncer de pulmón tras cinco días.En cultivo. Estas preparaciones se caracterizaron mediante la captura de CTC basada en la tinción del marcador epican de células epiteliales, así como la pureza de captura del núcleo se calculó como el porcentaje de células identificadas como CTC en comparación con el número total de células capturadas. Esta imagen muestra micrografías representativas de CTC aisladas de los donantes A y B. Después de cinco días en cultivo, las células se tiñeron con fluorescencia para EPAM con Alexa Fluor 488.Los núcleos se visualizaron mediante tinción con DPI. Tras este procedimiento, las CTC viables y el cultivo pueden utilizarse para obtener información específica del paciente, como la susceptibilidad a fármacos o la expresión de marcadores celulares. Gracias por ver este video y buena suerte.

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Bioengineering

Bioingeniería

Este video describe un protocolo detallado para aislar células tumorales circulantes de la muestra de sangre completa de un modelo de ratón con tumor colorrectal eutanasiado. Estos CTC aislados se pueden cultivar y utilizar para el análisis posterior previsto.

Aislamiento de CTC a partir de una muestra de sangre completa: un método para obtener CTC a partir de un modelo murino de cáncer colorrectal

Se ha demostrado que las células tumorales circulantes (CTC) desempeñan un papel importante en la metástasis tumoral. En este artículo, se describe un método para el aislamiento y la propagación de CTC a partir de la sangre total de un modelo tumoral singénico de ratón con metástasis de carcinoma hepatocelular (CHC).

El aislamiento y la propagación de células tumorales circulantes de un Cáncer de ratón

Un protocolo para utilizar un poli (N-iso propilacrilamida) (PIPAAm) microfiltro recubierto para la captura eficaz y la liberación de respuesta térmica de las células tumorales circulantes viables (CTC) se presenta. Este método permite la captura de CTC de la sangre de los pacientes y la posterior liberación de CTC viables para el cultivo aguas abajo fuera del chip, análisis y caracterización.

Captura y Liberación de viables células tumorales circulantes de la sangre

Describimos el establecimiento de tumores colorrectales ortotópicos mediante la inyección de células tumorales o organoides en el ciego de ratones y el subsiguiente aislamiento de células tumorales circulantes (CTC) de este modelo.

Aislamiento de células tumorales circulantes en un modelo de ratón ortotópico de cáncer colorrectal

Este protocolo es recuperar y preparar dianocitos rara de una mezcla con las células de distintos antecedentes caracterización genética molecular a nivel unicelular. Calidad de ADN es igual a las células no tratadas y permite aplicación unicelular (ambos proyección base y objetivo análisis).

Destino celular genoma pre-enriquecimiento y toda amplificación sola célula caracterización aguas abajo

Aquí, presentamos un flujo de trabajo integrado para identificar rasgos fenotíricos y moleculares que caracterizan las células tumorales circulantes (CTCs). Combinamos la inmunostalización en vivo y la micromanipulación robótica de los CTCs individuales y agrupados con técnicas basadas en una célula para el análisis y la evaluación de la capacidad de la metastasis-siembra.

Micromanipulación de células tumorales circulantes para análisis molecular descendente y evaluación potencial metastásica

La caracterización de las células tumorales circulantes (CTC) es un tema popular en la investigación traslacional. Este protocolo describe un ensayo de inmunofluorescencia semiautomática (IF) para la caracterización y enumeración de CTCs en muestras de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).

Caracterización semiautomática PD-L1 y enumeración de células tumorales circulantes de pacientes con cáncer de pulmón celular no pequeño por inmunofluorescencia

El cultivo de CTC permite una caracterización funcional más profunda del cáncer, a través del ensayo de la expresión de marcadores específicos, y la evaluación de la resistencia a los medicamentos y la capacidad de colonizar el hígado, entre otras posibilidades. En general, el cultivo de CTC podría ser una herramienta clínica prometedora para la medicina personalizada para mejorar el resultado del paciente.

Líneas celulares tumorales circulantes: una herramienta innovadora para la investigación fundamental y traslacional

El chip microfluídico clínico es una importante técnica de análisis biomédico que simplifica el preprocesamiento clínico de las muestras de sangre de los pacientes y tiñe inmunofluorescentemente las células tumorales circulantes (CTC) in situ en el chip, lo que permite la rápida detección e identificación de una sola CTC.

Plataforma de chip microfluídico clínico para el aislamiento de células tumorales circulantes versátiles

Las células tumorales circulantes (CTC) son fundamentales para el estudio de la progresión y la metástasis del cáncer. Este artículo presenta un protocolo integrado de alto rendimiento para el enriquecimiento de CTC y la secuenciación de CTC única, mejorando la eficiencia de captura y la pureza de CTC al tiempo que reduce la contaminación y los costos de secuenciación, avanzando así en la investigación oncológica de precisión y las aplicaciones clínicas.

Tecnología de clasificación de células tumorales circulantes de alto rendimiento basada en microfluidos y secuenciación de células individuales

Aquí presentamos un protocolo para ilustrar el aislamiento de células cancerosas raras a partir de una muestra artificial que contiene sangre entera y con células de cáncer de pulmón con picos. El protocolo utiliza una plataforma de aislamiento celular semiautomatizada y sin etiquetas. Las células enriquecidas son posteriormente analizadas en busca de mutaciones en los receptores del factor de crecimiento epidérmico mediante PCR digital de gotas.

Perfilado de mutaciones del ADN del receptor del factor de crecimiento epidérmico en células raras circulantes utilizando un sistema de aislamiento celular y PCR digital de gotas

Aprende a aislar células tumorales circulantes viables de muestras sanguíneas mediante un dispositivo de microtubos funcionalizado con E-selectina. Esta técnica biomimética captura CTCs sin daño celular para desarrollar terapias oncológicas personalizadas.

Rápido aislamiento de células tumorales viables de circulación de muestras de sangre del paciente

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