Name: Granulocitos dependiente de autoanticuerpos inducidos por ampollas en la piel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Aprenda a inducir ampollas cutáneas en ratones mediante transferencia pasiva de anticuerpos específicos contra colágeno VII. Este modelo reproduce la epidermólisis bullosa adquirida humana para estudiar enfermedades autoinmunes dermatológicas.

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Los autores reconocen el apoyo de subvenciones de la Deutsche Forschungsgemeinschaft SI-1281/4-1 y BIOSS de la Facultad de Medicina de la Universidad de Friburgo (para CS).

1. Preparación de anticuerpo patógeno Nota: La purificación y concentración de los anticuerpos se debe realizar en el mismo día, ya que los anticuerpos no son para ser almacenados en 0,1 M de glicina pH 2,5 a 3 (tampón de elución) durante la noche (ON). Purificación por afinidad de IgG: utilizar 25 ml de suero inmune de conejo: <ol><li> Descongele el suero de conejo en a 4 ° C, se mezcla 1:1 con tampón de 1xPBS () y centrifugar a 1260 se xg durante 10 min a 20 ° C. Opcionalmente, una etapa de filtración con papel de filtro podrían ser incluidos después de la centrifugación en caso de que el suero es graso. </li><li> Mientras tanto, lavar la proteína G matriz llena la columna con 10 volúmenes de lecho (volumen del lecho = volumen de la matriz) de 1XPBS (running buffer). </li><li> Aplicar el diluye y se filtra el suero a la columna y se incuba 1 h en la plataforma de agitación a temperatura ambiente (RT). </li><li> Recoger el flujo a través (FT) en un tubo Falcon de 50 ml. No lo deseche hasta que la concentracióny el título de la IgG purificada se conoce. </li><li> Lavar la matriz con 5 volúmenes de lecho de 1XPBS y mientras tanto preparar 50 ml tubos Falcon para la recogida de la fracción eluida con IgG. Pipetear 1 ml de tampón de pH neutralizante: 1 M Tris pH 10 en cada tubo (de lo contrario la proporción de 1:20 tampón TRIS relación a la cantidad de eluato a recoger). </li><li> Aplicar 100-150 ml de tampón de elución: glicina 0,1 M pH 2.5-3 a la columna y recoger 50 ml fracción (s). Da la vuelta al tubo 2-3x, medir el pH y añadir tampón de neutralización hasta que haya alcanzado el pH 7.2-7.4. </li><li> Recoger gotas de eluido IgG y utilizando el tampón de elución como etalón medir la DO a 280 nm. Si el OD es &lt;0,1 recolección de parada. </li><li> Regenerar la matriz de proteína G y almacenarlo siguiendo las instrucciones del fabricante. </li></ol> Concentración por ultrafiltración Amicon con tubos: <ol><li> Lavar el Ultra Amicon (15 ml / 30kDa) tubos de ultrafiltración por centrifugación con 1XPBS min 15-20a 3.220 xg, a 4 ° C. Deseche la FT del Amicon. </li><li> Llenar los Amicons con 15 ml de fracción eluida con IgG y centrifugar durante 25-30 min a 3.220 xg y 4 ° C, el tiempo de centrifugación siempre depende del contenido de proteína del eluato. </li><li> Deseche FT y repetir hasta ultrafiltración tiene ninguna fracción eluida a la izquierda. </li><li> Lavar el concentrado IgG ampliamente, dos veces, con 1XPBS 25-30 min de centrifugación. </li><li> Recoger el &quot;pegajosos&quot;, solución de anticuerpo amarillento del filtro Amicon en un volumen final de 1,500-2,000 l de 1XPBS. </li><li> Medir la concentración de preparación de IgG usando un espectrofotómetro o NanoDrop: Conc. (Mg / ml) = A (280 nm) x factor de dilución / 1,4 </li><li> Lavar y almacenar los Amicons siguiendo las instrucciones del fabricante. </li></ol> 2. La inyección de colágeno VII-IgG específica en ratones Antes de iniciar el procedimiento experimental actual, asegúrese de que el pro experimentaltocol está escrito y todos los materiales se preparan para el experimento. <ol><li> Preparar las hojas de datos para la toma de la enfermedad, las pruebas ELISA, inmunofluorescencia (IF) el análisis y la mieloperoxidasa (MPO) de ensayo 4. </li><li> Etiquete los tubos de sangre y de órganos, así como criomoldes histología procesamiento y la inclusión cassettes. </li><li> Las soluciones de anticuerpos debe ser preparado fresco o descongelado de las existencias y caracterizado con respecto a su reactividad (título por microscopía de IF y / o ELISA). La solución filtrada estéril de anticuerpos debe ser diluido en PBS de manera que la dosis requerida para la inyección varía entre 250-1000 l. Asegúrese de que tiene suficiente IgG para llevar a cabo el experimento. </li><li> Preparar fresco anticoagulante: heparina 20 U / ml y 8,7 mg / ml de ketamina / 1,3 mg / ml de mezcla de xilazina para la anestesia. Al sacrificar los ratones han etiquetado tubos con 3,7% de formaldehído preparado. </li><li> Esterilizar instrumental quirúrgico (bisturí, tijeras, punta fina y Curved forcipes) y preparar jeringas (jeringas de insulina, jeringas de 1 y 2 ml), agujas, cámara digital y tarjeta de memoria adicional. </li></ol> Nota: Realice todos los procedimientos realizados en ratones narcotizados ketamina / xilazina o isoflurano isoflurano es la opción preferida para la anestesia de los controles diario de la piel, como los ratones se recuperan rápidamente.. Sin embargo, cuando se toman fotografías ketamina, 87 mg / kg y 13 mg xylazina / kg generalmente se inyecta por vía subcutánea. Para la eutanasia la dosis de ketamina / xilazina se aumenta a 130 mg / kg de ketamina y xilazina 20 mg / kg. <ol><li> Compruebe los animales ya marcados por su estado general de salud, la piel y la apariencia de piel, pesarlos y medir su espesor de la oreja (siempre se adhieren a la misma oreja). </li><li> Registrar los valores observados y los cambios en la hoja de evaluación clínica. </li><li> Recoger 20-30 l (2-3 gotas) de sangre de la vena de la cola en una jeringa que contiene el mismo volumen de anticoagulante. </li><li> Desinfecte la piel ypiel con 80% de etanol. </li><li> Se inyecta la solución de anticuerpo por vía subcutánea en la parte posterior usando una jeringa de insulina. (Para determinados sitios (por ejemplo, de las orejas) sólo volúmenes pequeños (10-50 l) son factibles de ser inyectado.) </li></ol> Las inyecciones se repetirán cada segundo día, 4 veces. Balb / c y ratones C57BL6 de un peso corporal de aproximadamente 20 g comenzar a desarrollar la enfermedad 3-4 días después de la primera administración de 400-500 hasta 750 mg / g de peso corporal / inyección autoanticuerpos. Al terminar el experimento: <ol><li> Poner los ratones bajo anestesia profunda mediante la inyección de 130 mg / kg y 20 mg / kg de ketamina / xilazina por vía subcutánea, ellos exsanguinate de la vena cava posterior y cortar el corazón. </li><li> Recoger muestras de tejidos / órganos como la piel: rabo, las orejas, la sangre y el esófago y los pusieron en tubos previamente marcados y llenos de formaldehído PBS o el 3,7%. </li></ol> Al volver a lalaboratorio: <ol><li> Se centrifuga la sangre a 1.200 xg, 10 min a TA para separar el plasma, el plasma transferir a tubos adecuadamente etiquetados y almacenarlos en consecuencia. </li><li> Insertar la biopsia de piel en medio de la temperatura óptima de corte utilizando criomoldes correctamente, la etiqueta, y almacenar a -80 ° C. </li><li> Coloque las muestras de tejidos destinados a la histología en los moldes de incrustación etiquetados y mantenerlos en el 3,7% de formaldehído hasta la inclusión en parafina. </li></ol> 3. Evaluación clínica de la gravedad de la enfermedad Los ratones se examinaron diariamente para las lesiones de la piel y las mucosas y los resultados deben registrarse utilizando formularios correspondientes. Los criterios para una eutanasia precoz es lesiones de la piel que afecta a más que 20% de la superficie corporal y una pérdida de peso del 5-10% del peso corporal total en tres días consecutivos, contando para una puntuación de la enfermedad de 5 (Tabla 1). <ol><li> Coloque el cursor sobre su vientre. Comenzar con el área de la cabeza, es decir, con el derechooído y comprobar para ampollas, erosiones, costras en el interior así como en el lado exterior. Continúe de la misma manera con el oído izquierdo. </li><li> Los ojos derecho e izquierdo son controlados para detectar signos de eritema, alopecia, erosiones y / o corteza. </li><li> Frente y el área hocico se cepillan a través siguiente, continuando con la parte ventral de la boca, los labios y la mucosa de la boca. </li><li> Examine la pata delantera derecha a partir de la pata, moviéndose hacia arriba, cambiar a la pata delantera izquierda. El mismo procedimiento que con las patas traseras derecha e izquierda. </li><li> Cepille a través de la piel en el cuello y la zona de la espalda con unas pinzas de punta fina curva. </li><li> Ponga el ratón sobre su espalda y comprobar la parte ventral, así como los lados ventrales de las extremidades de la misma forma que anteriormente. </li><li> Compruebe la cola. </li><li> Tome fotos de las partes del cuerpo pertinentes cuando los ratones desarrollan la enfermedad. Se debe prestar atención a la calidad y cantidad de las imágenes. </li><li> Calcular los resultados clínicos de la enfermedad. </li></ol> 4. Análisis de muestras de piel y Plasma <ol><li> Elaborar, almacenar y / o procesar todos los tejidos recogidos de acuerdo con el plan. </li><li> Corte secciones de tejido congeladas por si la detección de anticuerpos de conejo y de ratón componentes del sistema del complemento. </li><li> Analizar los diferentes contenidos de proteína y enzima (MPO ensayo) de tejido congelados y / o extractos de órganos. </li><li> Sección el tejido embebido en parafina y tinción con H &amp; E para visualizar la magnitud del daño tisular. </li><li> Analizar el plasma por ELISA, inmunotransferencia. </li></ol>

<ol><li>Sitaru, C., Mihai, S., Otto, C., Chiriac, M. T., Hausser, I., Dotterweich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+dermal-epidermal+separation+in+mice+by+passive+transfer+of+antibodies+specific+to+type+VII+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Induction of dermal-epidermal separation in mice by passive transfer of antibodies specific to type VII collagen.</a> J. Clin. Invest. 115, 870-878 (2005).</li>
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<li>Sesarman, A., Oswald, E., Chiriac, M. T., Csorba, K., Vuta, V., Feldrihan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+human+pemphigoid+autoantibodies+do+not+trigger+disease+by+the+passive+transfer+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Why human pemphigoid autoantibodies do not trigger disease by the passive transfer into mice.</a> Immunol. Lett. , (2012).</li>
<li>Ishii, N., Recke, A., Mihai, S., Hirose, M., Hashimoto, T., Zillikens, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibody-induced+intestinal+inflammation+and+weight+loss+in+experimental+epidermolysis+bullosa+acquisita%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Autoantibody-induced intestinal inflammation and weight loss in experimental epidermolysis bullosa acquisita.</a> J. Pathol. 224, 234-244 (2011).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La transferencia pasiva de anticuerpos en animales de experimentación es un enfoque importante para demostrar su patogenicidad 7, -12. Los modelos animales obtenidos a través de este método, además de ser la evidencia indirecta de la autoinmunidad 13, permitir la investigación de la fase eferente de los mecanismos patogénicos. El modelo de transferencia pasiva de anticuerpos inducidos por granulocitos dependiente de la formación de ampollas en la piel epidermólisis bullosa adquirida (EBA) fue utili...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> antígeno recombinante </td><td></td><td></td><td> La codificación de los plásmidos de las formas recombinantes de colágeno VII murino están disponibles en el autor correspondiente. </td></tr><tr><td> suero inmune de conejo </td><td> <a href="http://www.eurogentec.com/" target="_blank">www.eurogentec.com</a> </td><td></td><td> Tuvimos conejos Nueva Zelanda Blanco inmunizados con 200 g de antígeno, 3 veces a intervalos de 2 semanas. Para ello se han utilizado los servicios de Eurogentec SA, Bélgica. </td></tr><tr><td> Proteína G agarosa </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11243233001 </td><td></td></tr><tr><td> Ratones Balb / c </td><td> Charles River Laboratories </td><td></td><td></td&gt; </tr><tr><td> Compuesto OCT, Tissue-Tek </td><td> Sakura Finetek </td><td> 4583 </td><td> Octubre, la temperatura óptima de corte </td></tr><tr><td> Criomolde estándar </td><td> Sakura Finetek </td><td> 4557 </td><td> 25 mm × 20 mm × 5 mm </td></tr><tr><td> Criomolde intermedio </td><td> Sakura Finetek </td><td> 4566 </td><td> 15 mm x 15 mm x 5 mm </td></tr><tr><td> Uni-Link-Einbettkassette </td><td> R. Langenbrinck </td><td> 09-0503 </td><td> Histología procesamiento y cassettes incrustación </td></tr><tr><td> Spezial-Tatowierfarbe Schwarz </td><td> H. Hauptnerund &amp; Richard Herberholz GmbH &amp; Co. KG </td><td> 71492000 </td><td> tatuajes pasta </td></tr><tr><td> Tatowierzange TZ1 </td><td> EBECO E. Becker &amp; Co GmbH </td><td></td><td> tatuajes dispositivo </td></tr><tr><td> La heparina </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co. </td><td> 7692.1 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldehído 37% </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co. </td><td> 7386 </td><td></td></tr><tr><td> El clorhidrato de ketamina </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH </td><td> K2753-1G </td><td></td></tr><tr><td> Xilazina clorhidrato </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH </td><td> X1251-1G </td><td></td></tr><tr><td> PBS estéril </td><td> Biochrom </td><td> L182-50 </td><td></td></tr><tr><td> cámara digital </td><td> Nikon </td><td> Coolpix 5400 </td><td></td></tr><tr><td> Jeringuilla accionada por unidad de filtro de 0,45 micras </td><td> Millipore </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Caliper </td><td> Mitutoyo 7309 </td><td> 1667338 </td><td> Farnell (distribuidor) </td></tr><tr><td> enfermedad hoja de puntuación </td><td></td><td></td><td> ejemplo enclosed </td></tr></tbody></table>

granulocitos dependiente de autoanticuerpos inducidos por ampollas en la piel

Granulocyte-dependent Autoantibody-induced Skin Blistering

Fenómenos autoinmunes se producen en individuos sanos, pero cuando la auto-tolerancia falla, la respuesta autoinmune puede dar lugar a una patología específica. Según Witebsky los postulados, uno de los criterios en el diagnóstico de una enfermedad autoinmune como es la reproducción de la enfermedad en animales de experimentación por la transferencia pasiva de anticuerpos. Para la epidermólisis bullosa adquirida (EBA), un prototipo de órganos específicos enfermedad autoinmune de la piel y membranas mucosas, varios modelos experimentales se establecieron recientemente. En el modelo animal descrito en el presente trabajo, se purificaron los anticuerpos IgG contra un tramo de 200 aminoácidos (aa 757-967) de colágeno VII se inyecta repetidamente a ratones que reproducen el fenotipo de formación de ampollas, así como funciones de la histo-e inmunopatológicos característicos a humanos EBA 1. El estallido de la enfermedad generalizada se ve generalmente 5-6 días después de la primera inyección y la extensión de la enfermedad se correlaciona con la dosis administrada de la collagen VII-IgG específica. El daño tisular (formación de ampollas) en la EBA experimental depende del reclutamiento y activación de granulocitos de tejido unidas a autoanticuerpos 2, -4. Por lo tanto, este modelo permite la disección de la vía inflamatoria dependiente de granulocitos implicados en el daño tisular autoinmune, como el modelo reproduce sólo las células T independiente de la fase eferente de la respuesta autoinmune. Además, su valor es subrayada por un número de estudios que demuestran el potencial de inducción de blister de autoanticuerpos in vivo e investigando el mecanismo de la formación de ampollas en EBA 1,3, -6. Por último, este modelo facilitará en gran medida el desarrollo de nuevas terapias antiinflamatorias en enfermedades inducidas por el autoanticuerpo. En general, el modelo de transferencia pasiva de los animales EBA es un modelo de la enfermedad accesible e instructivo y ayudará a los investigadores a analizar no sólo la patogenia EBA pero para responder fundamental biológica y clínicamentepreguntas esenciales autoinmunidad.

La transferencia pasiva de anticuerpos específicos de antígenos resultado de una enfermedad por completo soplado en ratones, se asemejan a los niveles clínicos, histológicos e inmunopatológicos la EBA humana. Las ampollas, costras y alopecia, erosiones desarrollar en las orejas, el hocico, patas, piernas, espalda y alrededor de los ojos de los ratones. Los primeros signos clínicos de la enfermedad es muy probable que aparezcan en los oídos y / o área de la cabeza. La deposición de IgG específica de conejo, ratón y compl...

En el modelo animal descrito en el presente trabajo, se purificaron los anticuerpos IgG contra un tramo de 200 aminoácidos (aa 757-967) de colágeno VII se inyecta repetidamente a ratones que reproducen el fenotipo de formación de ampollas, así como características de la histo-e inmunopatológicos característicos a humanos epidermólisis bullosa adquirida (EBA)<sup&gt; 1</sup&gt;.

Granulocitos dependiente de autoanticuerpos inducidos por ampollas en la piel

Los fenómenos autoinmunes se presentan en individuos sanos, pero cuando la autotolerancia falla, la respuesta autoinmune puede derivar en una patología específica. De acuerdo con...

Soy Cassian RO del Departamento de Dermatología de la Universidad de Friburgo, Alemania. La investigación de nuestro laboratorio se centra en la patogénesis de las enfermedades cutáneas autoinmunes. Una de las enfermedades autoinmunes que nos interesa es la Epidermólisis QUÍSTA o EBAA, una enfermedad autoinmune de órgano específico con un sistema de antígeno-autoanticuerpo bien definido, y para la cual existen modelos complementarios mutuamente exvivo y animales.La formación de ampollas en el EBA puede reproducirse mediante la transferencia pasiva de anticuerpos contra el colágeno tipo siete a ratones. Por lo tanto, en este artículo en video, presentaremos la inducción y el análisis del desarrollo de ampollas cutáneas en ratones mediante la transferencia pasiva de anticuerpos específicos contra el colágeno siete. Hola, soy King OBA del Grupo CAS del Departamento de Dermatología del Hospital Universitario de Freberg.En este vídeo, vamos a demostrar cómo se induce el modelo experimental de EBA en ratones mediante la transferencia pasiva de autoanticuerpos patógenos. Utilizamos este procedimiento al examinar los posibles mecanismos patógenos en trastornos cutáneos autoinmunes o al bus

granulocyte-dependent-autoantibody-induced-skin-blistering

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

La dermatitis herpetiforme (DH) es una enfermedad inflamatoria crónica caracterizada por una reacción autoinmune entre IgA y la epidermis transglutaminasa (ETG). DH se desarrolla en una porción muy pequeña de los pacientes con sensibilidad al gluten y / o enfermedad celíaca. Los resultados de este estudio indican que DH también puede desarrollarse en una gran mono rhesus con síntomas de la dermatitis idiopática.

Reconocimiento de la transglutaminasa epidérmica por IgA y anticuerpos transglutaminasa tisular 2 en un raro caso de Rhesus Dermatitis

Ensayos de inmunofluorescencia indirecta (IFI) se han utilizado tradicionalmente para la detección de anticuerpos antinucleares (ANA) en el suero humano. La presencia de estos anticuerpos puede ayudar en el diagnóstico de enfermedades reumáticas autoinmunes sistémicas (ADRS). Este protocolo se muestra cómo realizar efectivamente la técnica de IFI para detectar con precisión estos autoanticuerpos.

Antinuclear Anticuerpo de detección sistemática mediante células Hep-2

La transferencia de linfocitos bm12 a un receptor C57BL/6 es un modelo establecido de lupus eritematoso sistémico. Aquí describimos cómo iniciar la enfermedad utilizando este modelo y cómo caracterizar las células T foliculares auxiliares, las células B del centro germinal y las células plasmáticas mediante citometría de flujo.

El inducible Modelo BM12 del lupus eritematoso sistémico (LES) en ratones C57BL / 6 ratones

Presentamos una demostración del modelo de recuperación cutánea de ampolla de succión. El modelo permite un fácil acceso a estudiar humano en vivo respuesta inmune adaptativa, por ejemplo en el contexto del desarrollo de una vacuna.

Un protocolo de aspiración de la ampolla para estudiar células de T humanas recordar respuestas en Vivo

Este protocolo describe la generación de quimeras mixta médula ósea murina con centros germinales autoinmunitarios espontáneos, en autorreactivos que linfocitos llevan un reportero de la proteína verde fluorescente (GFP-PA) de photoactivatable. Esto proporciona la capacidad para vincular la localización celular en posteriores análisis moleculares y funcionales de los tejidos.

Interrogando a centros germinales autorreactivos individuales por fotoactivación en un modelo mixto de quimérico de la autoinmunidad

La prueba de activación basófila es una prueba diagnóstica in vitro complementaria para la evaluación de reacciones alérgicas mediadas por IgE basada en la detección de la activación basófila en presencia de un estímulo específico mediante la medida de marcadores de activación mediante citometría de flujo.

Prueba de activación de basófilos para el diagnóstico de alergia

El estudio demuestra el papel de la piel en la modulación de las respuestas inmunitarias en ratones a través de la inmunización epicutánea (EC). La inmunización de la AE con un antígeno proteico puede suprimir las respuestas inmunitarias en la hipersensibilidad de contacto o revertir la supresión inducida por la piel cuando se combina con patrones moleculares asociados a patógenos. La inmunización anticonceptiva anticonceptiva (AE) se muestra prometedora como un enfoque eficaz y sin agujas para...

Modelo murino de inmunomodulación inducida epicutáneamente

Las lesiones cutáneas son características comunes e importantes en muchas enfermedades reumáticas, y la biopsia con análisis patológico desempeña un papel fundamental en el diagnóstico. Este artículo proporciona una descripción detallada del procedimiento estandarizado de biopsia de piel y, utilizando como ejemplo el lupus eritematoso discoide, destaca el papel esencial de la dermatopatología en el diagnóstico de enfermedades reumáticas.

Biopsia de piel para el diagnóstico del lupus eritematoso discoide

Optimización del modelo de hámster experimental para la leishmaniasis cutánea por inyección intradérmica...

La leishmaniasis cutánea en la piel dorsal de los hámsteres: un modelo útil para la selección de fármacos antileishmania

En este artículo se describe un método para visualizar la formación de una sinapsis virológica de VIH-1 sobre de cristal inducido por el apoyo bicapas planas de reflexión total interna de fluorescencia (TIRF) microscopía. El método también se puede combinar con la tinción de inmunofluorescencia para detectar la activación y la redistribución de las moléculas de señalización que se producen durante el VIH-1 sobre inducida por la formación de sinapsis virológicas.

Imagen del VIH-1 sobre inducida sinapsis virológica y señalización en la bicapa lipídica sintéticas

Aprenda a inducir ampollas cutáneas en ratones mediante transferencia pasiva de anticuerpos específicos contra colágeno VII. Este modelo reproduce la epidermólisis bullosa adquirida humana para estudiar enfermedades autoinmunes dermatológicas.

Granulocitos dependiente de autoanticuerpos inducidos por ampollas en la piel

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