Sensibles al voltaje Dye grabación de axones, dendritas y espinas dendríticas de las neuronas individuales en rodajas de cerebro

El objetivo general de los experimentos descritos es el monitoreo de la integración de señales de potencial de membrana y el procesamiento de información por parte de una célula nerviosa individual ópticamente con una resolución submicrométrica y submilimétrica de segundo desde múltiples sitios en una neurona. Esto se logra construyendo primero una configuración de imágenes con la sensibilidad adecuada para permitir el registro de pequeños cambios fraccionales en la intensidad de la luz correspondientes al transitorio del potencial de membrana. A continuación, seleccione las neuronas con la anatomía adecuada para obtener imágenes efectivas de neuronas con procesos largos e intactos en un solo plano focal cerca de la superficie del corte.

A continuación, cargue las neuronas preseleccionadas con tintes sensibles al voltaje para permitir el seguimiento óptico de los cambios de potencial de membrana. Los resultados muestran la capacidad única de este enfoque para obtener información sobre la integración de señales eléctricas por parte de las células nerviosas individuales mediante el monitoreo de señales de potencial de membrana de axones, dendritas y espinas dendríticas. En neurofisiología celular.

Se están desarrollando nuevas herramientas debido a las dos limitaciones de larga data de la electrofisiología convencional, la baja resolución espacial de las mediciones de electrodos y la incapacidad de registrar a partir de estructuras pequeñas como los colaterales de los axones o las espinas dendríticas. Para superar estos inconvenientes, el enfoque de electrodos de parche se puede combinar con técnicas ópticas que permiten grabaciones paralelas de todas las partes de un neuro. Aquí describimos dicha técnica, registro óptico de múltiples lados de transitorios de potencial de membrana con resolución de una sola espina.

En este experimento, se utiliza un microscopio vertical y tres cámaras para ajustar la iluminación uniforme. En primer lugar, inserte un filtro de densidad neutra adecuado en la trayectoria del rayo láser. A continuación, enfoque el objetivo en la superficie del portaobjetos fluorescente estándar.

Mientras observa la imagen CCD del campo de visión en la pantalla del monitor, ajuste la posición del extremo receptor de la guía de luz de cuarzo y la posición del extremo de salida de la guía de luz utilizando los actuadores apropiados en el condensador de epifluorescencia para lograr una iluminación centrada y uniforme del campo de visión. Para determinar el ruido vibratorio, utilice un portaobjetos fluorescente estándar con una marca no fluorescente en la superficie. Registre la intensidad de la luz con el neuro CCD en modo continuo.

Enfoque el objetivo en un borde oscuro de la marca negra y registre la intensidad de la luz durante unos 100 milisegundos a una velocidad de fotogramas de dos kilohercios. A continuación, visualice el promedio espacial de las trazas de intensidad de luz fraccionada de aproximadamente 20 píxeles que reciben luz del área iluminada uniformemente y de aproximadamente 20 píxeles a lo largo del borde de la marca negra. El exceso de ruido en el promedio espacial de los píxeles con bordes de alto contraste refleja el ruido vibratorio en el sistema.

Es esencial tener el obturador mecánico montado fuera de la mesa de aislamiento de vibraciones para que la apertura del obturador no introduzca ruido vibratorio en la grabación óptica. Este es un paso crítico. Monte el obturador con tornillos de plástico y material de aislamiento de vibraciones para reducir el ruido vibratorio acústico que puede ser captado por el sistema de grabación óptica.

Para aislar la vibración, ajuste la tabla de aislamiento de vibraciones hasta que el ruido de vibración de los píxeles que cubren el borde nítido de la imagen sea menor que el ruido de la toma. Los cables del equipo en la mesa deben estar sueltos para evitar la transmisión de las vibraciones mecánicas al microscopio. En este procedimiento, prepare los cortes de cerebro de 300 a 400 micras de espesor de acuerdo con los procedimientos estándar con una línea de ratón que expresa EGFP en células nerviosas individuales de interés con un sistema confocal de disco giratorio.

Visualice las neuronas marcadas con EGFP en el corte. A continuación, seleccione las neuronas con árboles axonales dendríticos intactos y con procesos que se ejecutan en paralelo y cerca de la superficie del corte para obtener imágenes de potencial de membrana. A continuación, llene una pipeta de parche de vidrio desde la punta con una solución intracelular sin colorante hasta dos tercios del cono del electrodo aplicando presión negativa durante unos 15 segundos.

Después de eso, rellene el electrodo con la solución que contiene el tinte sensible al voltaje del permeado IMP de membrana disuelto en la solución intracelular. Ahora, parchee una neurona previamente seleccionada dentro de un minuto después de cargar el tinte en el electrodo. Aplique una presión positiva baja de unos 10 milímetros de mercurio antes de que la pipeta se baje al baño y, mientras coloca el electrodo en la rebanada, esto asegura que no se escape ningún tinte del electrodo antes de que se establezca el sello.

Aumente a alta presión alrededor de 100 milímetros de mercurio justo antes de que el electrodo entre en contacto con la superficie de la celda. Estableciendo el sello en toda la configuración de la célula, permita la libre difusión del colorante desde una pipeta de parche somático hasta el soma durante 20 a 45 minutos. Durante la difusión teñida, controle el estado fisiológico de la neurona registrando los potenciales de acción evocados en el modo de pinza de corriente.

Además, controle la cantidad de tinción registrando la intensidad de la luz en reposo del soma de la celda a una velocidad de fotogramas de dos kilohercios y a una fracción de la intensidad de luz completa ajustada con filtros de densidad neutra. Continúe el proceso de descarga hasta que el potencial de acción comience a ampliarse. Al final de la tinción, retire con cuidado la pipeta de parche del soma en la configuración de pinza de voltaje para asegurarse de que la transición de la celda completa a la configuración de parche de afuera hacia afuera se logre en el proceso.

A continuación, incuba el corte durante 1,5 a dos horas adicionales a temperatura ambiente para permitir que el tinte sensible al voltaje se extienda a los procesos neuronales. Después de que una cantidad significativa de tinte se haya difundido desde el soma hacia los procesos dendríticos y axonales, la forma de onda del potencial de acción debe restaurarse por completo. En el siguiente paso, ubique el soma de la neurona de tinción bajo la fluorescencia de baja intensidad.

Reduzca la intensidad de la luz con filtros de densidad neutra al mínimo requerido para visualizar el objeto de interés utilizando una etapa XY Escanee el área de la rebanada que contiene la neurona fluorescente hasta que se identifique el soma fluorescente. Coloque el soma de la célula teñida en el centro del campo del microscopio para recortar la neurona con un electrodo de parche estándar sin tinte debajo del DIC. A continuación, visualice los procesos neuronales bajo la fluorescencia de baja intensidad a una velocidad de fotogramas de 10 a 40 hercios en el modo de grabación continua del CCD para la obtención de imágenes de voltaje.

Usando una posición de etapa XY, el proceso neuronal de interés en el centro del área de imagen. Además, proteja el SOMA de la luz de excitación utilizando el iris de tope de campo parcialmente cerrado del microscopio para reducir el daño fotodinámico. A continuación, registre las señales ópticas relacionadas con los potenciales de acción de retropropagación en las ramas dendríticas individuales.

A continuación, registre las señales ópticas relacionadas con los potenciales de acción en el axón. Después de eso, registre las señales ópticas relacionadas con los potenciales de acción de retropropagación en las espinas dendríticas. Utilice la velocidad de fotogramas adecuada para una reconstrucción precisa de la forma de onda de la señal.

Al mismo tiempo, mantenga los períodos de registro y la exposición a la luz de excitación de alta intensidad lo más cortos posible para minimizar el blanqueo del tinte y el daño fotodinámico. Aquí se muestra el registro de señales ópticas. Aquí. El panel superior muestra la imagen confocal de alta resolución de una neurona teñida con su axón en la posición de grabación.

Mientras que el panel central muestra la imagen de fluorescencia de baja resolución espacial del axón obtenida por CCD utilizada para la obtención de imágenes de potencial de membrana, el panel inferior presenta las grabaciones de electrodos del soma y las grabaciones ópticas del IS A y el nodo de rvi. Se muestran los datos brutos y las señales procesadas. Esta figura muestra las señales de potencial de acción del axón de una neurona cortical L 5 cargada con la acción del colorante sensible al voltaje.

Las señales relacionadas con el potencial se registraron a una velocidad de fotogramas de 10 kilohercios. Estas trazas indican el potencial de acción transitorio desde tres ubicaciones. Uno, el registro del electrodo del soma.

Dos, las grabaciones ópticas de la montura de axones, y tres, la grabación óptica de la primera nota de vie, y aquí están las señales superpuestas de las mismas tres ubicaciones. Esta figura muestra una ráfaga de cuatro señales de potencial de acción que se propagan hacia atrás desde múltiples ubicaciones en el eje dendrítico de una neurona cortical L 5 iniciada por pulsos cortos de corriente despolarizante a 100 hercios. Aquí se muestran las señales de potencial de acción de una espina dendrítica individual.

Aquí está la reconstrucción anatómica obtenida de una pila de imágenes confocales de disco giratorio, y aquí está la imagen de fluorescencia de la misma región obtenida con la cámara CCD. Para las imágenes de potencial de membrana, las trazas de intensidad de fluorescencia correspondientes a los potenciales de acción de retropropagación de las ubicaciones uno a tres, como se describe en la imagen CCD, se muestran en el panel derecho. El trazo inferior indica el registro del electrodo desde el soma.

La preparación de la pregrabación dura unas tres horas, incluido el período de espera para que los dados se extiendan a los procesos distales. El tiempo de registro está limitado por el agotamiento normal de la preparación y por el daño fotodinámico de PO. La cantidad de daño fotodinámico es proporcional a la intensidad de la luz de excitación y a la duración y el número de ensayos de grabación individuales.

En algunos experimentos, es posible llevar a cabo más de 50 ensayos de grabación durante una o dos horas. Otras mediciones requieren alta excitación, intensidades de luz y grabaciones más largas, y están limitadas por el daño fotodinámico a solo varios ensayos de grabación. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo llevar a cabo imágenes de voltaje de toda la estructura axonal y endr de las neuronas individuales en cortes de cerebro.