Sensibles al voltaje Dye grabación de axones, dendritas y espinas dendríticas de las neuronas individuales en rodajas de cerebro

El objetivo general de los experimentos descritos es el seguimiento de la integración de señales del potencial de membrana y del procesamiento de información por una sola célula nerviosa de forma óptica, con resolución submicrométrica y submilisegundo desde múltiples sitios en una neurona. Esto se logra primero construyendo un sistema de formación de imágenes con sensibilidad adecuada para permitir el registro de pequeños cambios fraccionales en la intensidad de la luz correspondientes al transitorio del potencial de membrana. A continuación, seleccione las neuronas con anatomía adecuada para obtener imágenes eficaces de neuronas con prolongaciones largas e intactas en un único plano focal cercano a la superficie del corte.

Luego cargue las neuronas preseleccionadas con colorantes sensibles al voltaje para permitir el seguimiento óptico de los cambios en el potencial de membrana. Los resultados muestran la capacidad única de este enfoque para obtener información sobre la integración de señales eléctricas en células nerviosas individuales mediante el monitoreo de señales de potencial de membrana en axones, dendritas y espinas dendríticas. En neurofisiología celular.

Se están desarrollando nuevas herramientas debido a las dos limitaciones históricas de la electrofisiología convencional: la baja resolución espacial de las mediciones con electrodos y la imposibilidad de registrar señales provenientes de estructuras pequeñas, como colaterales axónicos o espinas dendríticas. Para superar estos inconvenientes, el enfoque con electrodos de parche puede combinarse con técnicas ópticas que permiten grabaciones paralelas de todas las partes de una neurona. Aquí describimos una técnica de este tipo: grabación óptica múltiple lateral de transitorios del potencial de membrana con resolución a nivel de una sola espina.

En este experimento, se utiliza un microscopio invertido y tres cámaras para ajustar una iluminación uniforme. Primero, inserte un filtro neutro de densidad adecuado en la trayectoria del haz láser. A continuación, enfoque el objetivo sobre la superficie del portaobjetos fluorescente estándar.

Mientras observa la imagen CCD del campo de visión en la pantalla del monitor, ajuste la posición del extremo receptor de la guía de luz de cuarzo y la posición del extremo de salida de la guía de luz mediante los actuadores adecuados del condensador de fluorescencia epiluminiscente para lograr una iluminación centrada y uniforme del campo de visión. Para determinar el ruido vibracional, utilice una lámina fluorescente estándar con una marca no fluorescente en la superficie. Registre la intensidad de la luz con el CCD neuro en modo continuo.

Enfoque el objetivo en un borde oscuro de la marca negra y registre la intensidad de luz durante aproximadamente 100 milisegundos a una frecuencia de cuadro de dos kilohercios. Luego, muestre el promedio espacial de las trazas de intensidad de luz fraccional provenientes de aproximadamente 20 píxeles que reciben luz de la zona uniformemente iluminada y de aproximadamente 20 píxeles a lo largo del borde de la marca negra. El ruido excesivo en el promedio espacial proveniente de los píxeles con bordes de alto contraste refleja el ruido vibracional en el sistema.

Es esencial que el obturador mecánico esté montado fuera de la mesa de aislamiento de vibraciones para que la apertura del obturador no introduzca ruido vibracional en el registro óptico. Este es un paso crítico. Monte el obturador utilizando tornillos de plástico y material de aislamiento de vibraciones para reducir el ruido vibracional acústico que puede ser captado por el sistema de registro óptico.

Para aislar la vibración, ajuste la mesa de aislamiento de vibraciones hasta que el ruido por vibración de los píxeles que cubren el borde nítido de la imagen sea menor que el ruido de disparo. Los cables del equipo sobre la mesa deben estar sueltos para evitar transmitir vibraciones mecánicas al microscopio. En este procedimiento, prepare cortes cerebrales de 300 a 400 micrones de grosor según procedimientos estándar, utilizando una línea de ratón que expresa EGFP en neuronas individuales de interés, con un sistema confocal de disco giratorio.

Visualice las neuronas marcadas con EGFP en el corte. A continuación, seleccione las neuronas con árboles dendríticos y axonales intactos, y con prolongaciones que corran paralelas y cercanas a la superficie del corte para la obtención de imágenes del potencial de membrana. Luego, llene una pipeta de parche de vidrio desde la punta con solución intracelular sin colorante hasta dos tercios de la zona cónica del electrodo, aplicando presión negativa durante aproximadamente 15 segundos.

Después de eso, rellene el electrodo con la solución que contiene el colorante sensible al voltaje del permeato de IMP de la membrana disuelto en la solución intracelular. A continuación, realice un parche sobre una neurona previamente seleccionada dentro del minuto siguiente a la carga del colorante en el electrodo. Aplique una presión positiva baja de aproximadamente 10 milímetros de mercurio antes de bajar la pipeta en el baño y mientras posiciona el electrodo en el trozo, lo cual asegura que ningún colorante se filtre fuera del electrodo antes de que se establezca el sello.

Aumente hasta una presión alta de aproximadamente 100 milímetros de mercurio justo antes de que el electrodo entre en contacto con la superficie celular. Para establecer el sello en la configuración de célula íntegra, permita la difusión libre del colorante desde una pipeta de parche somática hacia el soma durante 20 a 45 minutos. Durante la difusión del colorante, supervise el estado fisiológico de la neurona registrando los potenciales de acción evocados en el modo de fijación de corriente.

Además, supervise la cantidad de tinción registrando la intensidad luminosa en reposo del soma celular a una frecuencia de cuadros de dos kilohercios y a una fracción de la intensidad luminosa máxima ajustada con filtros de densidad neutra. Continúe el proceso de descarga hasta que el potencial de acción comience a ensancharse. Al final de la tinción, retire cuidadosamente la pipeta de registro del soma en configuración de clamp de voltaje para asegurar que se logre la transición de la configuración de célula íntegra a la configuración de parche fuera de la célula.

A continuación, incube la sección durante 1,5 a dos horas adicionales a temperatura ambiente para permitir que el colorante sensible al voltaje se difunda hacia los procesos neuronales. Después de que una cantidad significativa de colorante haya difundido desde el soma hacia los procesos dendríticos y axónicos, la forma de onda del potencial de acción debería restaurarse completamente. En el siguiente paso, localice el soma de la neurona teñida bajo fluorescencia de baja intensidad.

Reduzca la intensidad de luz con filtros de densidad neutra al mínimo necesario para visualizar el objeto de interés utilizando una platina XY. Explore el área del corte que contiene la neurona fluorescente hasta identificar el soma fluorescente. Coloque el soma de la célula teñida en el centro del campo del microscopio. Repare la neurona con un electrodo de parche estándar sin colorante bajo DIC. Luego, visualice los procesos neuronales bajo fluorescencia de baja intensidad a una velocidad de cuadro de 10 a 40 hercios en el modo de grabación continua del CCD para la imagen de voltaje.

Utilizando una posición del escenario XY, coloque el proceso neuronal de interés en el centro del área de imagen. Además, proteja el SOMA de la luz de excitación utilizando el diafragma de campo parcialmente cerrado del microscopio para reducir el daño fotodinámico. A continuación, registre las señales ópticas relacionadas con los potenciales de acción propagados hacia atrás en las ramas dendríticas individuales.

Luego registre las señales ópticas relacionadas con los potenciales de acción en el axón. Después, registre las señales ópticas relacionadas con los potenciales de acción que se propagan hacia atrás en las espinas dendríticas. Utilice la frecuencia de cuadros adecuada para una reconstrucción precisa de la forma de onda de la señal.

Al mismo tiempo, mantenga los períodos de grabación y la exposición a la luz de excitación de alta intensidad lo más cortos posible para minimizar el desvanecimiento del colorante y el daño fotodinámico. Aquí se muestra la grabación de señales ópticas. El panel superior muestra la imagen confocal de alta resolución de una neurona teñida con su axón en la posición de registro.

Mientras que el panel central muestra la imagen de fluorescencia de baja resolución espacial del axón obtenida mediante CCD, utilizada para la obtención de imágenes del potencial de membrana, el panel inferior presenta las grabaciones con electrodos del soma y las grabaciones ópticas del AIS y el nodo de Ranvier. Se muestran los datos brutos y las señales procesadas. Esta figura muestra las señales del potencial de acción provenientes del axón de una neurona cortical L5 cargada con el colorante sensible al voltaje Action.

Las señales potencialmente relacionadas se registraron a una frecuencia de muestreo de 10 kilohercios. Estos trazos indican el transitorio del potencial de acción desde tres ubicaciones. Uno, el electrodo que registra desde el soma.

Dos, las grabaciones ópticas del cono axónico, y tres, la grabación óptica del primer nódulo de Ranvier, y aquí se muestran las señales superpuestas provenientes de estas mismas tres ubicaciones. Esta figura muestra un estallido de cuatro señales de potenciales de acción retrogrados provenientes de múltiples localizaciones en el árbol dendrítico de una neurona cortical L5, iniciado por pulsos cortos de corriente despolarizante a 100 hertz. Se muestran aquí las señales de potencial de acción provenientes de una espina dendrítica individual.

Aquí se muestra la reconstrucción anatómica obtenida a partir de una serie de imágenes confocales de disco giratorio, y aquí está la imagen de fluorescencia de la misma región obtenida con la cámara CCD. Para la imagen del potencial de membrana, las trazas de intensidad de fluorescencia correspondientes a potenciales de acción propagados hacia atrás desde las ubicaciones uno a tres, tal como se indica en la imagen CCD, se muestran en el panel derecho. La traza inferior indica el registro del electrodo proveniente del soma.

La preparación previa a la grabación toma aproximadamente tres horas, incluyendo el período de espera para que los procesos distales se extiendan. El tiempo de grabación está limitado por la degradación normal de la preparación y por el daño fotodinámico del PO. La cantidad de daño fotodinámico es proporcional a la intensidad de la luz de excitación, así como a la duración y al número de ensayos individuales de grabación.

En algunos experimentos, es posible realizar más de 50 ensayos de grabación durante una o dos horas. Otras mediciones requieren una excitación elevada, intensidades de luz altas y grabaciones más prolongadas, y están limitadas por el daño fotodinámico a solo varios ensayos de grabación. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar imágenes de voltaje desde toda la estructura axonal y terminal de neuronas individuales en cortes cerebrales.