Exploración del músculo liso arterial KV7 función del canal de potasio mediante electrofisiología Patch Clamp y miografía presión

El objetivo general de este procedimiento es medir la actividad de los siete canales de potasio KV en las células del músculo liso de la arteria mesentérica recién disociada, y relacionarlo con las mediciones del diámetro arterial registradas en condiciones fisiológicas. Esto se logra extirpando primero quirúrgicamente la arcada vascular mesentérica de una rata. El segundo paso es diseccionar y limpiar los segmentos de las arterias mesentéricas.

A continuación, se utilizan algunos segmentos para aislar células individuales de músculo liso para mediciones electrofisiológicas de KV siete corrientes de potasio. El paso final es la canulación de segmentos arteriales intactos para medir la presión mio de la constricción o dilatación arterial en respuesta a los moduladores farmacológicos de los siete canales de potasio KV. En última instancia, la combinación de la electrofisiología de la pinza de parche y la miografía de presión se utiliza para mostrar cómo un aumento o una disminución en la actividad de los siete canales de potasio KV afecta la constricción arterial mesentérica.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el uso de canales clonados expresados en líneas celulares, es que las corrientes se registran a partir de células no cultivadas que expresan los canales de forma nativa y las corrientes KV se pueden aislar de otras clases de canales de potasio que pueden activarse en las mismas células. La miografía de presión permite registrar las respuestas funcionales desde el mismo tejido del que se derivan las células aisladas, y el método es más sensible y más fisiológico que otras preparaciones como los anillos arteriales o las tiras arteriales. El Dr. Bareth Mani, becario postdoctoral de mi laboratorio, demostrará las técnicas de canulación arterial y miografía a presión y la Dra. Luba Brueggeman, profesora asistente de investigación en mi laboratorio, demostrará los procedimientos de aislamiento celular y plan de parche.

Para comenzar este procedimiento, use un par de tijeras quirúrgicas para cortar un segmento de 10 a 12 centímetros en ambos extremos del intestino delgado de una rata. A continuación, aísle el intestino junto con su vasculatura adherida. A continuación, sujeta con alfileres el segmento del intestino delgado.

Extienda el mesentario sobre el lado cercano de la cámara de manera que la rama primaria de la arteria mesentérica superior esté en el centro y el orden subsiguiente de ramas irradie desde el centro. Luego coloque los alfileres solo en los segmentos intestinales visualizando a través de un microscopio de disección iluminado. Limpie cuidadosamente el tejido adiposo y el tejido conectivo que rodea las arterias de segundo a cuarto orden cerca de los intestinos con micropinzas y tijeras.

Sujete las venas adyacentes para facilitar la limpieza del tejido adiposo y el tejido conectivo y evitar el estiramiento innecesario de las arterias. Ahora transfiera dos o tres segmentos de la arteria mesentérica a una placa de cultivo de tejidos de 35 milímetros que contiene dos mililitros de solución de aislamiento helada. Coloque el plato en hielo después, corte los segmentos de la arteria mesentérica en trozos de tres a cuatro milímetros de largo con una pipeta PE con una punta pulida al fuego.

Transfiera los segmentos arteriales a un frasco de vidrio que contenga dos mililitros de solución aislante precalentada a 37 grados Celsius. Luego incubarlo durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Después de 30 minutos, aspire cuidadosamente la solución aislante a 37 grados centígrados con una pipeta posterior.

Agregue dos mililitros de solución enzimática tibia, luego incube durante 35 minutos a 37 grados centígrados. Inmediatamente después de la incubación de 35 minutos en la solución enzimática, coloque el vial en hielo, aspire la solución enzimática y agregue dos mililitros de solución aislante helada. Repita este procedimiento cuatro veces.

Luego, en un mililitro de solución aislante helada, repita suavemente los segmentos arteriales con la pipeta posterior pulida de 10 a 20 veces para liberar las células individuales del músculo liso de la arteria mesentérica. Verifique la apariencia de los miocitos periódicamente colocando una gota de la suspensión celular en un plato de 35 milímetros y observándolos bajo el microscopio.

Las SMC MA sanas deben tener una apariencia lisa y alargada. A continuación, transfiera aproximadamente de 100 a 200 microlitros de suspensión celular a la cámara de registro con una pipeta pastosa pulida y deje que las celdas se adhieran durante 15 minutos. En este paso, llene la punta de la pipeta de parche con anfotericina B, solución interna libre inclinando la punta de la pipeta en ella.

A continuación, aplique la succión en el otro extremo con una jeringa de 10 mililitros conectada a través de un trozo de tubo que contenga la solución de pipeta desde la parte superior. Uso de la punta de pipeta de un microcargador einor hasta que la pipeta esté aproximadamente medio llena de solución. Elimine las burbujas de aire dando golpecitos suaves en la pipeta.

Después de eso, inserte la pipeta en el soporte de electrodos. Utilice un micromanipulador para bajar la pipeta a la superficie de un miocito alargado. Cuando la resistencia de la pipeta aumente de seis a 10 mega ohmios, aplique succión para lograr un giga sellado.

Al mismo tiempo, ajuste el voltaje de retención a cero milivoltios mientras espera la perforación de la membrana. A continuación, aplique pasos de voltaje de 100 milisegundos a más 10 milivoltios y luego a menos 10 milivoltios. Utilice el amplificador para compensar el transitorio de capacitancia rápida de la pipeta concurrente con la aparición de la capacitancia de toda la celda.

Las pequeñas corrientes positivas sostenidas transitorias de dos a 10 amperios PICO, puras y de amplitud indican la presencia de siete canales KV funcionales. La perforación exitosa con anfotericina B reducirá la resistencia de acceso a 35 mega ohmios o menos. Para registrar la relación de voltaje de corriente de KV siete, aplique pasos de voltaje de cinco segundos a voltajes que van desde menos 84 milivoltios en los que la probabilidad de apertura de KV siete canales es mínima hasta más 16 milivoltios en los que la probabilidad de apertura de KV siete canales alcanza una meseta Después de cinco segundos en cada voltaje de prueba, retroceda al voltaje de retención a menos cuatro milivoltios durante 10 segundos.

En este procedimiento, suspenda sin apretar dos suturas finas de nailon prefabricadas a cada lado. Junto a la cánula de vidrio, transfirió cuidadosamente el segmento de la arteria mesentérica disecado de la cámara de disección a la cámara de mioinjerto de presión sosteniendo un extremo del segmento con un par de micropinzas. A continuación, visualizando a través de un microscopio de disección iluminado, sostenga un extremo del segmento de la arteria y deslícelo suavemente sobre la cánula de vidrio izquierda.

Asegure el extremo con las suturas de nylon. A continuación, enjuague suavemente el líquido lumínico a través del vaso montado para eliminar la sangre y los residuos. A continuación, se debe cerrar la válvula de la jeringa izquierda de modo que este lado presente una columna estática de líquido contra la que se ajuste la presión desde el lado derecho, utilizando el micromanipulador se coloca la cánula de vidrio derecha móvil más cerca del segmento arterial y se tira del extremo derecho del segmento sobre él.

Finalmente, asegure el segmento de la arteria con suturas de nailon y corte el exceso de hilos de sutura. Ahora monte la unidad de gráfico de presión en la platina sobre el microscopio de micrografía de presión. Conecte la columna de presión al lado derecho de la cámara gráfica y luego coloque la tapa sobre la cámara.

Eleve gradualmente la jeringa de 10 mililitros durante un período de 15 minutos y verifique si hay fugas en el recipiente hasta que el transductor de presión P one lea 80 milímetros de mercurio ajuste la distancia entre la cánula cuando sea necesario, la distancia debe ajustarse de tal manera que el segmento de la arteria presurizada sea aproximadamente recto y forme un patrón similar al hombro donde se hacen las ataduras. Comprobar la viabilidad del recipiente montado mediante la superfusión transitoria con cloruro de potasio 60 milimolares durante 30 segundos. Un recipiente viable se contrae rápidamente con la adición de cloruro de potasio y se dilata inmediatamente después de su lavado.

A continuación, añada directamente la sustancia problema concentrada a la solución de baño y píplela suavemente cerca del extremo de la cámara para mezclar la sustancia problema en la solución de baño, obteniendo la concentración final adecuada en la cámara de 10 mililitros. Los cambios de volumen en el diámetro del recipiente tras la adición de la sustancia problema pueden monitorizarse en la imagen de vídeo en directo y también trazarse en la ventana de análisis de imágenes mientras el experimento está en curso. Esta figura muestra una familia de trazas de corriente secuenciales registradas en respuesta a pasos de voltaje antes del tratamiento como se muestra en negro y después de la estabilización en presencia de perión de zinc de 100 nanomolares en un solo miocito de arteria mesentérica como se muestra en rojo, aquí están las corrientes representativas para el control y para el perión de zinc de 100 nanomolares.

Las barras grises indican el intervalo de tiempo en el que se midieron las amplitudes de corriente promediadas. Para los gráficos de voltaje actual, los voltajes de paso se indican a la derecha con puntas de flecha. Este es el curso del tiempo de la mejora de corriente de KV siete por perión de zinc de 100 nanomolares medido con pinza de voltaje continuo a menos 20 milivoltios. Mostrado. Aquí están las curvas de voltaje de corriente promediadas derivadas de las densidades de corriente KV siete registradas anteriormente durante el tratamiento con 100 nanomolares de zinc perion, y durante el tratamiento con 10 micromolares del bloqueador de siete canales KV XC 9 9 1 relajación inducida por iones de zinc de la arteria mesentérica pre constreñida con 100 picomolares arginina vasopresina.

Esta figura muestra el curso temporal de los cambios en el diámetro exterior del vaso en respuesta a la aplicación de 100 picomolares arginina vasopresina, seguida de la aplicación de 100 nanomolares de iones de zinc. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar las arterias para el aislamiento de células individuales o para la medición miográfica de la presión de la constricción arterial, las respuestas dilatadoras. Además, debe saber cómo registrar las corrientes KV siete de forma aislada de otras corrientes en miocitos arteriales recién aislados.