Name: Exploración del músculo liso arterial KV7 función del canal de potasio mediante electrofisiología Patch Clamp y miografía presión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Aprende a medir la actividad de canales de potasio Kv7 en células de músculo liso arterial mesentérico mediante electrofisiología de patch clamp y miografía de presión. Este método permite correlacionar la actividad iónica con cambios en el diámetro arterial.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabajo fue financiado por una subvención del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre (NIH R01-HL089564) para KLB y becas predoctorales de la American Heart Association (09PRE2260209) y Arthur J. Schmitt Fundación BKM.

<ol><li>Passmore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCNQ%2FM+Currents+in+Sensory+Neurons%3A+Significance+for+Pain+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">KCNQ/M Currents in Sensory Neurons: Significance for Pain Therapy.</a> J. Neurosci. 23, 7227-7236 (2003).</li>
<li>Falloon, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+small+artery+sensitivity+and+morphology+in+pressurized+and+wire-mounted+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of small artery sensitivity and morphology in pressurized and wire-mounted preparations.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 268, H670-H678 (1995).</li>
<li>Dunn, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+resistance+artery+sensitivity+to+agonists+under+isobaric+compared+with+isometric+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enhanced resistance artery sensitivity to agonists under isobaric compared with isometric conditions.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 266, H147-H155 (1994).</li>
<li>Buus, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+sensitivity+of+rat+mesenteric+small+arteries+to+agonists+when+studied+as+ring+preparations+or+as+cannulated+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Differences in sensitivity of rat mesenteric small arteries to agonists when studied as ring preparations or as cannulated preparations.</a> Br. J. Pharmacol. 112, 579-587 (1994).</li>
<li>Abdelhalim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+big+endothelin-1+in+comparison+with+endothelin-1+on+the+microvascular+blood+flow+velocity+and+diameter+of+rat+mesentery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of big endothelin-1 in comparison with endothelin-1 on the microvascular blood flow velocity and diameter of rat mesentery in vivo.</a> Microvasc. Res. 72, 108-112 (2006).</li>
<li>Altura, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-response+relationships+for+arginine+vasopressin+and+synthetic+analogs+on+three+types+of+rat+blood+vessels%3A+possible+evidence+for+regional+differences+in+vasopressin+receptor+sites+within+a+mammal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Dose-response relationships for arginine vasopressin and synthetic analogs on three types of rat blood vessels: possible evidence for regional differences in vasopressin receptor sites within a mammal.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 193, 413-423 (1975).</li>
<li>Henderson, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasopressin-induced+vasoconstriction%3A+two+concentration-dependent+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Vasopressin-induced vasoconstriction: two concentration-dependent signaling pathways.</a> J. Appl. Physiol. 102, 1402-1409 (2007).</li>
<li>Mackie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+KCNQ+potassium+channels+as+novel+targets+for+the+control+of+mesenteric+artery+constriction+by+vasopressin%2C+based+on+studies+in+single+cells%2C+pressurized+arteries%2C+and+in+vivo+measurements+of+mesenteric+vascular+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Vascular KCNQ potassium channels as novel targets for the control of mesenteric artery constriction by vasopressin, based on studies in single cells, pressurized arteries, and in vivo measurements of mesenteric vascular resistance.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 325, 475-483 (2008).</li>
<li>Brueggemann, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+selective+cyclooxygenase-2+inhibitors+on+vascular+smooth+muscle+ion+channels+may+account+for+differences+in+cardiovascular+risk+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Differential effects of selective cyclooxygenase-2 inhibitors on vascular smooth muscle ion channels may account for differences in cardiovascular risk profiles.</a> Mol. Pharmacol. 76, 1053-1061 (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Patch+Clamp+Technique%22">Patch Clamp Technique</a>. Kaneez, F. S. , Intech. (2012).</li>
<li>Berra-Romani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TTX-sensitive+voltage-gated+Na%2B+channels+are+expressed+in+mesenteric+artery+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">TTX-sensitive voltage-gated Na+ channels are expressed in mesenteric artery smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289, H137-H145 (2005).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Los métodos y enfoques experimentales descritas aquí son muy resistentes y pueden producir resultados claros y reproducible cuando se aplica con una atención meticulosa a los detalles. Buenos registros electrofisiológicos y de la constricción / dilatación de los segmentos arteriales dependen de la salud de las células y los segmentos de la arteria, respectivamente. Preparaciones de células puede variar de día a día, incluso usando el mismo protocolo. Soluciones de aislamiento se puede utilizar para un máximo de 2 semana...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Cloruro de Sodio </td><td> Sigma </td><td> S5886 </td><td> Solución de disección: 145 Baño solución para Electrofisiología *: 140 Solución interna para electrofisiología: 10 Aislamiento solución para miocitos *: 140 Baño solución para miografía de presión: 145 Lumen solución para miografía de presión: 145 </td></tr><tr><td> El cloruro de potasio </td><td> Sigma </td><td> P5405 </td><td> Solución de disección: 4.7 Baño solución para Electrofisiología *: 5,36 Solución interna para electrofisiología: 135 Aislamiento solución para miocitos *: 5,36 Baño solución para miografía de presión: 4,7 Lumen solución para miografía de presión: 4,7 </td></tr><tr><td> Potasio EGTA </td><td> Sigma </td><td> E4378 </td><td> Solución interna para electrofisiología: 0,05 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H9136 </td><td> Baño solución para Electrofisiología *: 10 Solución interna para electrofisiología: 10 Aislamiento solución para miocitos *: 10 </td></tr><tr><td> Fosfato disódico de hidrógeno </td><td> Sigma </td><td> S5136 </td><td> Aislamiento solución para miocitos *: 0,34 </td></tr><tr><td> Hidrógeno fosfato de potasio </td><td> Sigma </td><td> P5655 </td><td> Aislamiento solución para miocitos *: 0,44 </td></tr><tr><td> Cloruro de Magnesio </td><td> Sigma </td><td> M2393 </td><td> Baño solución para Electrofisiología *: 1,2 Solución interna para electrofisiología: 1 Aislamiento solución para miocitos *: 1,2 </td></tr><tr><td> Cloruro de calcio </td><td> Sigma </td><td&gt; C7902 </td><td> Baño solución para Electrofisiología *: 2 Aislamiento solución para miocitos *: 0,05 </td></tr><tr><td> Fosfato de sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP331-1 </td><td> Solución de disección: 1.2 Baño solución para miografía de presión: 1,2 Lumen solución para miografía de presión: 1,2 </td></tr><tr><td> De sulfato de magnesio </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td> Solución de disección: 1,17 Baño solución para miografía de presión: 1,17 Lumen solución para miografía de presión: 1,17 </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP308 </td><td> Solución de disección: 3 Baño solución para miografía de presión: 3 Lumen solución para miografía de presión: 3 </td></tr><tr><td> El ácido pirúvico </td><td> Sigma </td><td> P4562 </td><td> Solución de disección: 2 Baño de solución paramiografía presión: 2 Lumen solución para miografía de presión: 2 </td></tr><tr><td> EDTA dihidratado </td><td> Research Organics </td><td> 9572E </td><td> Solución de disección: 0,02 Baño solución para miografía de presión: 0,02 Lumen solución para miografía de presión: 0,02 </td></tr><tr><td> D-glucosa </td><td> Sigma </td><td> G7021 </td><td> Solución de disección: 5 Baño solución para Electrofisiología *: 10 Solución interna para electrofisiología: 20 Aislamiento solución para miocitos *: 10 Baño solución para miografía de presión: 5 Lumen solución para miografía de presión: 5 </td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino </td><td> Sigma </td><td> A3912 </td><td> Solución de disección: 1% Lumen solución para miografía presión: 1% </td></tr><tr><td> pH </td><td></td><td></td><td> Disección de Solution: 7,4 Baño solución para Electrofisiología *: 7,3 Solución interna para electrofisiología: 7.2 Aislamiento solución para miocitos *: 7,2 Baño solución para miografía de presión: 7,4 Lumen solución para miografía de presión: 7,4 </td></tr><tr><td> Osmolaridad </td><td></td><td></td><td> Solución de disección: 300 Baño solución para Electrofisiología *: 298 Solución interna para electrofisiología: 298 Aislamiento solución para miocitos *: 298 Baño solución para miografía de presión: 300 Lumen solución para miografía de presión: 300 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * 11 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabla 1. Componentes de las soluciones utilizadas en el experimento. </td></tr></tbody></table>

exploración del músculo liso arterial kv7 función del canal de potasio mediante electrofisiología patch clamp y miografía presión

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contracción o la relajación de las células musculares lisas en las paredes de las arterias de resistencia determina el diámetro de la arteria y de ese modo controla el flujo de sangre a través del vaso y contribuye a la presión arterial sistémica. El proceso de contracción está regulada principalmente por la concentración de calcio citosólico ([Ca 2 +] cyt), que es a su vez controlada por una variedad de transportadores de iones y canales. Los canales iónicos son productos intermedios comunes en las vías de transducción de señales activadas por hormonas vasoactivas para efectuar la vasoconstricción o vasodilatación. Y los canales iónicos son a menudo blanco de los agentes terapéuticos de forma deliberada (por ejemplo, los bloqueadores de los canales de calcio utilizado para inducir la vasodilatación y la presión arterial) o involuntariamente (por ejemplo, para inducir efectos no deseados secundarios cardiovasculares). KV7 (KCNQ) activados por voltaje canales de potasio han sido recientemente implicados como targ importante fisiológico y terapéuticoets para la regulación de la contracción del músculo liso. Para dilucidar el papel específico de KV7 canales tanto en la transducción de señales fisiológicas y en las acciones de los agentes terapéuticos, tenemos que estudiar cómo su actividad se modula a nivel celular, así como evaluar su contribución en el contexto de la arteria intacta. Las arterias mesentéricas de rata proporcionan un sistema modelo útil. Las arterias pueden ser fácilmente diseccionada, limpian de tejido conectivo, y utilizarse para preparar los miocitos aislados arteriales para patch clamp electrofisiología, o una cánula y se presuriza para mediciones de las respuestas vasoconstrictoras / vasodilatador en condiciones relativamente fisiológicas. Aquí se describen los métodos utilizados para ambos tipos de mediciones y proporcionan algunos ejemplos de cómo el diseño experimental se pueden integrar para proporcionar una comprensión más clara de las funciones de estos canales de iones en la regulación del tono vascular.

Las mediciones de la KV7 (KCNQ) la actividad del canal de potasio en los miocitos aislados arteriales (patch clamp utilizando técnicas electrofisiológicas) en paralelo con las medidas de respuesta constrictor / dilatador (utilizando miografía presión) puede revelar información importante acerca de las funciones de los canales KV7 en la fisiología del músculo liso vascular y farmacología.

Exploración del músculo liso arterial KV7 función del canal de potasio mediante electrofisiología Patch Clamp y miografía presión

La contracción o relajación de las células del músculo liso en las paredes de las arterias de resistencia determina el diámetro arterial y, por lo tanto, controla el flujo de...

El objetivo general de este procedimiento es medir la actividad de los canales de potasio KV siete en células de músculo liso arterial mesentérico disociadas recientemente, y relacionar esto con las mediciones del diámetro arterial registradas bajo condiciones fisiológicas. Esto se logra primero mediante la extracción quirúrgica del arco vascular mesentérico de una rata. El segundo paso consiste en diseccionar y limpiar los segmentos de las arterias mesentéricas.A continuación, algunos segmentos se utilizan para aislar células individuales del músculo liso con el fin de realizar mediciones electrofisiológicas mediante parche de corrientes de potasio KV siete. El último paso consiste en la canulación de segmentos arteriales intactos para medir mediante miografía a presión la constricción o dilatación arterial en respuesta a moduladores farmacológicos de los canales de potasio KV siete. En definitiva, la combinación de electrofisiología mediante parche y miografía a presión se utiliza para demostrar cómo un aumento o una disminución en la actividad de los canales de potasio KV siete afecta la constricción arterial mesentérica.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos

exploring-arterial-smooth-muscle-kv7-potassium-channel-function-using

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Corriente iónica de los canales BK se registraron con la técnica de patch clamp. Canales BK se expresan...

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

Kv canal disfunción se asocia con arritmias cardíacas. Con el fin de estudiar los mecanismos moleculares que conducen a tales arritmias que utilizan un protocolo sistemático para el aislamiento de cardiomiocitos auriculares y ventriculares de Kv de canal ratones knockout auxiliares de subunidades. Cardiomiocitos aislados a continuación, puede ser utilizado inmediatamente para estudios electrofisiológicos celulares, bioquímicos o inmunofluorescencia (IF) ensayos.

Aislamiento y grabaciones Kv Canal murinos en miocitos auriculares y ventriculares

Aquí se describe el aislamiento de cardiomyoctyes adultas de ratón utilizando un sistema de perfusión Langendorff. Las células resultantes son de Ca2 +-tolerante, eléctricamente en reposo y pueden ser cultivadas y transfectadas con adeno-o lentivirus para manipular la expresión génica. Su funcionalidad también puede ser analizado usando el sistema de MMSYS y técnicas de patch clamp.

Aislamiento, cultivo y caracterización funcional de ratón adulto Cardiomyoctyes

Miografía de presión se utiliza para evaluar vasoactividad de las pequeñas arterias que se desarrollan constricción sostenida cuando se presuriza. Este manuscrito proporciona un protocolo detallado para evaluar en segmentos aislados de pequeñas arterias mesentéricas de ratas, vasoactividad y el efecto de la presión intraluminal del diámetro vascular.

Evaluar Miogénica Respuesta y Vasoactividad En arterias mesentéricas Resistencia Usando Miografía Presión

La reconstitución de la proteína transmembrana, KvAP, en vesículas unilamelares gigantes (GUVs) se demostró por dos métodos de deshidratación-rehidratación - electroformation e inflamación gel asistida. En ambos métodos, pequeñas vesículas unilamelares que contienen la proteína se fusionan para formar GUVs que luego pueden ser estudiadas mediante microscopía de fluorescencia y la electrofisiología patch-clamp.

Reconstitución de una proteína transmembrana, el canal iónico dependiente de voltaje, KvAP, en Gigante vesículas unilamelares para Microscopía y Patch Clamp Estudios

Este manuscrito describe un protocolo simple para el aislamiento de las arteriolas de la retina de rata que puede utilizarse en, calcio presión y proyección de imagen de miografía estudios electrofisiológicos.

Aislamiento de arteriolas retinianas por estudios de fisiología celular Ex Vivo

El objetivo principal de este artículo es proporcionar detalles de cómo registrar el potencial de membrana (Vm) de la arteria cerebral media utilizando el método de empallamiento de microelectrodos. La arteria cerebral media canulada se equilibra para obtener tono miogénico, y la pared del vaso se empala usando microelectrodos de alta resistencia.

Método de empalamiento de microelectrodos para registrar el potencial de la membrana a partir de una arteria cerebral media cannulada

Las respuestas vasculares de la circulación pulmonar arterial se pueden explorar utilizando la arteria intrapulmonar (IPA) y las células del músculo liso vascular (VSMC). El presente estudio describe el aislamiento de IPA en detalle y los protocolos utilizados para investigar la vasorelajación en respuesta a estímulos fisiológicos.

Aislamiento de la arteria intrapulmonar y las células del músculo liso para investigar las respuestas vasculares

El presente protocolo describe un método eficiente para la adquisición dinámica y en tiempo real de corrientes de canal de potasio (Kv) dependientes de voltaje en cardiomiocitos H9c2 utilizando la técnica de pinza de parche de células enteras.

Registro de corriente de potasio dependiente del voltaje en cardiomiocitos H9c2 mediante la técnica de pinza de parche de células enteras

Este protocolo describe un método rápido y eficiente para aislar las células musculares lisas de la arteria basilar de rata y registrar las corrientes de los canales de potasio rectificadoras hacia adentro en estas células utilizando la técnica de pinzamiento de parche de célula completa. Ofrece un enfoque novedoso para los investigadores que estudian la arteria basilar y los canales iónicos.

Registro de las corrientes de K+ rectificadoras hacia adentro en células musculares lisas de la arteria basilar recién aisladas mediante la técnica de patch clamp

Aprende a medir la actividad de canales de potasio Kv7 en células de músculo liso arterial mesentérico mediante electrofisiología de patch clamp y miografía de presión. Este método permite correlacionar la actividad iónica con cambios en el diámetro arterial.

Exploración del músculo liso arterial KV7 función del canal de potasio mediante electrofisiología Patch Clamp y miografía presión (Video) | JoVE Journal

Exploración del músculo liso arterial KV7 función del canal de potasio mediante electrofisiología Patch Clamp y miografía presión

Explorar más videos