Name: Crianza y la inyección de Manduca sexta Las larvas para evaluar la virulencia bacteriana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprende a evaluar la virulencia bacteriana en larvas de Manduca sexta mediante inyección directa en el hemocelio. Este método permite analizar interacciones huésped-patógeno con precisión experimental.

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Los autores desean agradecer a los miembros anteriores del laboratorio Goodrich-Blair: Samantha Orchard, Cowles Kimberly, Erin Herbert-Tran, Greg Richards, Menard Megan y Parque Youngjin por sus contribuciones al desarrollo de este protocolo. Este trabajo fue financiado por la National Science Foundation de subvención IOS-0950873 y los Institutos Nacionales de Salud NRSA compañerismo FAI084441Z.

1. Esterilización de Insectos huevo y Cría <ol><li> Preparar dieta por primera autoclave 15 g de agar proporcionado en la 900-1,000 ml H 2 O. Inmediatamente después de la esterilización en autoclave, se mezclan con 166 g de germen de trigo dieta y mezcla bien en un mezclador de laboratorio. Vierta en un plato (o platos) para enfriar y transferir dieta para papel de aluminio, envolver herméticamente, y se almacena a 4 ° C. </li><li> A su llegada, esterilizar M. Sexta huevos con 250 ml de solución de lejía al 0,6% durante 2-3 min en un soporte de filtro de vidrio y aparatos termo con un papel de filtro de 90 mm, revolviendo de vez en cuando. </li><li> Encienda el vacío para drenar la solución de lejía y lavado de los huevos de 3-4 veces con 250 ml de agua estéril destilada H 2 O por lavado. </li><li> Traslado huevos a papel nuevo de 90 mm filtro colocado en una placa de Petri tapa y deje que se sequen hasta que ya no estamos juntos (unos 20-30 minutos). </li><li> Transferir los huevos a la parte inferior de los recipientes de plástico con dieta de insectos, colocando aproximadamente 40 huevos en cada envase(Figura 1A). Los huevos se separan de la dieta para evitar que la humedad inducida por la contaminación fúngica. Mantenga los huevos a 26 ° C con una luz de 16 horas: 8 hr fotoperíodo oscuro. Los huevos se aclarará a un color amarillo-blanco antes de la eclosión. </li><li> Cuando la incubación es completa, transferir cuidadosamente aproximadamente 25 larvas cada uno de los nuevos contenedores con la dieta en la parte inferior (Figura 1B). Es importante recoger cada larva por el cuerno largo y negro con unas pinzas para evitar dañar a ellos durante sus primeras etapas de desarrollo frágiles. Incubar durante 2 días como anteriormente. Si bien la muerte larval es inusual en esta etapa, algunos muertos o, más probablemente, larvas de desarrollo atrofiado puede ser observado. Tales insectos deben excluirse del estudio y se sacrificaron por congelación. </li><li> Para evitar comportamientos caníbales, larvas transfiera a recipientes individuales con pequeños trozos de alimentos (Figura 1 C) y se incuba como antes. Supervisar el desarrollo de insectos, heces sustitución de alimentos y limpieza out de recipientes cada día hasta que se someten a la tercera muda larval (normalmente 6-9 días después de la eclosión). Este es el 4 º instar etapa larval, que se caracteriza por la aparición de negros en forma de gancho crochets en cada prominencia Proleg y aumento de rayas a lo largo del cuerpo del insecto (Figura 1D). Las larvas pueden variar considerablemente en tamaño, pero normalmente pesan 0.15 a 0.4 g al entrar en la 4 ª etapa instar. Las larvas de tamaño similar debe ser elegido para la inyección. </li></ol> 2. Preparación de bacterias para Inyección <ol><li> Crecer la cepa bacteriana (s) a ensayar de acuerdo con procedimientos estándar para la fase de crecimiento que se desea probar. </li><li> Pellet 500 l de cada cepa bacteriana para ser probado por hilado durante 2 min en una microcentrífuga a 13.000 rpm a temperatura ambiente. </li><li> Resuspender las células en 1 ml de 1x solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) y el sedimento de nuevo como anteriormente. </li><li> Resuspender las células en 0,5 ml de PBS 1x estéril y meaAsegúrese de que la densidad óptica (DO) de la suspensión. Diluir las suspensiones para el mismo diámetro exterior, si es necesario. Medios estériles de crecimiento también se puede utilizar para la resuspensión celular y la dilución en lugar de PBS 1x, si se desea. </li></ol> 3. Inyección de 4 º estadio las larvas <ol><li> Preparar serie 10-veces diluciones de la cepa bacteriana primero en 6 pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos, en PBS 1x estéril, usando una punta de pipeta nueva para cada dilución (Figura 2A). El volumen final de la suspensión celular en cada pocillo debe exceder el volumen necesario para la inyección (10 l por insectos), además de 20 l para la placa de inóculo (ver los pasos 3,2 y 3,7). </li><li> Punto 10 l cada uno de 5 diluciones (10 -2 a través de 10 -6) a lo largo de la parte superior de una placa de Petri que contiene un medio de crecimiento apropiado. Inclinar la placa de modo que los puntos se extendió al centro (Figura 2B). </li><li> Retire dieta de insectos y excrementos e insectos lugar en recipientes con hielo paraaproximadamente 5 min. </li><li> Esterilizar la aguja de la jeringa mediante enjuague 3 veces cada una en 2 tubos de 70-100% de etanol, seguidos por un tubo estéril de O H 2 (Figura 2C). El volumen de líquido debe ser suficiente para sumergir la aguja. </li><li> Cuantificar las suspensiones de células diluidas con un microscopio utilizando un hemocitómetro. Dependiendo del inóculo deseado, dibujar 10 l de la microtitulación correspondientes pocillos (Figura 2D). </li><li> Torunda la superficie de insecto con 95% de etanol, y se inyecta la suspensión de 10 ml de células en el insecto en un ángulo (de menos de 45 °) detrás de la una de las patas abdominales abdominales. Tener cuidado de no perforar el intestino e inyectar el contenido justo debajo de la capa epidérmica (2E Figura). Si bien una cierta pérdida de hemolinfa (claro, verde-azul líquido) es normal, las partículas y el líquido amarillo que emerge de la zona de inyección son indicativos de punción intestino. Si esto ocurre, sacrificar el insecto y obtener una larva de nuevo para volvercolocarlo. </li><li> Repita el paso 3.6 para cada insecto restante en el grupo de la primera inyección. Aguja de la esterilización no es necesaria entre cada insecto inyecta con la misma dilución y la cepa de bacterias a menos que se produzca contaminación. Alternativamente, un dispensador de repetición se puede utilizar para una mayor consistencia en el volumen de inyección entre las muestras. </li><li> Después de inyectar cada insecto con la primera cepa de bacteria, repita el paso 3,2, esta vez manchado suspensiones de células en el medio de la placa y dejar que el flujo hacia la parte inferior (Figura 2F). Incubar las placas a temperatura adecuada y contar las colonias de enumerar el inóculo. Este paso chapado segunda se utiliza para verificar que las muestras no estaban contaminadas durante el proceso de inyección, ya que esto daría lugar a números de colonias dispares entre los chapados primero y segundo. </li><li> Repetir los pasos a través de 3,1 3,8 para cada cepa de bacteria en el experimento. Finalmente, se inyectan 3-5 insectos con PBS 1x estéril utilizando un sterile aguja como un grupo de control negativo. Incubar los insectos a 26 ° C con una luz de 16 horas: 8 hr fotoperíodo oscuro. </li><li> Supervisar la supervivencia del insecto con el tiempo después de la inyección. La muerte del insecto se caracteriza por una falta de movimiento voluntario a la estimulación. Los insectos suelen presentar pérdida del apetito, diarrea (excremento aguado, de color amarillo), y / o pérdida de agua (&quot;sudor&quot;) durante la infección antes de la muerte; estas características puede ser digno de mención también. </li></ol>

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<li>Cowles, K. N., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+activity+of+a+Xenorhabdus+nematophila+haemolysin+required+for+full+virulence+towards+Manduca+sexta+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Expression and activity of a Xenorhabdus nematophila haemolysin required for full virulence towards Manduca sexta insects.</a> Cell. Microbiol. 7, 209-219 (2005).</li>
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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La inyección directa de M. larvas sexta con bacterias entomopatógenos, como se describe aquí, sirve como un medio sencillo y eficaz para analizar la virulencia bacteriana. El método es también muy adaptable para adaptarse a diferentes sujetos experimentales y / o condiciones. Las bacterias se pueden preparar de diversas maneras antes de la inyección. En el caso de X. nematophila, las células de tipo salvaje cultivadas en rica en nutrientes Luria-Bertani (LB) a mitad de la fase log son típicame...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> 90 mm papel de filtro </td><td> Whatman </td><td> 1001 090 </td><td></td></tr><tr><td> Filtro de vidrio titular </td><td> Millipore </td><td> XX1004700 </td><td></td></tr><tr><td> Manduca sexta huevos </td><td> Carolina Biological Supply </td><td> 143880 </td><td></td></tr><tr><td> Dieta Gypsy Moth agar + </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0296029301 </td><td></td></tr><tr><td> 5,5 oz envases de plástico y tapas </td><td> Solo Cup Company </td><td> URC55-0090-0090 PI4 </td><td></td></tr><tr><td> 1 oz envases de plástico y tapas </td><td> Dart Container Corporation </td><td> 100PC 100PCL25 </td><td></td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td></td&gt; <td></td><td> 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4, 1,46 mM KH 2 PO 4, pH 7,4 </td></tr><tr><td> Jeringa </td><td> Hamilton </td><td> 80208 </td><td> Calibre 30, 0,375 &quot;de largo, estilo, punto 2 </td></tr></tbody></table>

crianza y la inyección de<em&gt; manduca sexta</em&gt; las larvas para evaluar la virulencia bacteriana

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Manduca sexta, comúnmente conocido como el gusano del tabaco, se considera una plaga agrícola importante, se alimentan de plantas solanáceas, incluyendo tabaco y tomate. La susceptibilidad de M. larvas sexta a una variedad de especies bacterianas entomopatógenos 1-5, así como la gran cantidad de información disponible sobre el sistema inmunológico del insecto 6-8, y la secuencia del genoma pendiente 9 lo convierten en un organismo modelo bueno para el uso en el estudio de la interacción huésped-microbio durante la patogénesis. Además, M. sexta larvas son relativamente grandes y fáciles de manipular y mantener en el laboratorio en relación a otras especies de insectos susceptibles. Su gran tamaño también facilita eficiente tejido / hemolinfa de extracción para el análisis de la respuesta del huésped a la infección. El método aquí presentado describe la inyección directa de bacterias en el hemocele (cavidad sangre) de M. sexta larvas. Este enfoquese puede utilizar para analizar y comparar las características de virulencia de diversas especies bacterianas, cepas o mutantes simplemente monitorizar el tiempo a la muerte del insecto después de la inyección. Este método fue desarrollado para estudiar la patogenicidad de Xenorhabdus y Photorhabdus especies, que suelen asociar con vectores de nematodos como un medio para ganar la entrada en el insecto. Nematodos entomopatógenos típicamente infectan larvas vía digestiva natural o aberturas respiratorias, y liberan su contenido de bacterias simbióticas en la hemolinfa del insecto (sangre) poco después 10. El método de inyección aquí descrito evita la necesidad de un vector de nematodos, así desacoplar los efectos de las bacterias y nematodos en el insecto. Este método permite la enumeración precisa de material infeccioso (células o proteínas) en el inóculo, que no es posible con otros métodos existentes para el análisis de entomopathogenesis, incluyendo formación de muescas 11 y los ensayos de toxicidad por vía oral 12 <em&gt;. Además, los ensayos de toxicidad por vía oral frente a la virulencia de las toxinas secretadas introducidos en el sistema digestivo de las larvas, mientras que el método de inyección directa se refiere a la virulencia de los inóculos de células enteras. La utilidad del método de inyección directa como se describe aquí es analizar la patogénesis bacteriana mediante la supervisión de mortalidad de los insectos. Sin embargo, este método puede ser fácilmente ampliado para su uso en el estudio de los efectos de la infección en el M. sexta sistema inmune. El insecto responde a la infección a través de ambas respuestas humoral y celular. La respuesta humoral se incluye el reconocimiento de bacterias asociadas con los patrones y la subsiguiente producción de diversos péptidos antimicrobianos 7, la expresión de genes que codifican estos péptidos pueden ser monitoreados posterior a la infección directa a través de la extracción de RNA y PCR cuantitativa 13. La respuesta celular a la infección implica la nodulación, encapsulación, y la fagocitosis de agentes infecciosos por hemocitos 6 </sup&gt;. Para analizar estas respuestas, insectos inyectadas pueden ser diseccionados y se visualizaron por microscopía 13, 14.

Un ejemplo representativo de un ensayo de mortalidad de los insectos se representa en la Figura 3. En este experimento, los insectos fueron inyectados con aproximadamente 50 unidades formadoras de colonias (UFC) de tipo salvaje (ATCC19061) o un mutante de la cepa atenuada (lrp 13) de Xenorhabdus nematophila crecer hasta la fase logarítmica media (n = 6 insectos por cepa). Los insectos fueron observados durante aproximadamente 72 horas, y registró el porcentaje de insectos in...

El método descrito aquí utiliza la inyección directa de bacterias entomopatógenos en el hemocele de<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Larvas de insectos.<em&gt; M. sexta</em&gt; Es un insecto disponibles comercialmente y bien estudiado. Por lo tanto, este método representa un método simple para analizar bacterianas interacción huésped-desde la perspectiva de uno o ambos socios.

Crianza y la inyección de<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Las larvas para evaluar la virulencia bacteriana

*Manduca sexta*, conocida comúnmente como el gusano cornudo del tabaco, se considera una plaga agrícola significativa que se alimenta de plantas solanáceas, incluyendo el tabaco y...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la patogenicidad bacteriana frente a larvas de insectos utilizando manduka seca como organismo modelo. Esto se logra primero criando las larvas de insecto a partir de huevos esterilizados hasta la fase de cuarto estadio de desarrollo. En el segundo paso, las muestras bacterianas se preparan para la inyección.A continuación, se inyectan las bacterias en larvas de manduka seca del cuarto estadio. En el paso final, se monitorea la muerte de los insectos con el tiempo tras la inyección. En última instancia, se registra el tiempo hasta la muerte del insecto y se utiliza para evaluar la virulencia bacteriana.Este método puede ayudar a abordar aspectos clave en el campo de la simbiosis, incluyendo el descubrimiento de nuevos patógenos de insectos y la determinación de diferencias en virulencia entre especies o cepas bacterianas. Comience primero por autoclavar 15 gramos de auger en 900 a 1000 mililitros de agua. Inmediatamente después del autoclave.Mezcle el tornillo sinfín con 166 gramos de dieta de germen de trigo. En una licuadora de laboratorio, vierta la dieta para insectos mezclada en un recipiente. Una vez enfriada, transfiera la

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Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Embriones de pez cebra transparentes han demostrado ser útiles los ejércitos de modelo para visualizar y las interacciones funcionales de estudio entre las células inmunes y los patógenos bacterianos intracelulares, tales...

La infección de embriones de pez cebra con patógenos bacterianos intracelulares

Haemocolic infección intra oral y de las larvas de la polilla mayor de la...

El insecto<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como un modelo de infección poderosa para investigar la patogénesis bacteriana

Fuente: Bernut, A., et al., Descifrando e Imaginando la patogénesis y el cordón de Mycobacterium abscessus en embriones de pez cebra. J. Vis. Exp. (2015).Este vídeo demuestra un protocolo para aislar y cuantificar Mycobacterium abscessus de un embrión infectado de pez cebra. El procedimiento implica la eutanasia embrionaria, la lisis tisular y la homogeneización para liberar las bacterias, seguidas de centrifugación y resuspensión en un tampón de tensioactivo. Finalmente, la suspensión...

Aislamiento y cultivo de bacterias a partir de embriones de pez cebra para evaluar la carga de infección

Este video muestra un método para establecer un modelo de infección por Mycobacterium bovis en las larvas de la polilla de la cera mayor, Galleria mellonella. Se inyecta una cepa bioluminiscente de Mycobacterium bovis BCG en la hemolinfa de la larva para establecer la infección, y la bioluminiscencia se mide a intervalos predefinidos para estudiar el progreso de la infección.

Una técnica para establecer un modelo de infección bacteriana en larvas de insectos

Este vídeo muestra la medición de la carga bacteriana in vivo utilizando larvas de insectos infectadas con Bacillus Calmette-Guérin, BCG, lux. El proceso implica la homogeneización de las larvas, el tratamiento con un sustrato de luciferasa y la medición de la bioluminiscencia para determinar las unidades de luz relativas que se correlacionan con la carga bacteriana.

Medición de la carga in vivo de bacterias que expresan luciferasa en una larva de insecto

Aquí proporcionamos un protocolo detallado para un modelo de administración oral con larvas de Galleria mellonella y cómo caracterizar inducido la respuesta inmune innata. Mediante este protocolo, investigadores sin experiencia práctica será capaces de usar la g. mellonella forzada método.

Un modelo de administración Oral de Galleria mellonella para la respuesta inmune innata Study Commensal-Induced

Aquí presentamos un protocolo para inyectar huevos de cricket, una técnica que sirve como método fundamental en muchos experimentos en el cricket, incluyendo, pero no limitado a, interferencia de ARN y manipulación genómica.

Inyección de huevos de Gryllus bimaculatus

Este artículo presenta un protocolo para investigar el efecto de las bacterias intestinales de mosquitos individuales, incluyendo el aislamiento y la identificación de microbios cultivables de mosquitos en la mitad del intestino, agotamiento de antibióticos de bacterias intestinales de mosquitos, y reintroducir una especie específica de bacterias.

Un ensayo de alimentación oral bacteriana con mosquitos tratados con antibióticos

Este protocolo describe procedimientos de microinyección para embriones de Culex quinquefasciatus que están optimizados para trabajar con herramientas de edición de genes CRISPR/Cas9. Esta técnica puede generar de manera eficiente mutaciones de la línea germinal heredables y específicas del sitio que se pueden usar para construir tecnologías genéticas en este vector de enfermedad poco estudiado.

Técnicas de microinyección embrionaria para una mutagénesis eficiente site-specific en Culex quinquefasciatus

Las moscas adultas de Drosophila melanogaster se han utilizado ampliamente como organismos modelo para investigar los mecanismos moleculares subyacentes a las respuestas inmunes innatas antimicrobianas del huésped y las estrategias de infección microbiana. Para promover la etapa de larva de D. melanogaster como un sistema modelo adicional o alternativo, se describe una técnica de inyección larvaria.

Drosophila melanogaster Protocolo de inyección de larvas

Aprende a evaluar la virulencia bacteriana en larvas de Manduca sexta mediante inyección directa en el hemocelio. Este método permite analizar interacciones huésped-patógeno con precisión experimental.

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