Name: Crianza y la inyección de Manduca sexta Las larvas para evaluar la virulencia bacteriana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprende a evaluar la virulencia bacteriana en larvas de Manduca sexta mediante inyección directa en el hemocelio. Este método permite analizar interacciones huésped-patógeno con precisión experimental.

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Los autores desean agradecer a los miembros anteriores del laboratorio Goodrich-Blair: Samantha Orchard, Cowles Kimberly, Erin Herbert-Tran, Greg Richards, Menard Megan y Parque Youngjin por sus contribuciones al desarrollo de este protocolo. Este trabajo fue financiado por la National Science Foundation de subvención IOS-0950873 y los Institutos Nacionales de Salud NRSA compañerismo FAI084441Z.

1. Esterilización de Insectos huevo y Cría <ol><li> Preparar dieta por primera autoclave 15 g de agar proporcionado en la 900-1,000 ml H 2 O. Inmediatamente después de la esterilización en autoclave, se mezclan con 166 g de germen de trigo dieta y mezcla bien en un mezclador de laboratorio. Vierta en un plato (o platos) para enfriar y transferir dieta para papel de aluminio, envolver herméticamente, y se almacena a 4 ° C. </li><li> A su llegada, esterilizar M. Sexta huevos con 250 ml de solución de lejía al 0,6% durante 2-3 min en un soporte de filtro de vidrio y aparatos termo con un papel de filtro de 90 mm, revolviendo de vez en cuando. </li><li> Encienda el vacío para drenar la solución de lejía y lavado de los huevos de 3-4 veces con 250 ml de agua estéril destilada H 2 O por lavado. </li><li> Traslado huevos a papel nuevo de 90 mm filtro colocado en una placa de Petri tapa y deje que se sequen hasta que ya no estamos juntos (unos 20-30 minutos). </li><li> Transferir los huevos a la parte inferior de los recipientes de plástico con dieta de insectos, colocando aproximadamente 40 huevos en cada envase(Figura 1A). Los huevos se separan de la dieta para evitar que la humedad inducida por la contaminación fúngica. Mantenga los huevos a 26 ° C con una luz de 16 horas: 8 hr fotoperíodo oscuro. Los huevos se aclarará a un color amarillo-blanco antes de la eclosión. </li><li> Cuando la incubación es completa, transferir cuidadosamente aproximadamente 25 larvas cada uno de los nuevos contenedores con la dieta en la parte inferior (Figura 1B). Es importante recoger cada larva por el cuerno largo y negro con unas pinzas para evitar dañar a ellos durante sus primeras etapas de desarrollo frágiles. Incubar durante 2 días como anteriormente. Si bien la muerte larval es inusual en esta etapa, algunos muertos o, más probablemente, larvas de desarrollo atrofiado puede ser observado. Tales insectos deben excluirse del estudio y se sacrificaron por congelación. </li><li> Para evitar comportamientos caníbales, larvas transfiera a recipientes individuales con pequeños trozos de alimentos (Figura 1 C) y se incuba como antes. Supervisar el desarrollo de insectos, heces sustitución de alimentos y limpieza out de recipientes cada día hasta que se someten a la tercera muda larval (normalmente 6-9 días después de la eclosión). Este es el 4 º instar etapa larval, que se caracteriza por la aparición de negros en forma de gancho crochets en cada prominencia Proleg y aumento de rayas a lo largo del cuerpo del insecto (Figura 1D). Las larvas pueden variar considerablemente en tamaño, pero normalmente pesan 0.15 a 0.4 g al entrar en la 4 ª etapa instar. Las larvas de tamaño similar debe ser elegido para la inyección. </li></ol> 2. Preparación de bacterias para Inyección <ol><li> Crecer la cepa bacteriana (s) a ensayar de acuerdo con procedimientos estándar para la fase de crecimiento que se desea probar. </li><li> Pellet 500 l de cada cepa bacteriana para ser probado por hilado durante 2 min en una microcentrífuga a 13.000 rpm a temperatura ambiente. </li><li> Resuspender las células en 1 ml de 1x solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) y el sedimento de nuevo como anteriormente. </li><li> Resuspender las células en 0,5 ml de PBS 1x estéril y meaAsegúrese de que la densidad óptica (DO) de la suspensión. Diluir las suspensiones para el mismo diámetro exterior, si es necesario. Medios estériles de crecimiento también se puede utilizar para la resuspensión celular y la dilución en lugar de PBS 1x, si se desea. </li></ol> 3. Inyección de 4 º estadio las larvas <ol><li> Preparar serie 10-veces diluciones de la cepa bacteriana primero en 6 pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos, en PBS 1x estéril, usando una punta de pipeta nueva para cada dilución (Figura 2A). El volumen final de la suspensión celular en cada pocillo debe exceder el volumen necesario para la inyección (10 l por insectos), además de 20 l para la placa de inóculo (ver los pasos 3,2 y 3,7). </li><li> Punto 10 l cada uno de 5 diluciones (10 -2 a través de 10 -6) a lo largo de la parte superior de una placa de Petri que contiene un medio de crecimiento apropiado. Inclinar la placa de modo que los puntos se extendió al centro (Figura 2B). </li><li> Retire dieta de insectos y excrementos e insectos lugar en recipientes con hielo paraaproximadamente 5 min. </li><li> Esterilizar la aguja de la jeringa mediante enjuague 3 veces cada una en 2 tubos de 70-100% de etanol, seguidos por un tubo estéril de O H 2 (Figura 2C). El volumen de líquido debe ser suficiente para sumergir la aguja. </li><li> Cuantificar las suspensiones de células diluidas con un microscopio utilizando un hemocitómetro. Dependiendo del inóculo deseado, dibujar 10 l de la microtitulación correspondientes pocillos (Figura 2D). </li><li> Torunda la superficie de insecto con 95% de etanol, y se inyecta la suspensión de 10 ml de células en el insecto en un ángulo (de menos de 45 °) detrás de la una de las patas abdominales abdominales. Tener cuidado de no perforar el intestino e inyectar el contenido justo debajo de la capa epidérmica (2E Figura). Si bien una cierta pérdida de hemolinfa (claro, verde-azul líquido) es normal, las partículas y el líquido amarillo que emerge de la zona de inyección son indicativos de punción intestino. Si esto ocurre, sacrificar el insecto y obtener una larva de nuevo para volvercolocarlo. </li><li> Repita el paso 3.6 para cada insecto restante en el grupo de la primera inyección. Aguja de la esterilización no es necesaria entre cada insecto inyecta con la misma dilución y la cepa de bacterias a menos que se produzca contaminación. Alternativamente, un dispensador de repetición se puede utilizar para una mayor consistencia en el volumen de inyección entre las muestras. </li><li> Después de inyectar cada insecto con la primera cepa de bacteria, repita el paso 3,2, esta vez manchado suspensiones de células en el medio de la placa y dejar que el flujo hacia la parte inferior (Figura 2F). Incubar las placas a temperatura adecuada y contar las colonias de enumerar el inóculo. Este paso chapado segunda se utiliza para verificar que las muestras no estaban contaminadas durante el proceso de inyección, ya que esto daría lugar a números de colonias dispares entre los chapados primero y segundo. </li><li> Repetir los pasos a través de 3,1 3,8 para cada cepa de bacteria en el experimento. Finalmente, se inyectan 3-5 insectos con PBS 1x estéril utilizando un sterile aguja como un grupo de control negativo. Incubar los insectos a 26 ° C con una luz de 16 horas: 8 hr fotoperíodo oscuro. </li><li> Supervisar la supervivencia del insecto con el tiempo después de la inyección. La muerte del insecto se caracteriza por una falta de movimiento voluntario a la estimulación. Los insectos suelen presentar pérdida del apetito, diarrea (excremento aguado, de color amarillo), y / o pérdida de agua (&quot;sudor&quot;) durante la infección antes de la muerte; estas características puede ser digno de mención también. </li></ol>

<ol><li>Bintrim, S. B., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+inactivation+of+genes+encoding+the+crystalline+inclusion+proteins+of+Photorhabdus+luminescens+results+in+mutants+with+pleiotropic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes.</a> J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).</li>
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<li>Cowles, K. N., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+activity+of+a+Xenorhabdus+nematophila+haemolysin+required+for+full+virulence+towards+Manduca+sexta+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Expression and activity of a Xenorhabdus nematophila haemolysin required for full virulence towards Manduca sexta insects.</a> Cell. Microbiol. 7, 209-219 (2005).</li>
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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La inyección directa de M. larvas sexta con bacterias entomopatógenos, como se describe aquí, sirve como un medio sencillo y eficaz para analizar la virulencia bacteriana. El método es también muy adaptable para adaptarse a diferentes sujetos experimentales y / o condiciones. Las bacterias se pueden preparar de diversas maneras antes de la inyección. En el caso de X. nematophila, las células de tipo salvaje cultivadas en rica en nutrientes Luria-Bertani (LB) a mitad de la fase log son típicame...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> 90 mm papel de filtro </td><td> Whatman </td><td> 1001 090 </td><td></td></tr><tr><td> Filtro de vidrio titular </td><td> Millipore </td><td> XX1004700 </td><td></td></tr><tr><td> Manduca sexta huevos </td><td> Carolina Biological Supply </td><td> 143880 </td><td></td></tr><tr><td> Dieta Gypsy Moth agar + </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0296029301 </td><td></td></tr><tr><td> 5,5 oz envases de plástico y tapas </td><td> Solo Cup Company </td><td> URC55-0090-0090 PI4 </td><td></td></tr><tr><td> 1 oz envases de plástico y tapas </td><td> Dart Container Corporation </td><td> 100PC 100PCL25 </td><td></td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td></td&gt; <td></td><td> 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4, 1,46 mM KH 2 PO 4, pH 7,4 </td></tr><tr><td> Jeringa </td><td> Hamilton </td><td> 80208 </td><td> Calibre 30, 0,375 &quot;de largo, estilo, punto 2 </td></tr></tbody></table>

crianza y la inyección de<em&gt; manduca sexta</em&gt; las larvas para evaluar la virulencia bacteriana

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Manduca sexta, comúnmente conocido como el gusano del tabaco, se considera una plaga agrícola importante, se alimentan de plantas solanáceas, incluyendo tabaco y tomate. La susceptibilidad de M. larvas sexta a una variedad de especies bacterianas entomopatógenos 1-5, así como la gran cantidad de información disponible sobre el sistema inmunológico del insecto 6-8, y la secuencia del genoma pendiente 9 lo convierten en un organismo modelo bueno para el uso en el estudio de la interacción huésped-microbio durante la patogénesis. Además, M. sexta larvas son relativamente grandes y fáciles de manipular y mantener en el laboratorio en relación a otras especies de insectos susceptibles. Su gran tamaño también facilita eficiente tejido / hemolinfa de extracción para el análisis de la respuesta del huésped a la infección. El método aquí presentado describe la inyección directa de bacterias en el hemocele (cavidad sangre) de M. sexta larvas. Este enfoquese puede utilizar para analizar y comparar las características de virulencia de diversas especies bacterianas, cepas o mutantes simplemente monitorizar el tiempo a la muerte del insecto después de la inyección. Este método fue desarrollado para estudiar la patogenicidad de Xenorhabdus y Photorhabdus especies, que suelen asociar con vectores de nematodos como un medio para ganar la entrada en el insecto. Nematodos entomopatógenos típicamente infectan larvas vía digestiva natural o aberturas respiratorias, y liberan su contenido de bacterias simbióticas en la hemolinfa del insecto (sangre) poco después 10. El método de inyección aquí descrito evita la necesidad de un vector de nematodos, así desacoplar los efectos de las bacterias y nematodos en el insecto. Este método permite la enumeración precisa de material infeccioso (células o proteínas) en el inóculo, que no es posible con otros métodos existentes para el análisis de entomopathogenesis, incluyendo formación de muescas 11 y los ensayos de toxicidad por vía oral 12 <em&gt;. Además, los ensayos de toxicidad por vía oral frente a la virulencia de las toxinas secretadas introducidos en el sistema digestivo de las larvas, mientras que el método de inyección directa se refiere a la virulencia de los inóculos de células enteras. La utilidad del método de inyección directa como se describe aquí es analizar la patogénesis bacteriana mediante la supervisión de mortalidad de los insectos. Sin embargo, este método puede ser fácilmente ampliado para su uso en el estudio de los efectos de la infección en el M. sexta sistema inmune. El insecto responde a la infección a través de ambas respuestas humoral y celular. La respuesta humoral se incluye el reconocimiento de bacterias asociadas con los patrones y la subsiguiente producción de diversos péptidos antimicrobianos 7, la expresión de genes que codifican estos péptidos pueden ser monitoreados posterior a la infección directa a través de la extracción de RNA y PCR cuantitativa 13. La respuesta celular a la infección implica la nodulación, encapsulación, y la fagocitosis de agentes infecciosos por hemocitos 6 </sup&gt;. Para analizar estas respuestas, insectos inyectadas pueden ser diseccionados y se visualizaron por microscopía 13, 14.

Un ejemplo representativo de un ensayo de mortalidad de los insectos se representa en la Figura 3. En este experimento, los insectos fueron inyectados con aproximadamente 50 unidades formadoras de colonias (UFC) de tipo salvaje (ATCC19061) o un mutante de la cepa atenuada (lrp 13) de Xenorhabdus nematophila crecer hasta la fase logarítmica media (n = 6 insectos por cepa). Los insectos fueron observados durante aproximadamente 72 horas, y registró el porcentaje de insectos in...

El método descrito aquí utiliza la inyección directa de bacterias entomopatógenos en el hemocele de<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Larvas de insectos.<em&gt; M. sexta</em&gt; Es un insecto disponibles comercialmente y bien estudiado. Por lo tanto, este método representa un método simple para analizar bacterianas interacción huésped-desde la perspectiva de uno o ambos socios.

Crianza y la inyección de<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Las larvas para evaluar la virulencia bacteriana

*Manduca sexta*, conocida comúnmente como el gusano cornudo del tabaco, se considera una plaga agrícola significativa que se alimenta de plantas solanáceas, incluyendo el tabaco y...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la patogenicidad bacteriana frente a larvas de insectos utilizando manduka seca como organismo modelo. Esto se logra primero criando las larvas de insecto a partir de huevos esterilizados hasta la fase de cuarto estadio de desarrollo. En el segundo paso, las muestras bacterianas se preparan para la inyección.A continuación, se inyectan las bacterias en larvas de manduka seca del cuarto estadio. En el paso final, se monitorea la muerte de los insectos con el tiempo tras la inyección. En última instancia, se registra el tiempo hasta la muerte del insecto y se utiliza para evaluar la virulencia bacteriana.Este método puede ayudar a abordar aspectos clave en el campo de la simbiosis, incluyendo el descubrimiento de nuevos patógenos de insectos y la determinación de diferencias en virulencia entre especies o cepas bacterianas. Comience primero por autoclavar 15 gramos de auger en 900 a 1000 mililitros de agua. Inmediatamente después del autoclave.Mezcle el tornillo sinfín con 166 gramos de dieta de germen de trigo. En una licuadora de laboratorio, vierta la dieta para insectos mezclada en un recipiente. Una vez enfriada, transfiera la dieta del recipiente a un trozo de papel de aluminio.Envuélvalo firmemente y guárdelo a cuatro grados Celsius. Al recibirlo, coloque los M machos sobre los huevos en un portafiltros de vidrio y un equipo con matraz de vacío con un papel filtro de 90 milímetros. Luego vierta 250 mililitros de solución de lejía al 0,6 % sobre los huevos durante dos a tres minutos, agitando ocasionalmente.Ahora encienda el vacío para drenar la solución de lejía y luego lave los huevos esterilizados tres o cuatro veces con 250 mililitros de agua destilada estéril por lavado. A continuación, coloque un trozo nuevo de papel de filtro de 90 milímetros en la tapa de una placa de Petri y transfiera los huevos al papel de filtro para que se sequen en una cabina de flujo laminar hasta que ya no se peguen entre sí. Ahora coloque la dieta para insectos recién preparada encima de un tapón de goma fijado en varios recipientes de plástico y transfiera aproximadamente 40 huevos a cada recipiente, separando los huevos de la dieta para prevenir la contaminación fúngica inducida por la humedad.Mantenga los huevos a 26 grados Celsius con un fotoperiodo de 16 horas de luz y ocho horas de oscuridad. Los huevos aclararán a un color blanco amarillento antes de la eclosión, momento en el que esta se completará. Usando pinzas para tomar cada larva por el cuerno negro largo, transfiera cuidadosamente aproximadamente 25 larvas a nuevos recipientes con dieta en el fondo.Incube las larvas durante dos días en las mismas condiciones que para los huevos; aunque la muerte larval es poco común en esta etapa, se pueden observar algunas larvas muertas o, más probablemente, larvas con desarrollo retrasado. A continuación, transfiera las larvas a recipientes individuales con pequeños trozos de alimento para evitar comportamientos caníbales e incube nuevamente. Reemplace el alimento y elimine las heces de los recipientes cada dos días hasta que los insectos experimenten la tercera muda larval.La tercera muda larval es la etapa larval de cuarto estadio, caracterizada por la aparición de ganchos negros similares a croquetas en cada prola y por una mayor prominencia de las rayas a lo largo del cuerpo del insecto. Después de cultivar las cepas bacterianas que se desean probar, centrifugar 500 microlitros de cada cepa bacteriana durante dos minutos en una microcentrífuga a 17.000 × g a temperatura ambiente. Luego, lavar los pellets con un mililitro de PBS estéril en las mismas condiciones.Después de resuspender las células en otro medio mililitro de PBS estéril, mida la densidad óptica de las suspensiones antes de comenzar las inyecciones utilizando una punta de pipeta nueva para cada dilución; prepare seis diluciones seriadas de diez veces cada una de la primera cepa bacteriana en PBS estéril en una placa de microtitulación de 96 pocillos. Ahora, coloque 10 microlitros de cada dilución, desde 10 a la menos dos hasta 10 a la menos seis, a lo largo del borde superior de una placa de Petri que contenga el medio de crecimiento adecuado. A continuación, incline la placa para que las gotas se extiendan hacia el centro.A continuación, después de retirar la dieta del insecto y las heces, coloque los recipientes con los insectos sobre hielo durante aproximadamente cinco minutos mientras los insectos se enfrían. Enjuague tres veces cada una una aguja de jeringa en dos tubos con etanol al 70-100 %, seguido de un tubo con agua estéril. Luego, utilice un citómetro de hemocitómetro para cuantificar las suspensiones celulares diluidas bajo un microscopio.Según el inóculo deseado, retire 10 microlitros del pocillo apropiado de la microplaca. Luego, limpie la superficie del insecto que se va a inyectar con etanol al 95%. Resulta más difícil sostener al insecto en la posición adecuada para la inyección, al mismo tiempo que se manipula la aguja y se tiene cuidado de no perforar el intestino del insecto.Además, tenga cuidado de trabajar rápidamente para que el insecto no se caliente y comience a moverse mientras lo sostiene para la inyección. Inyecte la suspensión celular de 10 microlitros en el insecto con un ángulo inferior a 45 grados, detrás de una de las patas protorácicas abdominales. Tenga cuidado de no perforar el intestino e inyecte el contenido justo debajo de la capa epidérmica.Después de inyectar a cada insecto con la primera cepa de bacterias, vuelva a sembrar las diluciones desde 10 a la menos dos hasta 10 a la menos seis, esta vez en el centro de la placa. Deje que fluyan hacia la parte inferior de la placa. Incube luego las placas a la temperatura adecuada y cuente las colonias para enumerar el inóculo.Después de repetir el proceso de dilución, siembra e inyección para cada cepa bacteriana, inyecte de tres a cinco insectos con PBS estéril para el grupo de control negativo. A continuación, incube todos los insectos a 26 grados Celsius y con un fotoperiodo de 16 horas de luz y ocho horas de oscuridad. Finalmente, supervise la supervivencia de los insectos a lo largo del tiempo tras las inyecciones; los insectos suelen presentar pérdida de apetito, diarrea acuosa de color amarillo, excremento y/o pérdida de agua durante la infección antes de la muerte.La muerte de los insectos se caracteriza por la ausencia de movimiento voluntario tras la estimulación. En este ensayo, los insectos fueron inyectados con aproximadamente 50 unidades formadoras de colonias de una cepa silvestre o de una cepa mutante atenuada de Xer Haus NLA groan en fase logarítmica media. Los insectos fueron observados durante aproximadamente 72 horas y se registró el porcentaje de insectos inyectados que aún estaban vivos en cada punto de tiempo.En este experimento, la cepa atenuada mostró un retraso evidente en la muerte de los insectos, mientras que la cepa de tipo silvestre mató a las seis larvas dentro de las 30 horas posteriores a la inyección, antes de que muriera cualquiera de las larvas infectadas con la mutante. Los datos son estadísticamente distintos siguiendo este procedimiento. Otros métodos, como la extracción de ARN y la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real, pueden realizarse para responder preguntas adicionales, como determinar si la bacteria es capaz o no de manipular la respuesta inmune del insecto.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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