Placa de Ensayo para Norovirus murino

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar partículas infecciosas de norovirus en neuronas. Esto se logra primero preparando una dilución decimal del inóculo viral. El segundo paso consiste en transferir la dilución del inóculo viral a una monocapa de RAW 264.7 y incubar las placas agitando a temperatura ambiente durante una hora.

A continuación, aspire el inóculo y cubra con una proporción uno a uno de agar de placas C y dos XMEM, e incube las placas durante 48 horas en un incubador de cultivo de tejidos. El paso final consiste en cubrir con la solución de tinción de rojo neutro e incubar las placas durante una a tres horas en un incubador de cultivo de tejidos. Finalmente, se aspira cuidadosamente la solución de tinción de rojo neutro sin eliminar la capa de agar sobrepuesta y se cuentan las placas utilizando una caja de luz.

Este método de cuantificación de partículas virales infecciosas puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del norovirus, como la cantidad de partículas infecciosas eliminadas en las heces o qué tejidos permiten la infección. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades para mantener células sanas y viables durante todo el ensayo. La demostración visual de este método es fundamental, ya que el ensayo de placas para el virus neurotrópico espejo puede ser difícil de comprender para quienes no tienen experiencia previa.

La finalización exitosa de este ensayo es una serie acumulativa de pasos que requieren la cantidad adecuada de células, la temperatura correcta y un manejo preciso para observar fácilmente las placas. Primero, examine la monocapa celular bajo un microscopio óptico para verificar la morfología de las células. La mayoría de las células deben aparecer redondas.

No permita que las células sobrepasen el crecimiento, ya que normalmente no formarán placas; masajee un matraz para cultivo de tejidos de 175 centímetros cuadrados con células RAW 264.7 casi confluentes para el ensayo de placas de virus murino. Aspire el medio del matraz y agregue 10 mililitros de DMEM 10 fresco a las células. A continuación, raspe las células del fondo del matraz con un raspador celular y utilice una pipeta de 10 mililitros para aspirar y luego expulsar la suspensión celular contra el fondo del matraz. Repita esta acción al menos tres veces para desagregar cualquier grumo de células.

Para adaptar un matraz de reserva. Retire uno o dos mililitros de la suspensión celular y colóquelos en un matraz fresco de 175 centímetros cuadrados que contenga de 33 a 34 mililitros de DMEM 10. Incube el matraz en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono durante dos o tres días y vuelva a masajear.

Una vez completado el siembra de las placas para el ensayo, ajuste la densidad de la suspensión celular a un millón de células viables por mililitro en DMEM 10 y agregue dos mililitros de esta suspensión a cada pocillo de una placa de seis pocillos con diámetro de 3,5 centímetros. Tape la placa y luego agítela inmediatamente a mano diez veces para distribuir las células uniformemente en los pocillos.

No humedezca la placa, ya que esto hará que las células se agrupen en el centro del pocillo. Luego, coloque la placa en un incubador de cultivo de tejidos durante un mínimo de cuatro horas, o idealmente durante la noche, para que las células se adhieran. El inóculo viral se puede obtener de tejidos homogenizados infectados con MNV o de muestras fecales de ratones infectados con MNV. Si se utilizan muestras de tejido, coloque un trozo del tamaño de un guisante en un tubo de tapón roscado de dos mililitros que contenga perlas de sílice estériles y un mililitro de DMEM 10, y homogenice aquí.

Se utiliza un magnetizador a 6.000 RPM durante un minuto. Si se usan muestras fecales, homogenice no más de tres pellets fecales de la misma manera, congele las muestras homogenizadas a menos 80 grados Celsius y descongele el inóculo el día del ensayo de placas. Utilice una pipeta repetidora para dispensar 1,35 mililitros de DMEM 5 en cada pocillo de una placa de 24 pocillos y luego pipete 0,15 mililitros del tercer inóculo viral en el primer pocillo de la placa.

Realice diluciones seriadas de diez veces aspirando 0,15 mililitros de la primera dilución 10 a la menos uno y transfiriéndolos al segundo pocillo de la placa para obtener una dilución 10 a la menos dos. Luego repita el proceso con la dilución del segundo pocillo para obtener una dilución 10 a la menos tres. Tenga en cuenta que puede ser necesario realizar diluciones adicionales hasta 10 a la menos nueve, dependiendo de la muestra.

Una vez preparadas las diluciones seriadas, etiquete las placas con células raw 2 64 0.7 al 60-80 % de confluencia con los nombres de las muestras y la dilución que se está utilizando. A continuación, retire todo el medio de una de las placas mediante aspiración o agitación y añada 0,5 mililitros de una muestra diluida a un pocillo. Repita el procedimiento en un pocillo duplicado y luego continúe con la siguiente dilución más baja.

Una vez que se hayan agregado las tres diluciones a una placa en duplicado, incline la placa hacia adelante y hacia atrás para asegurarse de que todas las células hayan quedado cubiertas. Repita el procedimiento con la siguiente placa de células. Una vez que se hayan tratado todas las placas, coloque las placas en un aparato agitador ajustado a aproximadamente 18 oscilaciones por minuto durante una hora a temperatura ambiente, y caliente en microondas un frasco de aros previamente preparado o enclavado hasta que se derrita.

Luego, coloque los aros fundidos en un baño de agua a 42 grados Celsius para equilibrarlos a la temperatura. A continuación, mezcle los agros fundidos con medio XMEM estéril en una botella estéril en una proporción uno a uno. Coloque la botella que contiene esta solución de recubrimiento en un baño de agua a 37 grados Celsius hasta que esté lista para usar.

Al finalizar la incubación de una hora, aspire el inóculo de cada pocillo y agregue lentamente dos mililitros de la solución de recubrimiento a cada pocillo, asegurándose de colocar la punta de la pipeta contra la pared de cada uno. Para evitar desalojar las células, tape las placas y deje que el recubrimiento solidifique durante aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente. Luego, transfiera las placas al incubador de cultivo de tejidos durante 48 horas.

Tras el período de incubación, revise las placas para comprobar la presencia de placas. Si no se observan placas, devuelva las placas al incubador y vuelva a revisarlas después de cuatro horas. Repita el procedimiento si es necesario, pero la incubación no debe exceder las 72 horas.

Primero, prepare la solución de tinción con rojo neutro. Luego, agregue dos mililitros de la solución de rojo neutro a cada pocillo; para este protocolo, no es necesario retirar el tapón de aros. Incube las placas a 37 grados Celsius durante una hora.

Una vez transcurrido el tiempo de incubación, revise las placas para detectar la presencia de placas manteniendo la solución de rojo neutro en los pocillos. Si no es evidente la tinción, incube las placas durante otra hora, hasta un máximo de tres horas. Cuando las placas sean visibles, aspire la solución de rojo neutro, asegurándose de que el tapón formado no se perturbe, y luego proceda a contar las placas.

Examine las placas y encuentre la dilución en la que las placas estén claramente separadas. Coloque la placa sobre una caja de luz y cuente las placas marcando un punto sobre las placas contadas. Para evitar conteos duplicados.

Luego repita el conteo en un pocillo con una dilución diferente del virus y calcule la titulación viral en unidades formadoras de placas por mililitro. De acuerdo con las instrucciones del protocolo escrito, esta imagen representativa muestra una monocapa antes de la infección. Las células raw 2 6 4 0.7 se cultivaron durante la noche e se imaged bajo un microscopio óptico con una magnificación de 20 veces.

Esta imagen muestra la misma monocapa tras la formación de placas. Las células fueron teñidas con una solución de rojo neutro al 0,01% tras 48 horas de infección y visualizadas bajo un microscopio óptico con un aumento de cuatro veces. Los números romanos uno, dos y tres indican tres placas visibles.

Esta imagen muestra una placa al final del protocolo de ensayo de placas con pocillos duplicados de tres diluciones decimales etiquetados con números romanos. Los números uno y cuatro corresponden a la dilución 10 a la menos uno. Las diluciones dos y cinco corresponden a 10 a la menos dos, y las tres y seis corresponden a 10 a la menos tres.

El título viral de la muestra se indica a continuación. Al realizar este procedimiento, es importante recordar cambiar las puntas de pipeta entre diluciones para evitar la contaminación cruzada entre muestras, equilibrar las soluciones a la temperatura correcta y no permitir que las monocapas celulares se sequen. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un ensayo de placas y cuantificar partículas infecciosas de mi neurovirus.

No olvide que al trabajar con Mira Norovirus en una cabina de seguridad biológica, siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y bata mientras se realiza este procedimiento, y los desechos deben eliminarse adecuadamente siguiendo las pautas establecidas por su comité local de seguridad biológica.