Name: La enumeración de las principales poblaciones de leucocitos de sangre periférica en ensayos clínicos multicéntricos utilizando un ensayo de sangre entera Fenotipado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 45 s
Description: Aprende a enumerar poblaciones de leucocitos en sangre periférica mediante citometría de flujo para ensayos clínicos multicéntricos. Este método estandarizado permite rastrear concentraciones celulares con precisión.

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Damos las gracias a Jessica Jones, Clark Erica, Ducar Constanza, Donna Smith, Lewis Roy, Apedaile Lily, Wiesner Joanne, Adams Devin, McBain Corey y Voght Stephen por su ayuda en el desarrollo de este método, manuscrito y video. Este trabajo fue financiado por la Fundación Bill y Melinda Gates CAVD subvención 38.645 (MJM) y los Institutos Nacionales de Salud subvenciones UM1 AI068618 y AI069481 U01 (MJM). EA-N. es apoyado por el NIH subvención T32 AI007140. Damos las gracias a la James B. Pendleton Charitable Trust por su donación generosa equipo.

Nota: Para proteger los anticuerpos conjugados con fluorocromo de la luz, realice todos los pasos en un gabinete de bioseguridad con la luz apagada. 1. Tinción de anticuerpos Panel Preparación <ol><li> El panel de tinción de anticuerpos se pueden encontrar en la Tabla 1. La concentración de anticuerpo debe ser definido por titulación con sangre entera y usando el equipo de citometría de flujo mismo y los procedimientos que se utilizarán para adquirir las muestras teñidas fenotipificación. </li><li> Una vez los títulos de tinción apropiados se determinan, se combinan todos los anticuerpos en una única mezcla en un tubo de bloqueo de la tapa. Añadir tampón de flujo de lavado (PBS de Dulbecco con 2% inactivado por calor suero fetal bovino) para llevar el volumen total a 100 l. Escala de la mezcla para el número de muestras que se están teñidas. Esta mezcla se puede almacenar a 4 ° C durante hasta ocho semanas. </li></ol> 2. La tinción <ol><li> Si la sangre recogida es para ser utilizado para otros fines en anunciocondición para este ensayo, establecer una alícuota a un lado mientras más sensibles al tiempo los procedimientos se realizan en la sangre restante. La alícuota se pueden almacenar a temperatura ambiente durante hasta 4 horas después de la punción venosa, sin pérdida significativa de células. </li><li> Compruebe que hay un intacta pellet talón en la parte inferior del tubo Trucount y etiqueta el tubo para identificar la muestra que se tiñeron. En los ensayos clínicos HVTN, el Laboratorio de Sistema de Gestión de Datos (Frontier Science y Technology Research Foundation; Amherst, NY) se utiliza para etiquetar y rastrear muestras de colores. </li><li> Anote los números de lote y fechas de caducidad de todos los reactivos. Anote el número de cuenta tubo Trucount talón proporcionado por el fabricante de la bolsa de tubos, asegúrese de que el número de lote en la bolsa coincide con el número de lote del tubo. </li><li> Utilizar Invertir pipeteado para pipetear exactamente 100 l de sangre total en el tubo Trucount, justo encima del retenedor metálico. Evitar manchas de sangre por el lado del tubo. </li><li&gt; Uso normal (hacia adelante) técnica de pipeteo, pipeta 100 l del panel de anticuerpos tinción mixta (Ver Tabla 1) en el tubo Trucount. Tapar el tubo y agitar a baja velocidad durante aproximadamente 15 segundos para mezclar. Inspeccione visualmente el tubo para asegurar que el gránulo cordón esté completamente disuelto. </li><li> Incubar el tubo Trucount durante 15 minutos a temperatura ambiente (15-30 ° C) en la oscuridad. </li><li> Si es necesario, se diluye una alícuota de 10 × solución de lisis FACS a 1X utilizando DIH 2 O. Añadir 900 l 1 x solución de lisis FACS para el tubo. </li><li> Tapar el tubo y agitar cuidadosamente a baja velocidad durante aproximadamente 15 segundos para mezclar. Empuje la tapa hacia abajo firmemente en la posición de bloqueo en el tubo y la junta con película de laboratorio. </li><li> Almacenar el tubo a -65 ° C a -95 ° C hasta que la muestra está lista para su envío al laboratorio central de análisis o para el análisis en casa. Las muestras son estables en esta etapa durante al menos cuatro semanas. Si va a enviar o ensayar inmediatatamente, este paso puede ser omitido. </li></ol> 3. Envío Nota: Las siguientes instrucciones utilizan un sistema de envío aislados de Saf-T-Pak, Inc. diseñado específicamente para envío categoría B biológicos sustancias exentas de acuerdo con International Air y Transport Association (IATA). Si el análisis de las muestras en la misma ubicación que la tinción ocurrió, vaya a la sección 4. <ol><li> Las muestras pueden ser enviado inmediatamente después de la tinción o una vez que se congelan a -65 ° C a -95 ° C. Envuelva cada tubo completamente en papel de aluminio y coloque en el cuadro de muestra de colores. Coloque la caja espécimen manchado el interior de una bolsa de polietileno a prueba de fugas con materiales absorbentes. </li><li> Coloque la prueba de filtración bolsa de polietileno y el contenido en una bolsa de Tyvek y sello con tan poco aire como sea posible en la bolsa. </li><li> Coloque el paquete espécimen (muestra dentro de un embalaje secundario) dentro de la caja marrón interior. </li><li> B Coloque el interior marrónbuey en el interior del pecho de espuma de poliestireno, fijándola en la muesca para evitar que se desplacen. </li><li> Llene el pecho de espuma de poliestireno con hielo seco (aproximadamente 8 kg) y coloque la tapa firmemente en el pecho. </li><li> Asegure con cinta adhesiva la caja de envío y de la nave como de Sustancias biológicas, Categoría B (UN3373) con el hielo seco adecuado (UN1845) del producto, siga IATA PI-650 instrucciones. </li><li> Tras la recepción, las muestras se almacenaron a -65 ° C a -95 ° C hasta que se analizaron. </li></ol> 4. Descongelación y análisis de citometría de flujo <ol><li> Retirar la muestra teñida del congelador se descongele a temperatura ambiente en la oscuridad antes de recoger en el citómetro de flujo. Si la recopilación de datos en más de una muestra, estandarizar el proceso para todos los tubos mediante el escalonamiento descongelación manera que los tubos no están sentados a temperatura ambiente durante más de 1 hora cada uno. </li><li> Las muestras deben ser obtenidas usando un citómetro de flujo láser cuatro equipado con filtros adecuados, tales como el BD LSRII. Utilice la calibración citómetro estándar y métodos de fluorescencia de compensación para la recolección de datos 4. </li></ol> Nota: No establezca umbrales de dispersión hacia adelante o al lado de dispersión durante la recogida 5. Perlas Trucount puede caer por debajo del valor de umbral más bajo posible para estos parámetros causantes de un subconjunto de perlas no tenerse en cuenta durante el análisis. Si es requerido por el instrumento, para establecer un umbral más bajo posible establecer el umbral Am Cian canal. Debido a que los leucocitos CD45 + teñidas con el panel estará Am Cian positivo, y los granos también Trucount fluorescencia en el canal Am Cian, esto debería permitir a todos los datos relevantes para ser debidamente recogidos. <ol start="3"><li> Vortex el tubo de muestra durante 5 segundos antes de cargar en el citómetro de flujo. Cuentas Trucount fluorescente altamente en muchos canales. Puerta de las cuentas durante la recolección mediante la búsqueda de la población que es muy positivo para la doble-PE Cy5 y APC (la colo dosrs que distinguen más fácilmente las perlas de las células puede variar dependiendo de la instrumentación). Seleccione la puerta de perla como la puerta de detener y registrar datos hasta por lo menos 20.000 cuentas se adquieren. </li><li> Analizar los datos con el software adecuado, como FlowJo (Treestar; Ashland, OR). Figura 1 se muestra el esquema de puerta utilizado para el análisis de las diferentes poblaciones de leucocitos de un empate de sangre del control representativo. </li></ol> 5. Cálculos Trucount <ol><li> Cada tubo contiene Trucount una pastilla liofilizada de perlas fluorescentes. Después de la adición de líquido al tubo y la agitación en vórtex, las perlas deben ser distribuidas por igual en toda la muestra. El número de los granos en la pastilla varía ligeramente según el número de lote y se puede encontrar en la bolsa de almacenamiento para los tubos. </li><li> Puerta de las cuentas Trucount y poblaciones de células, como se muestra en la Figura 1 para determinar el recuento de eventos para cada población. Comparando el número de eventos in de la puerta de vidrio hasta el número total de bolas originalmente en el tubo le permitirá determinar la proporción de la muestra recogidos, que entonces se puede utilizar para determinar la concentración absoluta (es decir, las células / l) para cada población. La siguiente ecuación se puede usar para este propósito: la concentración de la célula (# células / sangre entera l) = [# de población acontecimientos (eventos / # / # grano granos totales en pellet)] / 100 mu l. </li></ol> 6. Los resultados representativos <img src="/files/ftp_upload/4302/4302fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4302/4302fig1highres.jpg" /> Figura 1. Gating esquema utilizado para el análisis de grandes poblaciones de leucocitos que muestran datos representativos de un voluntario sano. A) perlas Trucount (i) están cerradas y excluido de las células. Granulocitos (ii) se delinean y lympohcytes y monocitos se dividen en 3 popluations: CD14linfocitos negativos (iii), todas las células CD14 negativas (iv) y que no son linfocitos (v). B) CD14 linfocitos negativos son gated para distinguir células T CD4 + (vi), células CD8 + T (vii), células B (viii), células CD56 brillantes NK (ix), CD56 dim células NK (x), y CD56 células NK negativos (xi). C) Todas las células CD14 negativas están cerradas para distinguir mieloide (xii) y (xiii plasmacitoides) células dendríticas. D) No lympocytes están cerradas para distinguir no clásicos (xiv), intermedio (XV) y clásico (xvi) los monocitos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4302/4302fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . Subconjuntos de células más específicas que no se muestran en la Figura 1 (por ejemplo, las células NKT o neutrófilos) también se pueden distinguir mediante el panel se presentan, y el esquema de puerta puede ser ampliado o modificado para satisfacer las necesidades específicas de estudio. Algunos pasos de activación periódica mostrados son únicas a este método. Cabe destacar que una puerta de la inclusión y lapuerta de exclusión se dibujan alrededor de las perlas Trucount y se coloca en la parte superior de uno al otro, uno a la puerta de las perlas para el recuento, y la otra para excluir las perlas del análisis celular (Figura 1A). Además, debido a los linfocitos, monocitos y granulocitos no son como se distingue fácilmente en la sangre entera como lo son en las células mononucleares de sangre periférica por dispersión frontal y dispersión lateral, gating estas células utilizando expresión CD45 y la dispersión lateral es a menudo necesario (Figura 1A). Granulocitos contaminantes (círculo) que no pudieron ser separados de linfocitos y monocitos utilizando CD45 y dispersión lateral son distinguibles en algunas parcelas por su alta expresión de CD16 (Figura 1C y Figura 1D). El número de granulocitos contaminantes es generalmente pequeño, y que no interfieran con gating celular de monocitos y NK.

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<li>Brando, B., Barnett, D., Janossy, G., Mandy, F., Autran, B., Rothe, G., Scarpati, B., D'Avanzo, G., D'Hautcourt, J. L., Lenkei, R., Schmitz, G., Kunkl, A., Chianese, R., Papa, S., Gratama, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytofluorometric+methods+for+assessing+absolute+numbers+of+cell+subsets+in+blood.+European+Working+Group+on+Clinical+Cell+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis.</a> Cytometry. 42, 327-346 (2000).</li>
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<li>Vuckovic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+dendritic+cells+in+clinical+practice+using+a+new+whole+blood+single-platform+TruCOUNT+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Monitoring dendritic cells in clinical practice using a new whole blood single-platform TruCOUNT assay.</a> J. Immunol Methods. 284, 73-87 (2004).</li>
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<li>Hosmalin, A., Lichtner, M., Louis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+analysis+of+dendritic+cell+subsets%3A+the+dendritogram%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Clinical analysis of dendritic cell subsets: the dendritogram.</a> Methods Mol. Biol. 415, 273-290 (2008).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

En este informe se presenta un método basado en perlas para enumerar las poblaciones de leucocitos en sangre entera fresca por citometría de flujo y cubrir los parámetros necesarios para su uso en un ensayo clínico multicéntrico con el análisis de muestras centralizado. Este método se basa en el protocolo y optimiza BD Trucount y permite su uso confiable en un entorno ensayo clínico multicéntrico. El ensayo de tinción es simple y toma aproximadamente 45 minutos para llevar a cabo, por lo que es factible para los técnico...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Trucount absolutos Tubos de conteo </td><td> BD Biosciences </td><td> 340334 </td></tr><tr><td> FACS 10X Solución de lisis </td><td> BD Biosciences </td><td> 349202 </td></tr><tr><td> Categoría B &amp; Sistema de Envío Quito, con aislamiento </td><td> Saf-T-Pak </td><td> STP-320 </td></tr><tr><td> CD45 AmCyan anticuerpo monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 339192 </td></tr><tr><td> CD3 FITC anticuerpo monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td></tr><tr><td> CD8-PerCP Cy 5,5 anticuerpo monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 341051 </td></tr><tr><td> CD4 Alexa Fluor 700 Antibo monoclonaldy </td><td> BD Biosciences </td><td> 557922 </td></tr><tr><td> HLA-DR ECD anticuerpo monoclonal </td><td> Beckman Coulter </td><td> IM3636 </td></tr><tr><td> V450 CD14 anticuerpo monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 560349 </td></tr><tr><td> CD19 PE anticuerpo monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 555413 </td></tr><tr><td> CD16 APC-H7 anticuerpo monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 560195 </td></tr><tr><td> CD56 PE-Cy7 anticuerpo monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 335791 </td></tr><tr><td> CD11c APC anticuerpo monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 559877 </td></tr><tr><td> CD123 PE-Cy5 anticuerpo monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 551065 </td></tr></tbody></table>

la enumeración de las principales poblaciones de leucocitos de sangre periférica en ensayos clínicos multicéntricos utilizando un ensayo de sangre entera fenotipado

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Crioconservación de leucocitos de sangre periférica se utiliza ampliamente para conservar las células para las evaluaciones de la respuesta inmune en los ensayos clínicos y ofrece muchas ventajas para la facilidad y la normalización de las evaluaciones inmunológicas, pero los efectos perjudiciales de este proceso se han observado en algunos subconjuntos de células, tales como los granulocitos, células B , y las células dendríticas 1-3. Ensayo de leucocitos frescas da una imagen más precisa del estado in vivo de las células, pero a menudo es difícil de realizar en el contexto de ensayos clínicos grandes. Los ensayos de células frescas dependen de compromisos voluntarios y los plazos, y si consume tiempo, su aplicación puede ser poco práctico debido a las horas de trabajo necesarias del personal de laboratorio. Además, cuando los ensayos se llevan a cabo en varios centros, laboratorios con los recursos y la capacitación necesarios para llevar a cabo los ensayos no pueden estar situados en la proximidad suficiente a los sitios clínicos. Para abordar estas cuestiones, tenemos que desarrorrollado un panel de anticuerpos 11-tinción de color que se puede utilizar con tubos de Trucount (Becton Dickinson, San Jose, CA) a fenotipo y enumerar las principales poblaciones de leucocitos en la sangre periférica, con un rendimiento más robusto de células de tipo información específica de ensayos tales como un Recuento sanguíneo completo (CSC) o ensayos comercialmente disponibles con paneles diseñados para tubos Trucount que manchan por sólo unos pocos tipos de células. El procedimiento de tinción es simple, requiere sólo 100 l de sangre entera fresca, y tarda aproximadamente 45 minutos, por lo que es factible para el estándar de procesamiento de la sangre para llevar a cabo los laboratorios. Es una adaptación de la hoja BD Trucount tubo técnica de datos ( <a href="http://www.bdbiosciences.com/external_files/is/doc/tds/Package_Inserts_CE/live/web_enabled/23-3483-06_PI_Trucount tubes_CE_EN.pdf" target="_blank">versión 8/2010</a> ). El cóctel de anticuerpos de tinción puede ser preparado de antemano a granel en un laboratorio central de ensayo y se envían a los laboratorios de transformación en el lugar. Tubos manchados puede ser fijadoy se congelan para su envío al laboratorio de ensayo central para el análisis multicolor citometría de flujo. Los datos generados a partir de este panel de tinción se puede utilizar para rastrear los cambios en las concentraciones de leucocitos en el tiempo en relación con la intervención y fácilmente podrían ser desarrolladas para evaluar los estados de activación de tipos de células específicas de interés. En este informe, demuestran el procedimiento utilizado por los técnicos de laboratorio de procesamiento de sangre para realizar la tinción de sangre entera fresca y los pasos para analizar estas muestras teñidas en un laboratorio de ensayo de soporte central un ensayo clínico multicéntrico. Los detalles del video del procedimiento, ya que se realiza en el contexto de un proyecto de ensayo clínico de la sangre en la Red de Ensayos de Vacunas contra el VIH (HVTN).

En este informe, demuestran los pasos de tinción y análisis de un ensayo de fenotipo realiza en la sangre entera fresca para enumerar las principales poblaciones de leucocitos innatos y adaptativos. Hacemos hincapié en las consideraciones para llevar a cabo estos procedimientos en el contexto de un ensayo clínico multicéntrico.

La enumeración de las principales poblaciones de leucocitos de sangre periférica en ensayos clínicos multicéntricos utilizando un ensayo de sangre entera Fenotipado

La criopreservación de leucocitos de sangre periférica se utiliza ampliamente para preservar las células para las evaluaciones de la respuesta inmunitaria en ensayos clínicos y ofrece muchas...

Este video describe el procedimiento desarrollado por la Red de Ensayos Clínicos de Vacunas contra el VIH en el Centro de Investigación del Cáncer Fred Hutchinson para teñir sangre entera fresca en ensayos clínicos multicéntricos que serán analizados por un laboratorio centralizado. El procedimiento utiliza tubos tru count fabricados por Becton Dickenson Biosciences, cada uno de los cuales contiene un pellet liofilizado que se disuelve durante la preparación de la muestra para liberar un número conocido de microesferas fluorescentes. Se utilizan anticuerpos fluorescentes para teñir marcadores de superficie específicos de diferentes poblaciones celulares.El número de células en estas diferentes poblaciones puede compararse con el número de microesferas fluorescentes durante el análisis de citometría de flujo, y se pueden rastrear en el tiempo las concentraciones absolutas de distintas poblaciones de leucocitos en sangre completa en relación con la intervención. Hola, mi nombre es Erica Anderson Nissan y soy científica titular en la Red de Ensayos Clínicos de Vacunas contra el VIH. El procedimiento que está a punto de ver es uno que hemos desarrollado para su uso en nuestros ensayos clínicos multicéntricos.En estos ensayos, los técnicos de laboratorio que procesan sangre reciben muestras de sangre entera fresca, las tiñen con anticuerpos marcados con fluorescencia y luego envían las muestras a un laboratorio centralizado capaz de analizarlas mediante citometría de flujo. La sangre entera fresca a menudo no se analiza en el contexto de ensayos clínicos debido a problemas de costo y viabilidad, pero hemos desarrollado un panel de tinción con un solo anticuerpo que puede identificar las principales poblaciones de leucocitos en sangre periférica, y la tinción de estas poblaciones lleva menos de 45 minutos, lo que lo hace viable para su uso en ensayos clínicos. En el HVTN, estamos utilizando este panel para comprender los eventos iniciales que ocurren tras la vacunación con candidatos a vacunas contra el VIH, aunque este panel PI podría modificarse aún más para centrarse en los tipos celulares de interés para cada investigador. Muchas gracias por ver este video y esperamos que les sea útil en el futuro.La Tabla Uno muestra un panel de tinción con 11 colores de anticuerpos desarrollado para fenotipificar y enumerar las principales poblaciones de leucocitos en la sangre periférica. El cóctel de anticuerpos es preparado por el laboratorio central de ensayos y enviado a los laboratorios de procesamiento para garantizar la consistencia entre los sitios y permitir que los cócteles sean probados en una muestra de sangre control antes de utilizarse para teñir muestras del ensayo. Cada anticuerpo marcado con fluorocromo se titula por separado y luego los anticuerpos se combinan utilizando las titulaciones adecuadas en una mezcla única con tampón de lavado para citometría que contiene PBS delcos con 2% de suero bovino fetal inactivado por calor.El cóctel de anticuerpos se etiqueta con un número de lote y una fecha de vencimiento, y se envía desde el laboratorio central del ensayo a los laboratorios de procesamiento utilizando un sistema de embalaje que mantiene una temperatura de cuatro grados Celsius durante el envío. Una vez recibido, el panel de tinción con anticuerpos puede almacenarse a cuatro grados Celsius en la oscuridad durante hasta ocho semanas. Se utiliza la solución de corte BD fax después de la tinción para lisar los glóbulos rojos y fijar las tinciones de anticuerpos, al mismo tiempo que se preservan los leucocitos.La solución se recibe del fabricante a una concentración 10 x y es diluida una parte a 10 por el laboratorio central de ensayos con agua desionizada. La solución diluida se etiqueta entonces con un número de lote y una fecha de vencimiento, y se envía a temperatura ambiente a los laboratorios de procesamiento una vez recibida. La solución para marcado Fax se almacena a temperatura ambiente entre 15 y 30 grados Celsius antes de la extracción de sangre para la tinción de recuento verdadero.El laboratorio de procesamiento debe asegurarse de que todos los reactivos apropiados han sido obtenidos del laboratorio central de ensayos. Estos incluyen los tubos BD TRU count, el panel combinado de tinción con anticuerpos y una solución de licencia x fax. El HVTN utiliza un sistema de gestión de datos de laboratorio para registrar toda la información relevante de cada muestra.Un código de identificación único se imprime en una etiqueta que se coloca en el tubo de recuento verdadero. Para rastrear la muestra durante todo el proceso, etiquete un vial criogénico para identificar la muestra que se va a teñir. Esto generalmente incluirá un identificador del paciente o voluntario, un identificador de la visita y la fecha de recolección de la sangre. Aliquote la cantidad requerida de sangre en el vial criogénico etiquetado utilizando técnica aséptica.La cantidad de sangre utilizada para la tinción depende del panel de tinción que se utilice, pero normalmente es de 50 o 100 microlitros por panel. El vial criogénico puede dejarse aparte hasta cuatro horas a temperatura ambiente antes de la tinción. Una vez más, se realizan procedimientos sensibles al tiempo con la sangre restante.Verifique que haya un pellet de perlas intacto en el fondo del tubo y etiquete el tubo de recuento tru. Con la información pertinente de la muestra, registre los números de lote y las fechas de vencimiento de todos los reactivos. Las hojas de trabajo son útiles para rastrear esta información durante un ensayo clínico.El número de cuentas de la tru count tube y el número de lote pueden encontrarse en la parte frontal de la bolsa de tru count tubes. Cuando esté listo para comenzar el proceso de tinción tru Count, asegúrese de tener todos los materiales y reactivos preparados para su uso en la cabina de seguridad biológica. Estos incluyen la alícuota de sangre etiquetada como tru count tube, el tubo del panel de tinción con anticuerpos combinados, una solución x fax lacing, micropipetas de 200 microlitros y 1000 microlitros con puntas para pipeta, lejía en papel aluminio, película de laboratorio y un temporizador después de la tinción.También necesitará una caja para muestras teñidas, aunque esto no necesita estar en la campana. La cantidad de sangre y de anticuerpo a utilizar varía según qué células se distingan mediante el panel y cuántas células sean necesarias para un análisis adecuado. Cada panel se prueba en muestras control para determinar la cantidad óptima de sangre para la tinción, y la cantidad de anticuerpo utilizada es igual a la cantidad de sangre empleada para el panel mostrado en este video.Se utilizarán 100 microlitros de sangre y 100 microlitros de anticuerpo antes de pipetear. Mezcle la sangre invirtiendo suavemente el tubo varias veces y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces. Para asegurar aún más que la sangre esté bien mezclada.Luego, utilice la pipetación por retroceso para pipetear con precisión sangre completa desde la alícuota hasta el tubo tru count, justo por encima del sujetador metálico. Evite salpicar sangre por el costado del tubo. Reemplace la punta de la pipeta entre cada tubo tru count.Ahora es el momento de teñir la sangre con el panel de anticuerpos antes de pipetear. Mezcle el panel de tinción pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces. Añada 100 microlitros de la mezcla de anticuerpos a la sangre en el tubo de recuento verdadero.No pipetee de forma inversa en este paso, ya que se desperdiciará el reactivo valioso. Tape el tubo y vortexee a baja velocidad durante aproximadamente 15 segundos para mezclar. Asegúrese de que el pellet de perlas se haya disuelto completamente.Cubra el tubo con papel de aluminio y configure un temporizador para teñir la sangre durante 15 minutos. La cantidad de solución de corte de fax al uno x necesaria es nueve veces la cantidad de sangre utilizada en el ensayo, por lo que en este ejemplo se utilizan 900 microlitros de solución de corte de fax al uno x. Después de la incubación de 15 minutos, agregue 900 microlitros de la solución de corte de fax al uno x a la sangre teñida para fijar el tinte y lisar los glóbulos rojos.No es necesario el pipeteo por retroceso en este paso. Tape el tubo y vortexee a baja velocidad durante aproximadamente 15 segundos para mezclar. Presione firmemente la tapa hacia abajo hasta que encaje en posición de bloqueo y selle. Con película de laboratorio. Almacene los tubos en una caja oscura o completamente envueltos en papel de aluminio a entre menos 65 y menos 95 grados Celsius hasta que se envíen al laboratorio central de ensayos. Hasta la fecha, las pruebas han demostrado que las muestras son estables hasta cuatro semanas a esta temperatura; las muestras teñidas deben enviarse como sustancias biológicas de categoría B, siguiendo las normas de la Asociación Internacional de Transporte Aéreo o IATA.Los reglamentos del HVTN indican que las muestras se envían semanalmente desde los laboratorios de procesamiento al laboratorio central de ensayos mediante un sistema de envío aislado de Safety Pack Ink, diseñado específicamente para cumplir con estos requisitos. Al utilizar este sistema, coloque la caja interior marrón dentro del cofre de espuma de poliestireno, asegurándola en la muesca para evitar desplazamientos. Llene completamente el cofre con hielo seco y espere de cinco a diez minutos para permitir que la caja se enfríe.Para preparar las muestras para su envío, envuelva completamente cada tubo y papel de aluminio y colóquelos en la caja para muestras teñidas. Coloque material absorbente en una bolsa de polietileno hermética junto con la caja para muestras teñidas. Retire el exceso de aire de la bolsa y séllela firmemente.Coloque la bolsa de polietileno hermética dentro de una bolsa de Tyvek. Nuevamente, retire todo el aire de la bolsa antes de sellarla. Coloque el paquete de la muestra dentro de la caja marrón interior y coloque firmemente la tapa sobre el cofre de espuma de poliestireno.Selle firmemente la caja de envío y envíe como sustancia biológica categoría B con las etiquetas adecuadas de hielo seco. Siga las instrucciones I ATA PI seis 50 en ensayos clínicos multicéntricos. Es importante hacer un seguimiento de las muestras durante las etapas de almacenamiento a corto plazo, envío y almacenamiento a largo plazo.El sistema de gestión de datos utilizado por el HVTN permite la creación de una lista de envío que puede importarse a la base de datos de muestras en el laboratorio central de ensayos, donde se almacenarán y analizarán las muestras. Esto crea un registro de cuándo se enviaron y recibieron las muestras, dónde se almacenaron definitivamente y cuándo se retiraron. Para el análisis, retire la muestra teñida del congelador y déjela descongelar a temperatura ambiente en una caja oscura.No más de una hora antes de recolectar en el citómetro de flujo. Si se recopilan datos de más de una muestra, descongele de forma escalonada para que los tubos no permanezcan a temperatura ambiente más de una hora. Cada muestra debe adquirirse utilizando un citómetro de flujo de cuatro láseres equipado con filtros adecuados, como el BD LSR II; utilice métodos estándar de calibración del citómetro y compensación de fluorescencia para la recopilación de datos, según requiera el instrumento. Para establecer un umbral, configure el umbral más bajo posible en el canal amarillo-cian; vortex el tubo de muestra durante cinco segundos antes de cargarlo en el citómetro de flujo.Las perlas tru count del citómetro fluorescen intensamente en muchos canales. Gated las perlas durante la recopilación identificando la población que es doble positiva intensa. Para PE SCI cinco y un PC, tenga en cuenta que los dos colores que distinguen más fácilmente las perlas de las células pueden variar según el instrumento.Seleccione la puerta del marcador tru count como puerta de detención y registre los datos hasta que se adquieran al menos 20.000 microesferas. Analice los datos utilizando un software adecuado, como FlowJo. A continuación, describiremos el esquema de selección de puertas utilizado para el análisis de las principales poblaciones de leucocitos, empleando datos obtenidos de una muestra de sangre control representativa.También se pueden distinguir subpoblaciones celulares más específicas utilizando el panel, como células NKT o neutrófilos, aunque estas no se mostrarán en este ejemplo. Primero, se traza una compuerta de inclusión y una compuerta de exclusión alrededor de las cuentas de recuento tru, colocándolas una encima de la otra para obtener las cuentas utilizadas en el recuento y otra para excluir las cuentas del análisis celular. A continuación, se aplican compuertas a los datos celulares, excluyendo las cuentas, para incluir únicamente células individuales utilizando la altura de dispersión frontal frente al área de dispersión frontal.Esta compuerta también excluye los restos pequeños. Luego se seleccionan las células positivas para CD45, separando los granulocitos de los linfocitos y monocitos mediante la dispersión lateral. A continuación, los linfocitos y monocitos se separan en tres grupos distintos utilizando CD14 y la dispersión lateral.Estos incluyen linfocitos CD14 negativos, todas las células CD14 negativas y no linfocitos; a partir de las células del gate de linfocitos CD14 negativos, primero se dividen en tres grupos: CD3 positivo CD19 negativo, CD3 negativo CD19 positivo y CD3 negativo CD19 negativo. Las células T se seleccionan a partir del gate CD3 positivo CD19 negativo. Tras excluir las células CD56 positivas y CD16 positivas, pueden distinguirse las células T CD4 positivas y CD8 positivas. Las células B se seleccionan a partir del gate CD3 negativo CD19 positivo, tras excluir las células CD56 positivas y CD16 positivas, y las células NK se seleccionan a partir del gate CD3 negativo CD19 negativo.Después de excluir posibles monocitos contaminantes mediante el uso de CD11c y CD4, las células NK se dividen en poblaciones CD56 brillante, CD56 DM y CD56 negativa. Para distinguir la población de células dendríticas, todas las células CD14 negativas se seleccionan para excluir células positivas para CD3, positivas para CD19, positivas para CD56 y positivas para CD16. A partir de ahí, se seleccionan las células positivas para HLA-DR y las células dendríticas mieloides y las células dendríticas plasmacitoides pueden diferenciarse según su expresión de CD11c y CD123.Por último, a partir de la puerta de no linfocitos, se seleccionan los subconjuntos de monocitos tras excluir posibles células contaminantes positivas para CD56, positivas para CD3 y positivas para CD19. Los monocitos no clásicos, intermedios y clásicos se distinguen según su expresión de CD16 y CD14. Una vez que las poblaciones de interés han sido seleccionadas, se pueden calcular las concentraciones.La comparación del número de eventos en la puerta de microesferas con el número total de microesferas originalmente presentes en el tubo permitirá determinar la proporción de muestra recolectada, la cual puede utilizarse luego para determinar la concentración absoluta. Nuestras células por microlitro para cada población. La ecuación mostrada aquí puede utilizarse para este fin.En este video, mostramos el procedimiento utilizado por los técnicos de laboratorio de procesamiento de sangre para realizar la tinción de sangre total fresca y los pasos para analizar estas muestras teñidas en un laboratorio central de ensayos. En el contexto de un ensayo clínico multicéntrico, hemos demostrado que el ensayo es sencillo y de duración relativamente corta, lo que hace factible que los técnicos de laboratorio de procesamiento de sangre lo realicen, y que congelen y envíen las muestras al laboratorio de ensayo esencial para su análisis. La clave para obtener resultados precisos y consistentes consiste en estandarizar cuidadosamente los pasos críticos del protocolo y utilizar un sistema de documentación que registre todos los pasos, de modo que cualquier anomalía detectada pueda rastrearse hasta su origen.Los datos generados a partir de este panel de tinción pueden utilizarse para rastrear los cambios en las concentraciones de leucocitos a lo largo del tiempo y podrían desarrollarse fácilmente más para evaluar los estados de activación de tipos celulares específicos de interés.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un dispositivo de microfluidos automatizado fue desarrollado para la circulación de enriquecimiento de células nucleadas de sangre periférica mediante lisis de los eritrocitos que garantiza el aislamiento de la muestra de alta calidad sin pérdida de células.

Automatizada de sangre de microfluidos Protocolo de lisis para el Enriquecimiento de la circulación las células nucleadas

Source: Xu, C., et al. An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the phenotyping of EBV-infected T and NK cell lines using flow cytometry, highlighting the preparation, antibody staining, and analysis steps to identify lineage-specific surface markers. It shows how marker profiles confirm distinct T-cell and NK-cell populations.

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Este video muestra una técnica basada en citometría de flujo que utiliza dos fluorocromos para identificar linfocitos T CD4+ y CD8+, linfocitos T γδ, linfocitos B, linfocitos citolíticos naturales (NK) y monocitos en linfocitos mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs). Al incubar las células con anticuerpos conjugados con fluorocromo contra los marcadores de superficie, los subconjuntos de células se identifican utilizando una estrategia óptima de activación por citometría de flujo.

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El inmunofenotipado de sangre total es indispensable para monitorizar el sistema inmunitario humano. Sin embargo, el número de reactivos necesarios y la inestabilidad de fluorocromos específicos en los cócteles premezclados requieren la preparación diaria de reactivos. Aquí mostramos que la preparación semiautomatizada del cóctel de anticuerpos de tinción ayuda a establecer un inmunofenotipado confiable al minimizar la variabilidad en la dispensación de reactivos.

Un enfoque semi-automatizado de preparación de cócteles de anticuerpos para el Análisis Inmunofenotípicos de la sangre periférica humana

Detección de enfermedad residual mínima o medible (Milirutherford) es un biomarcador pronóstico importante para refinar la evaluación de riesgo y predicción de la recaída en la leucemia mieloide aguda (AML). Estas directrices amplias y recomendaciones con las mejores prácticas de identificación consistente y precisa y detección de MRD, puede ayudar en la toma de decisiones eficaces de tratamiento de AML.

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Caracterización de subconjuntos de monocitos humanos de sangre análisis de citometría de flujo

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Preparación De Pellets De Células Mononucleares De Sangre Periférica Y Plasma De Una Sola Extracción De Sangre En Los Sitios De Ensayos Clínicos Para El Análisis De Biomarcadores

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La enumeración de las principales poblaciones de leucocitos de sangre periférica en ensayos clínicos multicéntricos utilizando un ensayo de sangre entera Fenotipado (Video) | JoVE Journal

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