Síntesis de nanoemulsiones de cambio de fase con distribuciones de tamaño estrechas para la vaporización Droplet acústica y Bubble mejorada ablación por ultrasonidos mediada

El objetivo general del siguiente experimento es observar el efecto de las burbujas generadas por la vaporización acústica de nanoemulsiones recubiertas de lípidos sobre la ablación mediada por ultrasonido. Esto se logra primero dispersando nanoemulsiones recubiertas de lípidos en hidrogeles de poli(acrilamida) cargados con albúmina. Como segundo paso, un transductor enfocado transmite pulsos cortos de alta amplitud al hidrogel, lo que provoca la vaporización local de las nanoemulsiones en el foco; a continuación, las burbujas resultantes son impulsadas continuamente mediante ultrasonido, y la energía acústica irradiada por las burbujas es rápidamente absorbida por el hidrogel, lo que acelera la velocidad del calentamiento mediado por ultrasonido.

Los resultados muestran que la presencia de burbujas reduce drásticamente el tiempo y la energía necesarios para calentar el hidrogel por encima de la temperatura umbral de desnaturalización proteica, lo que resulta en una ablación mediada por ultrasonido más rápida y eficiente. El tamaño de la nanoemulsión de cambio de fase es un factor determinante crít游戏副本

Aunque se describe un sistema in vitro, la formulación de las nanoemulsiones está diseñada para alcanzar tejidos extravasculares y tumores sólidos mediante partículas que pueden vaporizarse acústicamente. Las burbujas formadas entonces pueden utilizarse para aplicaciones diagnósticas o terapéuticas en el manejo del cáncer. Para comenzar el procedimiento de preparación de una nanoemulsión con cambio de fase o PSNE, primero mezcle los lípidos juntos disolviendo 11 miligramos de DPPC y 1,7 miligramos de DSPE.

Coloque 2000 µg de PEG en cloroformo en un matraz redondo de vidrio. Coloque el matraz redondo en un baño de agua a 50 grados Celsius dentro de una campana extractora de gases, y utilice un flujo de gas argón para evaporar el disolvente orgánico. Para formar una película lipídica seca, coloque el matraz en un desecador y déjelo bajo vacío durante la noche, desecando así la película lipídica para la mañana siguiente.

Rehidrate la película lipídica con 5,5 mililitros de PBS. Caliente la solución en un baño de agua a 45 grados Celsius hasta que la película lipídica se disuelva para su análisis. Transfiera periódicamente la solución lipídica a un vial de siete mililitros y luego sométala a ultrasonido con una sonda ultrasónica durante dos minutos al 20 % de amplitud.

Divida la solución en dos viales de 2,5 mililitros cada uno. Se desecha el resto de 0,5 mililitros. Añada 2,5 mililitros de PBS a cada vial y luego coloque ambos viales en un baño de hielo con agua a cero grados Celsius.

Añada 50 microlitros de doca fluoro pentano, o DDFP, a cada tubo. Sone la mezcla lipídica de DDFP. Esta etapa, realizada en un baño de hielo y agua, es la parte más crítica de este procedimiento.

El baño de hielo y agua se utiliza para evitar la evaporación del líquido por fluorocarbono. Durante este proceso, sonicar cada vial en el baño de hielo y agua utilizando la siguiente configuración: modo pulsado al 25 % de amplitud y un tiempo total de 60 segundos. Después de la sonicación, transferir la solución de PSNE a viales de centelleo de 20 mililitros con cinco mililitros de PBS en cada vial, obteniendo un volumen final de 10 mililitros por vial.

Monte el extrusor siguiendo las instrucciones del fabricante para cebarlo. Pipetee 10 mililitros de agua desionizada en el puerto superior de muestra. Tape la abertura y apriete la válvula de ventilación.

Abrir lentamente la línea de gas nitrógeno para aumentar la presión, forzando la muestra a través de las membranas. Recoger la muestra del tubo de salida y extruir el PSNE 16 veces a través de un filtro de 100 nanómetros o 200 nanómetros para obtener una distribución estrecha de tamaños. Comenzar este procedimiento preparando un hidrogel de poliacrilamida que contenga PSNE.

Primero, prepare una solución al 24 % de albúmina sérica bovina o BSA disolviendo 2,4 gramos de polvo de BSA en 10 mililitros de agua desionizada. A continuación, prepare una solución al 10 % de persulfato de amonio o a PS diluyendo un gramo de polvo de a PS en 10 mililitros de agua desionizada. Mezcle estos reactivos en un molde de plástico en el siguiente orden: 2,1 mililitros de solución de acrilamida, 1,2 mililitros de tampón tris, 0,1 mililitros de a PS al 10 %, 4,5 mililitros de solución de BSA al 24 % y 3,6 mililitros de agua desionizada. Caliente la solución a 40 grados Celsius en un baño de agua y luego coloque bajo vacío durante una hora para desgasificar el líquido.

Esto es necesario para evitar la formación de burbujas no deseadas dentro del hidrogel después de una hora. Retirar del vacío, añadir 480 microlitros de suspensión de PSNE y mezclar completamente mediante un suave movimiento giratorio de la cámara de plástico. En una campana extractora de gases, añadir 12 microlitros de tetraetilendiamina o T-E-M-E-D para polimerizar la acrilamida y colocar la cámara en un baño de agua a 12 grados Celsius durante dos horas.

La polimerización es exotérmica, por lo que se necesita un baño frío para evitar la vaporización de PSE durante la polimerización. Una vez que la acrilamida ha polimerizado, coloque un transductor de potencia enfocado y una sonda de imagen en un tanque de acrílico lleno con agua desionizada DGA de modo que el plano de imagen se superponga con el volumen focal del transductor. A continuación, coloque el hidrogel de poliacrilamida cargado con PSNE en el foco del transductor de potencia, vaporice el PSNE dentro del hidrogel con pulsos acústicos cortos, seguido de una exposición de onda continua de 15 segundos para la ablación potenciada por burbujas.

Al desnaturalizarse la BSA, el hidrogel se vuelve opaco debido a la absorción de ultrasonido y a la generación de calor dentro de la monitorización de la vaporización y la formación de burbujas con un escáner ultrasónico diagnóstico. En esta imagen de ejemplo, la flecha indica la región focal donde una nube de burbujas fue formada por la vaporización de PSNE. Repita la exposición acústica en una nueva ubicación dentro del hidrogel sin elevar el PSNE y compare el tiempo y volumen de ablación.

Este protocolo produce gotas de fluorocarbono recubiertas de lípidos con una distribución de tamaño estrecha. Aquí se muestra la distribución de tamaño medida mediante dispersión dinámica de luz para PSNE extruidas utilizando filtros de 100 y 200 nanómetros. Las unidades de los ejes de ordenadas se basan en la intensidad de la luz dispersada por partículas de un tamaño determinado en relación con la intensidad total de luz dispersada por la muestra.

Cuando se mide el diámetro medio y la desviación estándar de las PSNE a uno y siete días después de la extrusión con filtros de 100 y 200 nanómetros mediante dispersión dinámica de la luz, los resultados demuestran que las PSNE son estables durante al menos una semana. Esta figura muestra imágenes en modo B de las PSNE antes y después de la vaporización. En un hidrogel de poliacrilamida, la flecha indica la región focal donde se formó una nube de burbujas por la vaporización de las PSNE.

Estas son imágenes de un hidrogel de poliacrilamida que contiene albúmina y PSNE antes y después de la vaporización y sonicación con ultrasonido focalizado de alta intensidad o Hy Fu. Una lesión se forma tras 15 segundos de calentamiento mediado por Hy Fu. La forma asimétrica de la lesión es resultado del calentamiento pre focal que ocurre debido a la presencia de la nube de burbujas en la trayectoria del ultrasonido. El calentamiento pre focal y la formación de lesiones debido a la dispersión provocada por las burbujas pueden minimizarse reduciendo la potencia acústica transmitida tras su desarrollo.

Este método para producir nanoemulsiones estables de cambio de fase allanará el camino para que los investigadores en el campo de la terapia mediada por ultrasonido exploren la ablación por HIFU potenciada por burbujas en tumores sólidos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo producir nanoemulsiones estables de cambio de fase con distribuciones de tamaño estrechas, y de cómo estudiar la nucleación de burbujas y la ablación mediada por ultrasonido potenciada.