Grabación simultánea intracelular de una motoneurona lumbar y la Fuerza producida por su unidad motora en el ratón adulto En vivo

El objetivo general de este procedimiento es estudiar las propiedades electrofisiológicas y contractiles de una unidad motora individual de ratón mediante grabaciones intracelulares de neuronas motoras in vivo. Esto se logra primero exponiendo la médula espinal y el músculo de interés. Luego, se conecta un transductor de fuerza al tendón del músculo.

A continuación, se estimula la neurona motora con un electrodo intracelular, provocando así la contracción de la unidad motora registrada. En última instancia, se pueden caracterizar simultáneamente las propiedades electrofisiológicas de la neurona motora y las propiedades contráctiles de su unidad motora. La demostración visual de esta técnica es fundamental porque los pasos de microcirugía son muy difíciles de aprender debido al pequeño tamaño del animal.

Para comenzar el procedimiento, anestesie un ratón mediante la inyección de pentobarbital sódico o una mezcla de ketamina y xilacina por vía intraperitoneal. Asegúrese de que el ratón no presente reflejo de compresión del dedo del pie. A continuación, realice un corte sobre la tráquea utilizando un par de tijeras romas y separe la piel hacia ambos lados.

Luego, separe la glándula salival con un par de pinzas romas. Para exponer los dos músculos delgados que cubren la tráquea, separe los dos músculos para revelar la tráquea. Utilizando un par de pinzas Dumont siete.

Deslice dos hilos de sutura de seda aut de cuatro bajo la tráquea. Luego realice un corte transversal en la tráquea entre dos anillos cartilaginosos. Pero tenga cuidado de no seccionar completamente la tráquea.

Ahora, inserte el tubo traqueal hacia abajo por la tráquea. Sujete ambos lados de la abertura de inserción atando los puntos sobre ella. A continuación, conecte el tubo traqueal a un ventilador para ratones y a un capnógrafo.

A continuación, conecte el ventilador al oxígeno puro a través de una bolsa de cumplimiento. Ajuste los parámetros del ventilador de modo que el ratón no luche contra la ventilación artificial y que la presión parcial de dióxido de carbono al final de la marea se mantenga estable entre el 4 y el 5%. En este paso, exponga la vena yugular en un lado del cuello utilizando técnicas de disección roma.

La vena yugular se divide en dos troncos principales, las venas faciales anterior y posterior. Separe cuidadosamente la vena de su tejido conectivo circundante. Luego deslice dos hilos de sutura de seda aut número seis bajo la vena, y sepárelos lo más posible a lo largo de la longitud de la vena.

A continuación, coloque una pinza para vaso pequeño en el lado proximal de la vena y ligue el lado distal de la vena. Utilizando unas tijeras de iris muy finas, realice una pequeña incisión transversal en la vena. Tenga mucho cuidado de no seccionar completamente la vena.

A continuación, inserte un catéter prefijado de un French en la abertura hasta el clip vascular que sujeta la vena y el catéter juntos. Retire cuidadosamente el clip vascular. Luego, empuje el catéter unos milímetros más dentro de la vena. Fije el catéter atándolo con suturas en ambos lados de la inserción.

A continuación, conecte uno de los catéteres a una jeringa o a una bomba de jeringa para inyectar dosis suplementarias de anestésicos como pentobarbital, sodio o ketamina-xilacina. Repita el procedimiento en otra vena y conecte el otro catéter a una bomba de jeringa para una infusión intravenosa lenta de una solución de glucosa al 4 % que contiene bicarbonato de sodio al 1 % y plasmon al 14 %. Al final, cierre la piel del cuello con aguja e hilo de sutura.

A continuación, regrese al ratón a posición prona. Ahora realice una incisión desde la parte superior del muslo hasta el tendón de Aquiles. Separe la piel de los músculos subyacentes y tenga cuidado de no dañar los vasos sanguíneos.

A continuación, identifique el borde anterior del bíceps femoral, que aparece como una línea blanca que recorre el muslo hacia abajo. Luego, abra cuidadosamente a lo largo de la línea desde la rodilla hasta el hueso de la cadera. Separe los músculos para exponer el nervio ciático debajo del bíceps femoral.

Disecar cuidadosamente el bíceps femoral y retirarlo. Para exponer el nervio ciático y los músculos tríceps surales, identificar el nervio tibial situado entre los nervios peroneo común y sural. Entre las diferentes ramas del nervio tibial, distinguir las ramas que inervan el tríceps sural de aquellas que penetran más profundamente.

Utilizando hilo de seda OTT número ocho, ate todas las ramas del nervio tibial juntas, manteniendo intactas las ramas que inervan el tríceps sural. Corte el nervio tibial lo más lejos posible del nudo. Identifique las vértebras T13 y L1, siendo T13 la última vértebra a la que están unidas las costillas.

Luego inmovilice la columna vertebral con los fijadores vertebrales para médula espinal de Cunningham a cada lado de T13 y L1. Tenga cuidado de no comprimir la médula espinal, sino de aplicar una ligera tensión sobre el eje longitudinal. Asegúrese de que la columna vertebral esté bien fijada presionándola suavemente hacia abajo con pinzas.

Utilizando los bisturíes finos, elimine los procesos espinales y luego la lámina sobre T13 y L1 para exponer la médula espinal. A continuación, coloque un baño de plástico personalizado alrededor de la médula espinal. Después de eso, asegure el baño en su lugar utilizando un hilo de seda número 4.

Por último, asegúrese de que el baño sea impermeable sellándolo con sellador de fraguado rápido. Una vez que el material de fraguado rápido haya secado, retire el algodón que cubre la médula espinal y llene el baño con aceite mineral. Utilice otro clamp vertebral para fijar un proceso espinoso de la región sacra.

Para sostener la región dorsal del animal, utilice una tercera pinza para inmovilizar la extremidad trasera derecha y el tobillo flexionado en un ángulo de 90 grados en la rodilla, con la extremidad doblada en 90 grados en la rodilla y en el tobillo. Retire la gasa que cubre el área de la extremidad trasera. Diseque el tendón de Aquiles del tejido circundante.

Corte el tríceps de los tejidos circundantes tanto como sea posible utilizando una aguja encerada. Pase una sutura de seda número seis a través del tendón de Aquiles y haga un nudo triple alrededor del tendón. Luego coloque el transductor de fuerza cerca del nudo.

A continuación, sujete el tendón al transductor de fuerza utilizando el hilo de seda y corte la parte distal del tendón. Luego, inserte dos alambres de acero inoxidable debajo de la fascia de los músculos tríceps surales. Estos alambres están conectados a un amplificador extracelular de corriente alterna.

Para la grabación de EMG, coloque el nervio sural del tríceps sobre el cátodo de un electrodo en gancho con el ánodo tocando un músculo cercano. Luego, estimule el nervio sural del tríceps mediante un pulso cuadrado de 50 microsegundos de intensidad creciente a baja frecuencia hasta observar la amplitud máxima del espasmo muscular. A continuación, estimule el nervio sural del tríceps mediante un pulso cuadrado de 50 microsegundos de intensidad creciente a baja frecuencia hasta observar la amplitud máxima del espasmo muscular.

Estas figuras muestran cómo identificar una motoneurona del grupo sural del tríceps. Tras la penetración con baja intensidad de estimulación, solo se puede observar un EPSP monosináptico a mayor intensidad. El EPSP podría ser lo suficientemente grande como para desencadenar un potencial de acción ortodrómico a una intensidad de estimulación aún mayor, y de tipo todo o nada.

El potencial de acción antidrómico aparece con una latencia más corta que el EPSP monosináptico. Si se inyecta suficiente corriente a través del microelectrodo para desencadenar un potencial de acción, se puede registrar una actividad EMG en el músculo tras un breve retraso, seguida de una contracción muscular.

Después de la identificación de la neurona motora, se pueden caracterizar sus propiedades electrofisiológicas. Por ejemplo, esta figura ilustra cómo se puede medir la resistencia de entrada utilizando pulsos de corriente hiperpolarizantes y despolarizantes y representando gráficamente las variaciones del potencial de membrana frente a la cantidad de corriente inyectada. Las propiedades contráctiles de la unidad motora también se pueden estudiar mediante diversos protocolos de estimulación.

Por ejemplo, la relación entre la frecuencia y la fuerza puede obtenerse inyectando pulsos breves de corriente a diversas frecuencias en la neurona motora. Luego, la fuerza en estado estacionario puede graficarse frente a la frecuencia de los pulsos de corriente para revelar una curva sigmoidea de frecuencia-fuerza. Una vez dominada la cirugía, parte de esta técnica puede realizarse en tres horas si se hace correctamente.