Name: La transmisión de los virus de plantas usando moscas blancas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-08T08:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Aprende a transmitir virus de plantas usando Bemisia tabaci mediante el establecimiento de colonias controladas. Este método optimiza condiciones ambientales para lograr tasas de transmisión cercanas al 100% en estudios de virología vegetal.

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1. Mantenimiento Colony Mosca Blanca <ol><li> Condiciones ambientales: colonias de mosca blanca se deben mantener en una cámara de crecimiento controlada. El control de la humedad relativa, la temperatura, fotoperiodo y la intensidad de luz son esenciales para el crecimiento de las colonias óptima (Figura 1). Una temperatura de 28 ° C, 30-50% de humedad relativa, y un fotoperiodo de 14 horas dará lugar a una colonia que se desarrolla desde el huevo hasta la emergencia del adulto en 18 días (este tiempo varía con la planta huésped). La humedad relativa debe mantenerse por debajo de 70% para desalentar el crecimiento de insectos y hongos patógenos de plantas. Las tasas de fertilización y riego debe reducirse para desalentar los hongos patógenos y la acumulación de sal. La intensidad de la luz de la colonia debe ser bastante alta. Bombillas fluorescentes VHO utilizados en número suficiente para generar aproximadamente 800-1.000 velas ft a la altura del dosel son adecuados para la mayoría de las plantas (es decir. Algodón, haba común, frijol lima, tomate). La limpieza es esencial enuna colonia de mosca blanca para mantener las condiciones óptimas de crianza. </li><li> Jaulas Colony: Las moscas blancas se deben mantener las plantas en cajas, en vez de gratis en la habitación crecimiento. Las jaulas se pueden construir de diversos materiales, pero deben permitir: la ventilación, la facilidad de acceso, la capacidad de impedir la fuga o infiltración de mosca blanca, y de un tamaño suficiente para mantener suficientes plantas para generar la población de mosca blanca es necesario. Buenos resultados se han obtenido con organza más proyección de aluminio (por la fuerza), así como la detección de mosca blanca a prueba (véase la tabla de equipos e insumos específicos). </li><li> Colony Preparación de la planta: Las especies de plantas seleccionadas es una consideración importante cuando se inicia una colonia de mosca blanca. La planta debe ser capaz de soportar una alta población de insectos sin colapsar. La planta elegida para una colonia nonviruliferous debe ser un no huésped para el virus o virus que están destinados a ser transmitida para evitar la contaminación en la colonia y si el mantenimiento de un virulicolonia ferous, debe ser portador del virus. Las plantas deben crecer con bastante rapidez para apoyar aparición de nuevos adultos dentro de los 18 días de haber sido introducido a la colonia, pero no tan rápidamente como para superar las jaulas dentro de cuatro semanas. Enano, arbusto, o variedades de plantas de tipo patio se recomiendan ya que a menudo producen un área foliar similar a los cultivares más altos, pero sin el alargamiento del tallo. </li><li> Es muy importante para las plantas traseras para la colonia en invernaderos en jaulas que excluyen la mosca blanca y otros insectos. El uso de las plantas que están infestadas con la mosca blanca, trips, ácaros o antes de entrar en la colonia puede causar la colonia se colapse. Las plantas infestadas también tienen el potencial de ser infectado con virus transmitidas por insectos que puedan interferir con los estudios de transmisión de virus. </li></ol> 2. Establecimiento Colonia Mosca Blanca <ol><li> Empezar una colonia por primera vez el uso de moscas blancas limpias - los libres del virus de plantas, otros insectos y patógenos de insectos. Estos pueden ser obtenidosde los colaboradores o de campo. Si el campo recolectada, moscas blancas deben ser criados durante al menos 8 semanas en las plantas hospedantes del virus de la planta, y comprobar la ausencia de síntomas de la planta para asegurarse de que están libres de virus de plantas. </li><li> Semana 1: Introducir la mosca blanca limpia a la primera jaula de plantas. Las moscas blancas pueden ser introducidos por aspiración de números conocidos o agitando suavemente las moscas blancas de otra planta de origen en función de las demandas de la colonia. En la semana 1, moscas blancas están poniendo huevos en el envés de la superficie foliar de la planta. Un tamaño de la población aproximada se puede predecir para cada aparición basado en el número de adultos utilizados para poner los huevos y el número promedio de huevos puestos por hembra en la mosca blanca de la planta huésped en cuestión. </li><li> Semana 2: Comenzar otra jaula con la introducción de la mosca blanca a las nuevas plantas hospederas para poner sus huevos. Las plantas en la jaula se inició en la semana 1 tendrán los huevos, y algunas moscas blancas inmaduras que cubren el envés de las hojas (Figura 2). Algunosmoscas blancas adultas introducidas durante 1 semana seguirán con vida. </li><li> Semana 3: Comenzar una tercera jaula mediante la introducción de la mosca blanca de nuevas plantas para poner sus huevos. Las plantas en la jaula se inició en la semana 1 se tienen muchas nuevas moscas blancas adultas emergentes inmaduros, así como y debe haber un aumento muy notable de la mosca blanca adulta de la población. Las plantas en la jaula se inició en la semana 2 tendrá muchos huevos y moscas blancas inmaduras que cubren la parte inferior de las hojas. </li><li> Semana 4: Comienza la cuarta caja mediante la introducción de la mosca blanca de nuevas plantas para poner sus huevos. Las plantas en la jaula se inició en la semana 1 tendrán muchas moscas blancas adultas que son aproximadamente una semana después de la emergencia. Las plantas en la jaula se inició en la semana 2 tendrá muchas nuevas moscas blancas adultas emergentes y debe haber un aumento muy notable de la población de mosca blanca. Las plantas en la jaula iniciadas durante la semana 3 tendrá muchos huevos y moscas blancas inmaduras que cubren la parte inferior de las hojas. </li><li> Semanal después de la primera 4 weeks: Cada semana, comienza una nueva jaula mediante la introducción de las moscas blancas adultas desde la cuarta caja más antigua (la jaula comenzó en la semana 1) en nuevas plantas en una nueva jaula limpia. La jaula de edad debe ser retirado y desechado sus plantas. Estas moscas blancas son de aproximadamente 1 semana de post-emergencia. En el caso de la colonia virulífero, estas moscas blancas se transmitir el virus a las nuevas plantas, así como ponen huevos para la próxima generación de moscas blancas. </li><li> Experimentos de transmisión va a utilizar la mosca blanca que surgirán en la jaula de la tercera semana. Si se necesitan más moscas blancas, el número de plantas se pueden aumentar las moscas blancas y más pueden ser añadidos a la semana 1 jaula para aumentar la población de mosca blanca. </li></ol> 3. Método para la inoculación de plantas de ensayo <ol><li> Para asegurar altas tasas de transmisión: 1) Las moscas blancas se deben manejar el mayor cuidado posible para evitar daños a los insectos que reducirá las tasas de transmisión, 2) Debe haber suficiente área foliar disponible para la mosca blanca de IETsu sonda o alimentación. Un aumento en el tiempo de adquisición o un aumento en el número de plantas hospedantes de adquisición puede aumentar las bajas tasas de infectividad en plantas de ensayo por la aglomeración, ya sea en la adquisición o el periodo de acceso de la inoculación. </li><li> Colección de moscas blancas. El siguiente es un procedimiento para la recogida y el movimiento de los números precisos de moscas blancas requeridos para fines experimentales. Para mover un gran número de moscas blancas, como se necesita para la detección de la resistencia, por ejemplo, sólo es necesario agitar suavemente las plantas infestadas de mosca blanca en las plantas de prueba o de adquisición de los anfitriones infectados por el virus (y más tarde las plantas de ensayo). Asegúrese de agitar las plantas durante muchos lugares para minimizar los efectos de agregación. </li><li> Recientemente surgieron moscas blancas adultas (1-3 días después del brote) son muy activos y se alimentan a menudo así tienden a dar a las velocidades de transmisión más altas 4. Moscas blancas mayores, pero todavía transmiten a una frecuencia más baja. Varias moscas blancas por planta de ensayo (15-40 por plant) se debe utilizar para altas tasas de transmisión desde una proporción de 1 mosca blanca por planta a menudo resulta en inaceptablemente bajas tasas de transmisión 3,4. El número necesario dependerá del virus de la especie y de la adquisición y plantas de ensayo. </li><li> Montar los dispositivos de aspiración y viales de colección. (Figura 3) </li><li> Con una mano, sostenga una tarjeta de plástico de color amarillo dentro de la jaula de la colonia que contiene las moscas blancas que se recojan. Golpear suavemente las plantas para estimular las moscas blancas adultas para volar. Las moscas blancas se sentirán atraídos por la tarjeta amarilla que volarán desde la planta hasta la tarjeta donde se pueden recoger con un aspirador y una respiración muy suave. Nunca aspirar moscas blancas que se alimentan en las plantas. Sus estiletes están incrustados en la planta mientras que la alimentación para tirar de ellos fuera de las plantas se romperán sus estiletes y haciéndolos incapaces ya sea adquirir o transmitir virus (Figura 4). </li><li> Recoge unas 20 moscas blancas adultas en un solo collección vial para minimizar el daño físico a los insectos de las aspiraciones repetidas (Figura 5). </li><li> Para cambiar el tubo de recolección, toque suavemente el vial sobre una superficie dura y tapa con Parafilm mientras que las moscas blancas están desorientados desde el tapping. </li><li> Ponga un nuevo vial cobrar el aspirador y repetir hasta que se recogen el número de moscas blancas necesarios. Las moscas blancas pueden permanecer en los viales de recolección a temperatura ambiente durante varias horas. </li><li> Adquisición. Moscas blancas se colocan en una planta infectada del virus y se les permite alimentarse de las plantas infectadas durante 48-72 h. Períodos de adquisición de más de 72 horas generalmente no aumentan las tasas de transmisión. Para los virus transmitidos de manera no persistente o semipersistente, 1 hora y varias horas, respectivamente, son suficientes periodos de acceso de adquisición (Tabla 1). Los mejores resultados se obtienen cuando las moscas blancas se les da acceso libre a las plantas en jaulas que encierran a los insectos a una sola planta o avarias plantas. Sin embargo, algunos experimentos requieren la adquisición de las hojas específicas en las que se pueden utilizar de casos jaulas de clip. Al utilizar jaulas de clip es importante dar cabida a la preferencia alimentaria mosca blanca de la parte inferior de las hojas. Además, el hacinamiento de la mosca blanca en jaulas de clip puede reducir las tasas de transmisión - tasas aceptables de transmisión se han cumplido con 10 moscas blancas femeninas por clip jaula de 2,5 cm de diámetro. </li><li> La inoculación. Preparar una jaula apropiada para el tamaño de la inoculación y colocar las plantas de ensayo en el interior. Si sólo una planta es para ser inoculados considerar una sola jaula planta. Si más de una planta se inoculó en cuenta un pequeño marco / organza bolsa de jaula de PVC o una jaula de aluminio (Figura 6). El tamaño de la jaula se utiliza para la inoculación debe ser ligeramente más grande es el tamaño de la planta (s) a ser inoculados. Velocidades de transmisión más altas se obtienen cuando la mosca blanca se mantienen cerca de la copa de la planta y no dan mucho espacio libre. </li><li> Colección de moscas blancas de anfitriones de adquisición depende de las necesidades del experimento. Si se necesitan pequeñas cantidades, aspirar moscas blancas como se describió anteriormente. Colocar los viales de recolección de moscas blancas dentro de la jaula cerca de las plantas y quitar la tapa (Figura 7). Abra el frasco y liberar las moscas blancas o invertir y golpear suavemente el vial para liberar las moscas blancas. Si se necesitan grandes cantidades basta con mover las plantas de adquisición con la mosca blanca en las jaulas donde están ubicadas las plantas de ensayo y agite suavemente las moscas blancas de la planta huésped adquisición. Para ambos tipos de presentación, asegúrese de distribuir las moscas blancas a través de las plantas para minimizar la agregación y asegurar una inoculación uniforme. </li><li> Permita que las moscas blancas para sondear o piensos con la cantidad adecuada de tiempo, una vez más dependiente del virus y, en cierta medida, la planta huésped (Tabla 1). </li><li> Compruebe las moscas blancas, al menos una vez durante el período de acceso inoculación para asegurar que las moscas blancas sonsondeo o alimentar al abrir la jaula y girando sobre unas hojas de cada planta. </li><li> Para los períodos de acceso inoculación largos, molestar a las plantas con cuidado (con una vara de bambú o equivalente) para repasar las puntas de las plantas y fomentar las moscas blancas para redistribuir en las plantas. La redistribución de la mosca blanca ayuda a asegurar una velocidad de transmisión superior al contrarrestar la tendencia natural de la mosca blanca a agregarse. </li><li> Terminación. El periodo de acceso inoculación se terminó matando las moscas blancas con productos químicos autorizados. Aplicar dos insecticidas, una tras otra: un insecticida de contacto para poner fin rápidamente moscas blancas adultas y un insecticida sistémico para cerrar todas las moscas blancas que se desarrollan en las siguientes semanas y las perdidas por el insecticida de contacto (Figura 8). Un insecticida de contacto, tales como el jabón insecticida e insecticidas sistémicos, tales como imidacloprid o pimetrozina se han utilizado con buenos resultados. </li></ol>

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No hay conflictos de interés declarado.

Los métodos descritos aquí se han desarrollado durante un período de dos décadas y se basan en la información básica proporcionada por muchos estudios de transmisión de la mosca blanca, el comportamiento y la biología. Puesto que hay muchas publicaciones, este manuscrito se refiere principalmente a las revisiones y para algunas publicaciones específicas seleccionadas para ilustrar el tipo de datos que se utilizan para desarrollar esta técnica. Es muy importante en este procedimiento que las moscas blancas se manejan con cuidado ya que la rotura de las piernas y antenas puede conducir a comportamientos anormales y menores tasas de transmisión. Colección con aspiradoras y otros dispositivos mecánicos de aspiración nunca ha dado buenos resultados. Otra consideración para el éxito es que el número de moscas blancas utilizados para obtener 100% de transmisión a las plantas de prueba, se debe determinar para cada combinación de huésped de la planta y el virus. Esta relación óptima sólo necesita ser establecida una vez. Los mejores resultados se han obtenido utilizando las moscas blancas adultas jóvenes (1-3 días surgimiento pasado) ya que g másive las mayores tasas de transmisión. Los adultos mayores pueden ser utilizados, pero se necesitará un mayor número de moscas blancas para compensar las tasas reducidas de transmisión. Las hembras son conocidos por transmitir a velocidades más altas que los hombres, ya que se alimentan con más frecuencia que los hombres. Sin embargo, por lo general no vale la pena el tiempo para separar los sexos para la transmisión. Este procedimiento se puede modificar de muchas maneras para adaptarse a los recursos y las necesidades del investigador. Cuando se trabaja con múltiples virus que lo mejor es mantener una colonia de moscas blancas criadas en plantas hospedantes del virus. Estas moscas blancas se pueden recoger coloca en plantas infectadas por virus para la adquisición y a continuación, después de la adquisición de las moscas blancas se pueden mover de nuevo a las plantas de ensayo. Vegetales destinados a la colonia deben ser cultivadas en invernaderos en jaulas para impedir la introducción de las moscas blancas que podrían infectar con otro virus. La infestación de estas plantas con ácaros, trips y otras plagas de las plantas puede comprometer la halud de la colonia y causar su colapso. Finalmente el riego de las plantas de colonias que hay que hacer con cuidado. Estas plantas están sometidas a un estrés extremo por la alimentación de tantas moscas blancas y las condiciones de luz normales inferiores. Root descomposición hongos que se introducen en la turba en las mezclas sin suelo puede convertirse en un problema si las plantas se overwatered ni una sola vez. El tratamiento previo de las plantas con un fungicida empapar puede eliminar algunos de los problemas. Si bien la transmisión de los virus de la mosca blanca de la planta puede llevar mucho tiempo y requerir recursos valiosos (como salas de crecimiento) es esencial para la transmisión de algunos virus para los que no tenemos otro medio de transmisión. También es un medio valioso para la selección de plantas para la resistencia a los virus, ya que utiliza el mismo tipo de transmisión que se espera que las plantas en el campo de resistir. El uso de los medios más artificiales de transmisión no siempre producen los mejores resultados en las evaluaciones de germoplasma de virus-resistencia.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Nombre del artículo&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Empresa&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Número de catálogo&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comentarios (opcional)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Rejilla protectora contra mosca blanca</td><td>Klayman Meteor Ltd. Petah Tikva 49130, Israel</td><td>---</td><td>Pantalla de malla BioNet 50, pantalla insecticida antiviral</td></tr><tr><td>Rejilla protectora contra mosca blanca</td><td>Hummert International (www.hummert.com)</td><td>27-4050-1 - 27-4062-1</td><td>Pantalla de malla BioNet 50, pantalla insecticida antiviral</td></tr><tr><td>Dispositivos de recolección de mosca blanca</td><td>BioQuip</td><td>1135A</td><td>También se pueden fabricar usando cuentagotas, tubos plásticos flexibles, adaptadores plásticos para vacío y gasa</td></tr><tr><td>Viales de recolección</td><td>BioQuip</td><td>8909</td><td>Los viales utilizados dependen del aspirador que se emplee.</td></tr><tr><td>Tarjetas plásticas amarillas</td><td>cualquier empresa</td><td>---</td><td>Cualquier tarjeta plástica amarilla brillante sirve; se pueden adquirir en muchos lugares.</td></tr><tr><td>Jaulas para mosca blanca</td><td>---</td><td>---</td><td>Estas jaulas no están disponibles comercialmente y deben construirse. Las jaulas de 60 cm x 60 cm x 60 cm funcionan bien para nosotros. Preferimos las construidas con malla de aluminio para ventanas, organdí de nailon, plástico vinílico, y una estructura hecha con marcos de aluminio para ventanas. Las puertas se fijan con bisagras de piano y se sellan con burletes; la parte superior de las jaulas es de plástico vinílico. Las jaulas también pueden fabricarse con: 1) placas de plexiglás pegadas en los bordes, con ventilación proporcionada por aberturas con malla en los laterales; 2) bolsas grandes de organdí de nailon, organza o malla 50 para mosca blanca, con soportes internos hechos de tuberías y accesorios de PVC cortados a la longitud deseada y ensamblados dentro de las bolsas; 3) estructuras de madera con organdí de nailon, organza o malla 50 para mosca blanca.</td></tr></tbody></table>

la transmisión de los virus de plantas usando moscas blancas

Transmitting Plant Viruses Using Whiteflies

Las moscas blancas, Hemiptera: Aleyrodidae, Bemisia tabaci, un complejo de especies morfológicamente indistinquishable 5, son vectores de muchos virus de plantas. Varios géneros de estos virus vegetales transmitidos por moscas blancas (Begomovirus, Carlavirus, Crinivirus, Ipomovirus, torrado) incluyen varios cientos de especies de patógenos emergentes y económicamente importantes de alimento importante y los cultivos de fibra (revisado por 9,10,16). Estos virus no se multiplican en su vector, pero sin embargo se mueven fácilmente a partir de una planta a otra por la mosca blanca adulta por diversos medios (revisado por 2,6,7,9,10,11,17). Para la mayoría de estos virus alimentación mosca blanca se requiere para la adquisición e inoculación, mientras que para otros se requiere sólo de sondeo. Muchos de estos virus no pueden o no pueden ser fácilmente transmitidos por otros medios. Por lo tanto, el mantenimiento de cultivos de virus, biológicos y caracterización molecular (identificación de rango de hospedantes y síntomas) 3,13, Ecología 2,12, requiere que los virus se transmiten a los hosts experimentales utilizando el vector de mosca blanca. Además del desarrollo de nuevos métodos de gestión, tales como la evaluación de nuevas sustancias químicas o compuestos 14 15, nuevos enfoques culturales 1,4,19, o la selección y el desarrollo de cultivares resistentes 7,8,18, requiere el uso de la mosca blanca de la transmisión del virus. El uso de la transmisión de la mosca blanca de los virus de las plantas de selección y desarrollo de cultivares resistentes en los programas de mejoramiento es particularmente desafiante 7. Selección eficaz y la detección de la resistencia emplea un gran número de plantas y hay una necesidad para el 100% de las plantas para ser inoculados con el fin de encontrar los pocos genotipos que poseen genes de resistencia. Estos estudios utilizan un gran número de moscas blancas virulíferos, a menudo varias veces por año. Mantenimiento Mosca Blanca descrito aquí puede generar cientos o milesde moscas blancas adultas de las plantas a la semana, durante todo el año, sin la contaminación de otros virus de plantas. Las plantas libres de las dos moscas blancas y virus deben ser producidos a introducir en la colonia de mosca blanca cada semana. Mosca Blanca culturas deben mantenerse libres de patógenos, parásitos, moscas blancas y parasitoides que pueden reducir las poblaciones de mosca blanca y / o reducir la eficiencia de la transmisión del virus. Las colonias producidas en la forma descrita se puede escalar rápidamente para aumentar o disminuir las cifras de población, según sea necesario, y se pueden ajustar para adaptarse a las preferencias de alimentación de la base de mosca blanca en la planta huésped del virus. Hay dos tipos básicos de colonias de mosca blanca que se pueden mantener: un nonviruliferous y una colonia virulífero mosca blanca. La colonia nonviruliferous se compone de moscas blancas criadas en las plantas libres de virus y permite la disponibilidad semanal de moscas blancas que pueden ser utilizados para transmitir los virus a partir de diferentes cultivos. La colonia viruliferous mosca blanca,compuesto de moscas blancas criadas en plantas infectadas por virus, permite disponibilidad semanal de moscas blancas que han adquirido el virus omitiendo por lo tanto un paso en el proceso de transmisión del virus.

Estos métodos para el establecimiento de colonias de mosca blanca y el mantenimiento, así como la manipulación de transmitir los virus de plantas se han utilizado con éxito en una serie de estudios 4,11,12,14, así como otros muchos no citados. El uso de estos métodos con los virus transmitidos persistentemente, hemos obtenido rutinariamente las tasas deseadas de transmisión de 100% para la selección para la resistencia, el cribado insecticidas por su capacidad para interferir con la transmisión (y evaluación de compuestos que inducen resistencia) 13,14,17,18 ( la Figura 9). Los procedimientos descritos aquí pueden ser y han sido adaptados a muchos lugares en los centros públicos y privados de investigación. <table border="1"><tbody><tr><td> Tipo de Cambio </td><td> Período de acceso Adquisición (horas) </td><td> Período de acceso inoculación (horas) </td><td> Ref.. </td></tr><tr><td> No persistente </td><td> 1 </td&gt; <td> 2-24 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Semipersistentes </td><td> 6-24 </td><td> 8-24 </td><td> 10, 16 </td></tr><tr><td> Persistente </td><td> 48-72 </td><td> 48-72 </td><td> 3, 6, 8, 9 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Tiempos estimados que se pueden utilizar para producir altas tasas de transmisión de virus con diferentes tipos de relaciones con sus vector especies Bemisia tabaci complejos. Duración estimada se basa en tiempos mínimos públicos que se exigen para la transmisión de 80-100% y modificado en algunos casos para tener en cuenta los períodos de latencia y las diferencias entre poblaciones de mosca blanca, virus, y las plantas anfitrionas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig1.jpg" /> Figura 1. Un ejemplo de una colonia virulífero mosca blanca. Esta cámara de crecimiento contiene jaulas de plantas infectadas con un begomovirus y INFEsted con moscas blancas virulíferos. <img alt="La figura 2" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig2.jpg" /> Figura 2. Izquierda: inmaduros etapas de la mosca blanca, Bemisia tabaci MEAM clado sensu De Barro 6 aproximadamente 1 semana después de la aparición y la derecha: un adulto de mosca blanca, un vector eficaz de muchos virus de plantas. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4332/4332fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig3.jpg" /> Figura 3. Tipos de dispositivos de recogida que pueden ser utilizados para recoger las moscas blancas para la transmisión de virus de plantas. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig4.jpg" /> La Figura 4. Izquierda: Tarjeta de plástico amarillo utilizado para recoger los adultos de mosca blanca que muestran moscas blancas listas para la recolección<html> . Derecha: Recogida de la mosca blanca de una tarjeta de plástico amarillo. Las moscas blancas se pueden ver en la tarjeta como pequeñas manchas blancas / gris. <img alt="La figura 5" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig5.jpg" /> Figura 5. Las moscas blancas recogieron por aspiración (20 en un vial) de la colonia listo, ya sea para la adquisición o la inoculación. <img alt="La figura 6" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4332/4332fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig6.jpg" /> La Figura 6. Superior izquierda:. Jaulas de plantas individuales utilizados, ya sea para la adquisición o inoculación superior derecha: jaulas más grandes hechas de tubos de pvc y organza. Inferior: Aluminio / pantalla y jaulas organdí en algunas plantas que contienen gases destinados a una colonia de mosca blanca. 32fig7.jpg &quot;/&gt; Figura 7. Las moscas blancas siendo transferidos a una sola planta para la inoculación (o adquisición). <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig8.jpg" /> Figura 8. La adición de un insecticida sistémico drench al terminar el período de acceso inoculación mosca blanca. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig9.jpg" /> La Figura 9. Coloque las plantas en evaluación para la resistencia al virus del rizado amarillo del tomate. Todas las plantas fueron inoculadas en un 5 semanas de edad, las plantas de semillero y luego trasplantadas al campo para su evaluación. Las plantas en el primer plano son una línea de germoplasma resistente, las plantas en el fondo son la línea de germoplasma susceptible.

Mejorar nuestra comprensión y nuestra capacidad para gestionar muchos de los virus de las plantas transmitidas por insectos requiere el uso del vector. La transmisión por insectos de los virus de plantas es una interacción tritrófica, y como tal, requiere la manipulación de los insectos, virus, y de plantas. Vectores deberán ser criados en grandes números y manipulados de tal manera como para asegurar altas tasas de transmisión a las plantas de prueba. Los fundamentos de la cría y la manipulación de la mosca blanca,<em&gt; Bemisa tabaci</em&gt; (<em&gt; Hemiptera: Aleyrodidae</em&gt;), Se presenta un vector de virus de plantas pertenecientes a varios géneros emergentes virus de planta, lo que representa un gran número de virus económicamente importantes.

La transmisión de los virus de plantas usando moscas blancas

Las moscas blancas, Hemiptera: Aleyrodidae, Bemisia tabaci, un complejo de especies morfológicamente indistinguibles5, son vectores de muchos virus vegetales. Diversos...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en transmitir virus vegetales utilizando moscas blancas. Esto se logra estableciendo y manteniendo una colonia de moscas blancas que proporciona semanalmente moscas adultas recién emergidas, libres de contaminación por otros vectores y patógenos potenciales. Las colonias se mantienen agregando regularmente moscas blancas a plantas jóvenes libres de insectos, a partir de las cuales se producen nuevos adultos.Después de 17 a 20 días cada semana, los adultos recién emergidos pueden transferirse a plantas de prueba para adquirir o transmitir el virus. Típicamente se obtienen eficiencias de casi 100 %, y las tasas de transmisión generalmente comenzarán bajas y aumentarán con una optimización sistemática. El aspecto más difícil de utilizar moscas blancas para inocular virus es criarlas de manera que se excluyan patógenos e insectos no deseados.Los patógenos, especialmente los hongos que causan pudrición de raíces y las manchas foliares, reducirán la calidad de las plantas hospederas del virus. Insectos no deseados, como los trips, pueden suprimir la reproducción de mosca blanca así como comprometer la calidad de la planta hospedera del virus. Las procedimientos serán demostrados por Heather Capa Bianco, una técnica de mi laboratorio.Las colonias de mosca blanca deben mantenerse en un cuarto de crecimiento limpio y controlado. El control de la humedad relativa, la temperatura, el período fotoperiódico y la intensidad luminosa son esenciales para una colonia que se desarrolla desde el huevo hasta el adulto en 18 días; utilice la siguiente configuración. La temperatura debe establecerse entre 26 y 30 grados Celsius, y la humedad relativa debería estar idealmente entre el 30 y el 50 %. Si la humedad relativa supera el 70 %, es probable que los patógenos fúngicos de los insectos y las plantas se conviertan en un problema.El período de luz ideal es de 14 horas. La intensidad lumínica debe ser bastante alta, y las bombillas fluorescentes VHO pueden producir de 800 a 1000 pies-candelas en el dosel de la planta. Las dosis de fertilizante y el riego también deben reducirse para desalentar la presencia de patógenos fúngicos, así como la acumulación de sales. Las jaulas para mosquitas blancas deben permitir la ventilación, un fácil acceso y un espacio suficiente para una población creciente de mosquitas blancas.Se han obtenido buenos resultados con organza orgánica más malla de aluminio, así como con malla blanca resistente. La identificación de la especie de planta es una consideración importante. En primer lugar, debe crecer rápidamente, sin embargo no debe sobrepasar la cámara. En segundo lugar, la planta debe ser lo suficientemente resistente como para sostener una alta población de insectos sin colapsar.Por estas razones, los cultivares enanos o arbustivos son buenas opciones de plantas. En tercer lugar, la planta debe ser capaz de albergar o incapaz de albergar el virus que se esté utilizando, dependiendo del tipo de colonia que se esté criando. Debido a que la colonia puede colapsar debido a ácaros, THPs, moscas blancas silvestres u otros insectos invasores, los cultivares elegidos deben cultivarse en un ambiente protegido para excluir a otros insectos.Las primeras moscas blancas de una nueva colonia deben estar libres de virus vegetales, otros insectos y patógenos de insectos. Si se recolectan moscas blancas del campo, críelas durante al menos ocho semanas en plantas que no sean hospederas del virus durante este periodo, y verifique la ausencia de síntomas en las plantas. Una vez obtenidas moscas blancas limpias, introduzca entre 20 y 100 en una jaula con plantas mediante aspiración o sacudiéndolas suavemente desde otra planta fuente.Cada semana es necesario establecer una nueva jaula. Durante las primeras tres semanas, utilice moscas blancas de plantas no ST para establecer la nueva jaula. A partir de la cuarta semana, use moscas blancas adultas jóvenes de la jaula de tres semanas de antigüedad para establecer la siguiente jaula.Durante la primera semana en una jaula, las moscas blancas pondrán huevos en la cara inferior de las superficies foliares de la planta. En la segunda semana, serán evidentes las formas inmaduras de mosca blanca y algunos adultos aún estarán vivos. En la tercera semana, habrán emergido muchas nuevas moscas blancas adultas, y debería observarse un aumento muy notable en la población de moscas blancas adultas.Estos mosquitos blancos pueden utilizarse para experimentos de transmisión. En la cuarta semana, los adultos de una semana de edad deben transferirse a una nueva jaula. La jaula antigua debe retirarse y sus plantas descartarse. Preciso.La transferencia suave de moscas blancas se realiza con un dispositivo de aspiración y viales de recolección; nunca aspire directamente. Las moscas blancas que se alimentan de plantas tienen sus estiletes insertados en la planta y se romperán si se separan bruscamente de ella, lo que hará que la mosca blanca sea inútil para su recolección. Para recolectar moscas blancas, sostenga un vial en una mano y, con la otra mano, mantenga una placa plástica amarilla dentro de la jaula de la colonia.Toque suavemente las plantas para estimular a las moscas blancas adultas a volar. Las moscas blancas serán atraídas hacia la tarjeta amarilla, donde pueden ser recolectadas. Utilizando el aspirador y una succión muy suave, agregue no más de 20 moscas blancas a cada vial de recolección.Luego, golpee el vial para desorientar a las moscas y tape el vial con parafina. Para asegurar una transmisión viral exitosa, pruebe con 15 a 40 adultos jóvenes de plantas infectadas con el virus en plantas sanas, dependiendo del virus y de la planta hospedadora. Otros protocolos, como la selección de resistencia, requieren poblaciones iniciales más grandes.En este caso, agite las plantas infectadas con el virus, que están infestadas con moscas blancas, sobre las plantas que deben ser inoculadas. Una vez que las moscas blancas se colocan sobre una planta infectada con el virus, déjelas alimentarse durante 48 a 72 horas para adquirir virus transmitidos de forma persistente. Un tiempo mayor generalmente no aumenta la tasa de transmisión para virus transmitidos de manera no persistente o persistentemente hábil.Un período de acceso de adquisición más corto, de una hora a un día, será suficiente para experimentos que requieran la adquisición de hojas específicas. Se pueden utilizar jaulas con pinzas; coloque la jaula de manera que la cara inferior de la hoja quede accesible, y no utilice más de 10 hembras de mosca blanca por jaula de 2,5 centímetros de diámetro, ya que la tasa de transmisión disminuirá debido al hacinamiento. Para la inoculación de plantas, seleccione la jaula adecuada considerando el número de plantas.Una planta, por ejemplo, necesita solo una jaula pequeña, ligeramente más grande que ella misma; para múltiples plantas, elija entre una jaula de tubo de PVC más pequeña, una jaula con armazón o una jaula más grande con marco de aluminio. Cuanto más pequeño sea el espacio alrededor del dosel de la planta, mejor. Una vez que se agregan las moscas blancas a la planta nueva, el tiempo necesario para la inoculación depende del virus y de la planta hospedadora.Al igual que en la adquisición, la cantidad de tiempo requerida para la transmisión depende del modo de transmisión. La transmisión no persistente requiere un tiempo de acceso mucho más corto que la transmisión semipersistente o persistente. Verifique que las moscas blancas estén sondando o alimentándose durante el período de acceso de inoculación.Abrir la jaula e inspeccionar la parte inferior de algunas hojas en cada planta. Para los períodos más largos de inoculación, agitar suavemente las plantas periódicamente para favorecer la redistribución de los organismos sobre las plantas.Esto aumentará la tasa de transmisión al contrarrestar la tendencia natural de las moscas blancas a agruparse, finalizando así el período de inoculación. Elimine las moscas blancas con dos insecticidas aplicados uno después del otro. Primero, aplique un insecticida de contacto para terminar rápidamente con las moscas blancas adultas, como el jabón insecticida.En segundo lugar, aplique un insecticida sistémico para eliminar cualquier mosca blanca que se desarrolle en las semanas siguientes. Cualquiera de los compuestos restantes, arid o pyrazine, son opciones efectivas. Mediante estos procedimientos, es posible obtener rutinariamente tasas de transmisión viral del 100 %. Dichas tasas elevadas de transmisión son esenciales al evaluar plantas de prueba para resistencia viral y resultan deseables al analizar la eficacia de compuestos químicos respecto a su capacidad para interferir con la transmisión del virus.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo criar moscas blancas y utilizarlas para transmitir virus vegetales. Estos procedimientos pueden emplearse con fines de investigación o para el desarrollo comercial de plantas resistentes a virus, o bien para probar compuestos por su capacidad de interferir con la transmisión del virus.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Los áfidos son transmisores eficaces de virus de plantas. Microinyección de áfidos del virus, el procedimiento que le mostrará hoy en día, es una técnica que permite a los investigadores a inyectar el virus directamente en el hemocele del pulgón, sin pasar por el intestino, una de las dos principales barreras para la transmisión de virus de forma circulatoria. La misma técnica también se utiliza para inyectar dsRNA de RNAi.

Prueba de las barreras fisiológicas a la transmisión del virus en los áfidos con microinyección

Se describe aquí un fluorescencia simple en la hibridación in situ (FISH) método para la localización de virus y bacterias en los tejidos de insectos y plantas. Este protocolo se puede ampliar para la visualización de mRNA en todo el montaje y secciones microscópicas.

Fluorescencia<em&gt; In situ</em&gt; Las hibridaciones (FISH) para la localización de los virus y las bacterias endosimbióticas en plantas e insectos tejidos

Aquí se presenta un protocolo para propagar células Homalodisca vitripennis y HoCV-1 in vitro. Se retiró el medio de HoCV-1 cultivos positivos y ARN extraído cada 24 h durante 168 horas. Supervivencia celular se cuantificó mediante tinción con azul de tripano. Partículas virales enteras fueron extraídos después de la infección. ARN extraído se cuantificó por QRT-PCR.

Propagación de<em&gt; Homalodisca coagulata virus-01</em&gt; A través de<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Cultivo Celular

Aquí, se presenta un protocolo para investigar la distribución host-tejido, el modo de transmisión, y el efecto sobre la aptitud de host de un densovirus dentro de una especie de lepidópteros, el gusano bellotero del algodón. Este protocolo también se puede utilizar para el estudio de la interacción entre otros virus transmitidos por vía oral y sus anfitriones de insectos.

Los protocolos para la investigación de la distribución original de los tejidos, modo de transmisión, y el efecto sobre la aptitud de un anfitrión Densovirus en el gusano de la cápsula del algodón

En este sentido, se presenta un protocolo para aislar endosimbiontes de la mosca blanca Bemisia tabaci a través de la disección y la filtración. Después de la amplificación, las muestras de ADN son adecuadas para la posterior secuenciación y estudio del mutualismo entre los endosimbiontes y la mosca blanca.

Métodos para la extracción de endosimbiontes de la mosca blanca<em&gt; Bemisia tabaci</em

Este papel divulga el protocolo para un ensayo de identificación rápida para Bemisia tabaci basado en tecnología de amplificación isotérmica mediada lazo (lámpara). El protocolo requiere laboratorio mínimo entrenamiento y puede, por tanto, aplicarse in situ en los puntos de entrada para las importaciones de planta como los puertos marítimos y aeropuertos.

Un ensayo de amplificación isotérmica (lámpara) mediada por el lazo para identificación rápida de Bemisia tabaci

Describimos un método de inmunofluorescencia y PCR cuantitativo para la localización y cuantificación de begomovirus en tejidos de insectos. El protocolo de inmunofluorescencia se puede utilizar para colocalizar proteínas virales y vectoriales. El protocolo cuantitativo de PCR puede ampliarse para cuantificar los virus en cuerpos enteros de moscas blancas y plantas infectadas por virus.

Localización y cuantificación de begomovirus en tejidos de mosca blanca por inmunofluorescencia y PCR cuantitativa

Se presenta un protocolo de inyección (agroinyección) a base de Agrobacterium para la inoculación del virus del mosaico de la cola de zorro y los clones del virus del mosaico de la caña de azúcar en las plántulas de maíz. La inoculación de esta manera conduce a la infección viral, el silenciamiento génico inducido por virus de los genes marcadores y la sobreexpresión viral de GFP.

Agroinoculación directa de plántulas de maíz por inyección con clones infecciosos recombinantes del virus del mosaico de la cola de zorro y virus del mosaico de la caña de azúcar

Este protocolo para el etiquetado inmunofluorescente de proteínas de virus vegetales y proteínas de insectos vectores en intestinos de insectos extirpados se puede utilizar para estudiar las interacciones entre virus e insectos vectores, las funciones de las proteínas de insectos y los mecanismos moleculares subyacentes a la transmisión del virus.

Etiquetado inmunofluorescente de virus vegetales y proteínas vectoras de insectos en intestinos hemípteros

Este protocolo demuestra cómo usar la planta huésped para detectar proteínas salivales de saltahojas y proteínas virales vegetales liberadas por vectores saltahojas.

Detección de virus y proteínas salivales de un vector saltahojas en el huésped vegetal

Describimos un método para recolectar hemolinfa cuantificable de manera eficiente de artrópodos pequeños para su posterior análisis.

Un método preciso y cuantificable para recolectar hemolinfa de artrópodos pequeños

Aprende a transmitir virus de plantas usando Bemisia tabaci mediante el establecimiento de colonias controladas. Este método optimiza condiciones ambientales para lograr tasas de transmisión cercanas al 100% en estudios de virología vegetal.

La transmisión de los virus de plantas usando moscas blancas

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