Generación rápida y eficiente de las neuronas a partir de células madre pluripotentes en un formato de placa Multititre

El objetivo general del siguiente experimento es diferenciar células madre pluripotentes humanas o PSC H en neuronas utilizando un formato de placa de títulos múltiples. Esto se logra mediante la recolección y el recubrimiento de una suspensión de una sola celda de H PSC en V bottom 96. Placas de pocillos para formar cuerpos embrionarios o EBS durante la noche.

A continuación, los EBS se transfieren a placas de fijación ultrabajas en forma de U que contienen medio de diferenciación para inducir la formación de neuroectodermo. Posteriormente, los EBS se colocan en placas recubiertas de matrigel para promover el crecimiento de las neuronas. Se pueden obtener resultados que muestran la presencia de marcadores neuronales típicos alrededor del octavo día por inmunofluorescencia.

Los protocolos para diferenciar células madre humanas prepotentes en neuronas suelen ser complicados y tediosos. Un poco accidentalmente. Nos encontramos con un procedimiento muy simple para hacer neuronas a partir de células madre humanas prepotentes.

Desde el punto de vista técnico, la principal ventaja de esta técnica de métodos existentes es que es fácil de realizar, rápida y rentable. Al mismo tiempo, presentará el procedimiento el Dr. MI Z del laboratorio. Prepare el medio de formación de EB y el medio de diferenciación como se describe en el protocolo escrito.

Cultive h PSC en condiciones libres de alimentador, como un medio acondicionado con metanfetamina en placas recubiertas de matrigel, o utilizando sistemas de cultivo químicamente definidos en condiciones de crecimiento activo subconfluentes. El uso de un microscopio estereoscópico con una punta de pipeta de plástico estéril elimina mecánicamente las colonias diferenciadas espontáneamente. Lave las colonias indiferenciadas restantes con PBS y use Accutane que contiene un inhibidor de rocas x para digerir a células individuales.

Granular las células individuales por centrifugación a 200 G durante dos minutos y suspender Resus en un pequeño volumen de medio de formación EB. Utilice un hemocitómetro para determinar el título de las células. Agregue celdas adicionales al medio de formación de EB restante para llegar a un título entre 40, 000 y 80, 000 celdas por mililitro.

Usando una pipeta multicanal, transfiera 100 microlitros por pocillo a una placa inferior de 96 V, lo que da como resultado de 4.000 a 8.000 células por pocillo. Pozo. Gire la placa en una centrífuga de placa abatible a 400 G durante un minuto para recoger todas las células en el fondo de los pocillos. Transfiera las células a una incubadora y permita que se forme EBS durante la noche del día siguiente bajo el microscopio estereoscópico.

Recoja EBS y transfiéralo en un pequeño volumen a un plato bacteriano de 3,5 centímetros que contenga dos mililitros de diferenciación. Medio. Lave las células girando suavemente el plato. Agregue 100 microlitros de medio de diferenciación a cada pocillo de un accesorio ultra bajo.

Placa inferior de 96 pocillos bajo un microscopio estereoscópico. Transfiera EBS en pequeños volúmenes desde el plato de lavado a los pocillos de 96 U. Incubar el EBS durante cuatro días para permitir la formación del neuroectodermo al cuarto día.

Lave las células en un medio de diferenciación y siembre una por una en los pocillos de una placa multitítulo recubierta de matrigel, como una placa de 12 pocillos. Las células deben estar distribuidas uniformemente dentro de los pocillos para permitir el crecimiento inalterado de las neuronas. Deje que el EBS se adhiera sin apretar a la matrigel durante aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente.

Luego, transfiera con cuidado la placa a la incubadora. Las neuronas crecerán a partir de la placa EBS de manera radial dentro de los próximos cuatro días. Anteriormente demostramos que, en línea con muchos otros, el EBS a partir de PSC H podría generarse simplemente mediante el rechapado, agregados tras la división rutinaria de HPC H en placas de baja fijación.

Esto suele dar lugar a una amplia distribución de tamaños de celda. Otro problema es que las EBS mantenidas en suspensión tienden a agregarse entre sí, lo que lleva a una heterogeneidad de tamaño aún mayor para eludir esta única H: las PSC se alegaron en pozos de baja fijación, lo que resultó en la no formación de EB y la muerte celular. Sin embargo, la combinación de la molécula de supervivencia celular, Y 2 7 6 3 2 con alcohol polivinílico, que se ha demostrado que mejora la formación de EB a partir de HSC, permitió que EBS se formara a partir de suspensiones de HESC de una sola célula durante la noche.

Convenientemente, los tamaños de EB en este formato de placa de títulos múltiples podrían controlarse estrictamente colocando diferentes números de celdas por pocillo. A diferencia del uso de técnicas convencionales, después de transferir EBS a placas de 96 U de fijación ultrabaja, se indujo la formación de neuroectodermo utilizando un pequeño cóctel de moléculas que consistía en inhibidores de F-G-F-E-R-K-T-G, TGF beta SMA dos y BP SMA uno, lo que permitió que las células se colocaran en matrigel para dar lugar a neuronas. El inicio de la formación de EB a partir de alrededor de 8.000 células produjo la mejor capacidad de diferenciación neuronal, que se caracteriza por excrecencias neuronales pronunciadas de las EB plateadas.

Reducción de los centros EB necróticos después de la colocación y alta expresión de marcadores sensoriales y panneuronales como B, rrn, tres A, y beta tres tubulina. Las eficiencias generales de la diferenciación neuronal parecen ser comparables al procedimiento original, que hasta ahora es aplicable tanto a las HSC como a las HI PSC. Se han probado con éxito tres líneas independientes de HPSC, HES y células HIPS en el procedimiento de pocillos múltiples, mientras que la variabilidad dependiente de la línea celular y las eficiencias de diferenciación generalmente no se pueden descartar.

Esta figura muestra células neuroectodérmicas disociadas de un solo día que se colocaron como células individuales y se diferenciaron con éxito con una eficiencia de aproximadamente el 60%. El manejo de EBS en la plataforma de múltiples tirantes requiere un poco de entrenamiento al principio, pero después de un tiempo, verá que es bastante fácil.