Name: El análisis genético rápido de epitelio-mesenquimal de señalización durante la regeneración del cabello (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Aprende a investigar las funciones tisulares de vías de señalización en la formación de folículos pilosos mediante aislamiento de células dérmicas y epidérmicas de ratones recién nacidos, modificación génica con lentivirus e injerto en ratones desnudos.

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Este trabajo fue apoyado por el NIH NRSA 1F32CA14208701 (SXA) y NIH subvenciones AR052785 AR046786 y (AEO y W. MW-).

1. Preparar 0 a 2 días de edad ratones recién nacidos para la disección de piel <ol><li> Eutanasia crías de ratón usando un CO 2 cámara durante al menos 20 min. Deja crías en el hielo hasta una hora hasta que la disección. P0-P2 ratones son muy recomendables como células preparadas a partir de los ratones más viejos han reducido la capacidad progenitor que se traduce en un menor rendimiento de injerto. Prepare un plato de etanol al 70% (para el paso 1,3) y tres platos de solución de lavado (para el paso 3) cuando esté listo para realizar la disección de la piel. Descongele Solución Dispasa y dejarlo a 4 ° C. Cervical dislocar las crías después del CO 2 sobre-exposición para garantizar la eutanasia. </li><li> Coloque cachorros sacrificados en una placa de cultivo en hielo y la transferencia a una campana de flujo estéril. </li><li> Lavar brevemente cachorros por inmersión en etanol al 70% y el lugar en placa de cultivo estéril. </li></ol> 2. Diseccionar la piel de ratón <ol><li> Cortar cada extremidad y la cola en la base del torso con tijeras estériles. </li><li> Sujete el cuerpo firmemente entre un par de cufórceps rved y crea una incisión a lo largo de la piel dorsal de la cabeza a la cola con un bisturí sin penetrar en la fascia subyacente. </li><li> Retire con cuidado la piel lejos de la línea media del ratón. </li><li> Agarre el ratón expuesto firmemente con el lado largo de las pinzas curvas e insertar otro par de pinzas curvas debajo de la piel en el extremo posterior del ratón y tire suavemente la piel en caderas hacia la media ventral del ratón. </li><li> Retire con cuidado la piel completamente del ratón con un movimiento suave y deseche la canal. </li></ol> 3. Lavar la piel con la solución e incubar Dispasa <ol><li> Colocar la piel en el primer plato de solución de lavado con la dermis hacia abajo. Corre piel hacia fuera y agite con una pinza. Deja la piel en el primer plato de la solución de lavado, mientras que la disección de la piel que viene. </li><li> Después de colocar la piel próxima disecados en el primer plato de solución de lavado, transferir la piel antes del segundo plato de solución de lavado. Mantenga pieles en the segunda solución de lavado hasta que todas las pieles se recogen. Transfiera todos los skins para el lavado final, agitar brevemente. </li><li> Añadir 10 ml de hielo frío Dispasa a una placa de cultivo estéril de 10 cm. Transferir la piel a la solución de Dispasa y aplanar la piel dermis hacia abajo. </li><li> Float piel durante 8-16 horas a 4 ° C (opción alternativa: 1 hora a 37 ° C). </li></ol> 4. Dermis Epidermis separada y <ol><li> Transferir la piel a una placa de cultivo estéril nueva y aplanar la piel dermis hacia abajo. Con cuidado, mantenga pulsada la dermis de una esquina con un bisturí. </li><li> Agarre la epidermis con pinzas y se desprenda lentamente lejos de la dermis. Epidermis deben pelar lejos como una sola pieza. La epidermis será blanca y fina y la dermis debe ser de color marrón, más grueso y gelatinoso. </li><li> Separe los dos tejidos en distintas placas de cultivo estériles. <ol class="lalpha"><li> Para que un gen específico dérmica caída / sobreexpresión injerto, tome la dermis y la carne picada en trozos muy pequeños con two escalpelos. Deseche epidermis. El día de la infección (paso 7), diseccionar otro conjunto de pieles de ratón para preparar células epidérmicas frescas, sin tratar de combinar con lentiviral células infectadas dérmicos. </li><li> Para hacer una epidérmico genes específicos desmontables / sobreexpresión injerto, corte cada epidermis en 6 - 8 piezas más pequeñas. Deseche dermis. El día de la infección (paso 7), diseccionar otro conjunto de pieles de ratón para preparar células frescas, dérmicos tratados para combinar con lentiviral infectados por células epidérmicas. </li></ol></li></ol> 5. Disociar Pilas Ratón piel (mDCs) del tejido picado <ol><li> Disociar mDCs por incubación de piezas dérmicos con solución de colagenasa recién hecho a 37 ° C durante 1 hr. Utilizar 10 ml de solución de colagenasa por ratón cachorro. </li><li> Mezclar suavemente dermis solución que contiene cada 10 min. Comprobar el grado de disociación con un microscopio con la suspensión de células digieren las células deben ser en su mayoría individuales. La solución debe pasar de transparente a opaco comocélulas dérmicas se disocian de la dermis. </li><li> Añadir FBS para solución de colagenasa que contiene dermis hasta un volumen final de 10% para reducir la actividad de la colagenasa. </li><li> Pase la suspensión celular a través de un colador de 70 micras de células en un tubo de 50 ml nuevo para eliminar grandes grupos no digeridos y los folículos enteros. Añadir 10 ml de DMEM/10% de FBS por 30 ml de el flujo a través para diluir aún más la colagenasa. </li><li> Tubos de centrífuga que contiene dermis se digirió a 30 xg en una centrífuga de mesa durante 5 min para eliminar adicionalmente folículos enteros. </li><li> Transferir cuidadosamente el sobrenadante a un tubo nuevo 50 ml. Pellet las células por centrifugación a 200 xg en una centrífuga de mesa durante 5 min. </li><li> Resuspender las células con FBS DMEM/10% (1 ml por cachorro) y contar las células. Células de la placa con Amniomax C-100 medios de comunicación para la infección (paso 7), o para combinar con lentivirus infectados por KC para el injerto (paso 9). Rendimiento típico es de 20 x 10 6 células por cachorro. </li></ol> 6. Disociar queratinocitos Primarias (KC) de tejido picado <ol><li> KC disociar mediante la incubación de piezas epidérmicas con recién descongelada 0,05% de tripsina-EDTA a 37 º C durante 15 min. Utilice 7 ml de tripsina-EDTA por ratón cachorro. </li><li> Agite suavemente la solución que contiene epidermis cada 5 minutos. </li><li> Añadir un volumen igual de solución neutralizante de tripsina-EDTA que contiene epidermis para reducir la actividad de la tripsina. </li><li> Pellet las células por centrifugación a 200 xg en una centrífuga de mesa durante 5 min. Tejido restante no digerido debe flotar en la parte superior. </li><li> Con cuidado vierta mayor parte del sobrenadante con el tejido no digerido. Remover el sobrenadante restante con una pipeta de 10 ml sin célula inquietante pellet. Resuspender pellet de células con PBS. En las KCs de casos no se sedimentan completamente, se vierte la mayor parte del sobrenadante y repetir la centrifugación hasta que la mayoría de las células se sedimentan. </li><li> Colar suspensión de células a través de 70 micras filtro de células en un tubo de nuevo para eliminar el tejido restante o grumos. </li><li> Pellet células por centrifugacióna 200 xg en una centrífuga de mesa durante 5 min. </li><li> Resuspender las células en los medios de comunicación CnT-07 o PBS (1 ml por cada cachorro) y las células de recuento. Use CnT-07 para células en placas de infección (paso 7), el uso de PBS para combinar con lentivirus infectados mDCs para el injerto (paso 9). Rendimiento típico es de 3-10 x 10 6 células por cachorro. </li></ol> 7. Infectar las células primarias con lentivirus que contienen shRNA o cDNA El día de la infección diseccionar otro conjunto de pieles de ratón para preparar las KCs frescos, no tratados primarios o mDCs para combinar con células infectadas por virus en el día de injerto (paso 9). <ol><li><ol class="lalpha"><li> Para mDCs, placa de 4 x 10 6 mDCs por placa de 10-cm con Amniomax-C100 medios de comunicación y se incuba a 37 ° C + 5% de CO 2 para la infección día siguiente a la densidad celular del 50%. Por lo general, las placas 3-4 de mDCs se utilizan para generar un injerto, y un total de 10-12 placas son necesarios para generar tres injertos en un solo experimento. Como alternativa, vamos a unir y difundir mDCs fo un mínimo de 2 horas a 37 ° C + 5% de CO 2 y llevar a cabo la infección por el mismo día de la siembra celular. mDCs tendrá fibroblastos-como la morfología. </li><li> Por KC, placa de 12 x 10 6 KC por 10 cm de la placa con la CNT-07 medios de comunicación y se incuban a 37 ° C + 5% de CO 2 para la infección día siguiente. Alternativamente, KC permiten almacenar y extender durante un mínimo de 2 horas a 37 ° C + 5% de CO 2 y llevar a cabo la infección en el mismo día. Por lo general, las placas 3-4 de KC se utilizan para generar un injerto. Un total de 10-12 placas son necesarios para generar tres injertos para un experimento. KC tendrá morfología adoquines. </li></ol></li><li> Preincubar células durante 5-10 minutos con 8 mg / ml Solución Polybrene a 37 º C + 5% de CO 2. </li><li> Cambio de los medios de comunicación y añadir lentivirus + 8 mg / ml Solución Polybrene. Título lentiviral variará dependiendo de la construcción utilizada y debe ser determinado antes de la infección. </li><li> Centrifugar las placas a 200 xg en una centrífuga de mesa durante 1 hora a 32 °; C para infectar células con lentivirus. </li><li> Retire lentivirus que contienen los medios de comunicación y añadir medio fresco. Por KC, lavar las células una vez con PBS antes de volver a agregar un nuevo medio. Células infectadas usualmente recuperar durante la noche a 37 ° C + 5% de CO 2. Alternativamente, permita por lo menos dos horas de recuperación a 37 º C + 5% CO 2 antes de tripsinizando las células para los injertos. Seguir a la cultura una pequeña porción de las células infectadas para comprobar la eficiencia de la infección como se describe en la sección de resultados representativos. </li></ol> 8. Preparar células infectadas por injerto <ol><li> Aislar frescas mDCs primarios o KCS de la piel con los pasos 4-6. Resuspender las células en hielo frío PBS estéril. Contar las células. </li><li><ol class="lalpha"><li> Para dérmica gen específico desmontables / sobreexpresión de injerto, se disocian mDCs infectados de placas usando 0,05% de tripsina-EDTA a 37 º C durante 8 min. </li><li> Para epidérmico genes específicos desmontables / sobreexpresión injerto, se disocian KC infectados de placas using 0,125% de tripsina-EDTA a 37 º C durante 15 min. </li></ol></li><li> Neutralizar la actividad de tripsina usando FBS DMEM + 10% (mDCs) o solución neutralizante (KC). Transferir las células tratadas con tripsina a un tubo de 50 ml. </li><li> Pellet las células por centrifugación a 200 xg en una centrífuga de mesa durante 5 min. </li><li> Resuspender las células en hielo frío PBS estéril. Contar las células. </li><li> Combine las células infectadas por virus con el recién preparada tipo de células sin tratar de contrapartida. Por un injerto, combinar 7-10 x 10 6 mDCs con 7-10 x 10 6 KCS en hielo frío PBS estéril y el pellet de células en suspensión de una centrífuga de mesa a 4 º C. Resuspender las células en 50 -100 l hielo frío PBS estéril. Mantenga las células en hielo hasta nu / nu ratones cámaras están listas. </li></ol> 9. Crear lecho de la herida y de la Cámara de Fix Volver a nu / nu ratones Un día antes del injerto, esterilizar los instrumentos quirúrgicos con cámaras de silicio autoclave y estéril por inmersión en etanol al 70%. Vuelva a colocar la eta 70%nol con PBS estéril antes de usar las cámaras. <ol><li> Anesthetize nu / nu ratón (7-12 semanas de edad hembras) usando ketamina (8 mg / ml) / xilazina (1,6 mg / ml) mediante inyección intraperitoneal (100 μl/10 g de peso corporal) o otro método preferente. Aplicar lubricante ocular. Coloque la almohadilla de calefacción inferior del ratón. </li><li> Desinfecte la piel desnuda de nuevo mouse con yodo y limpiar con toallitas de alcohol. </li><li> Añadir 1-3 gotas de 0,25% bupivicaína al sitio de la incisión por vía tópica. Apriete la piel del ratón de nuevo desnuda en la base del cuello con una pinza. </li><li> Corte un pequeño agujero circular (~ 1 cm de diámetro) en la piel pellizcada con tijeras estériles. </li><li> Coloque la cámara estéril en lecho de la herida y cubrir los bordes de la cámara con la piel circundante. </li><li> Cámara de fijación en su lugar con suturas a lo largo de los bordes de la cámara (6 puntadas por cámara), como se muestra en la Figura 2A. </li><li> Cuando las cámaras están listas, remover suavemente suspensión celular y en la elaboración de una aguja de calibre 23 unida a una jeringa de 1 ml. Si suspensión de células se ha condensado en la parte inferior, suavementeresuspender con una punta de pipeta ml antes de sacar la aguja. </li><li> La punción con aguja y cámara lenta por goteo células sobre la herida. </li><li> Coloque los ratones en jaulas limpias y autoclave. Casa 2 ratones por jaula y añadir antibióticos y Tylenol (3 mg / ml) para el agua potable. En nuestra experiencia, dos ratones hembras por jaula no han dado lugar a trauma adversa a la cámara, injerto o animales. </li><li> Coloque la almohadilla térmica menos de la mitad de la jaula y observar los ratones hasta que la anestesia desaparezca. </li></ol> 10. Retire Cámara Después de 7-9 días <ol><li> Anestesie cámaras nu / nu ratones como en el paso 9.1. Aplicar lubricante ocular. </li><li> Desinfecte la piel alrededor de la cámara con yodo y limpiar con toallitas de alcohol. </li><li> Corte con cuidado y quitar puntos de sutura de la cámara. </li><li> Retire con cuidado la cámara de ratón. Si las nuevas púas de injerto de piel a la cámara, levantar parte de la cámara y del injerto suavemente separado de la cámara utilizando fórceps. Mantenga injerto hacia abajo durante la extracción de la cámara. Injerto debe look mate y opaca como en la Figura 2B. </li><li> Aplicar una almohadilla no adherente con una película fina de los antibióticos sobre la herida abierta y la sutura en su lugar (2 puntos). </li><li> Envuelva vendaje alrededor del ratón para sujetar la almohadilla y proteger la herida. Suture vendaje en su lugar. </li><li> Las cámaras de silicio están limpiarse con jabón suave y enjuagar con agua desionizada. Remoje las cámaras en el 70% de etanol durante la noche, el aire seco y almacenar. </li></ol> 11. Examine ratón para el crecimiento del pelo <ol><li> Retire los vendajes y la almohadilla después de 3 días de la remoción de la cámara. Injerto debe ser seco y opaco a marrón. </li><li> Entrada ratones periódicamente para el crecimiento del cabello. El cabello debe comenzar a mostrar a los 16 días después del injerto. </li></ol> Procedimiento Esquema Día 1 (03.02 h): Sacrificio cachorros recién nacidos, quitar la piel y dejar actuar dispasa a 4 ° C durante la noche. Día 2 (03.02 h): Aislar las células primarias de la piel yplaca a una densidad celular recomendada. Día 3 (3-4 h): infectar células con lentivirus. Quite la piel del otro grupo de cachorros recién nacidos y dejar actuar dispasa a 4 ° C durante la noche. Día 4 (08.06 h): Aislar las células primarias de la piel, contar y dejar en hielo. Recuperar lentivirus células infectadas por tripsinización y centrifugación, contar y combinar 7-10 x 10 6 células dérmicas y queratinocitos en 50-100 l de PBS por injerto. Crear lecho de la herida en el ratón, coloque la cámara, y aplique la mezcla de células lecho de la herida. Procedimiento alternativo Outlines Esquemas alternativos procedimiento acortará el procedimiento de cuatro días a tres. <ol><li> Combinar Día 1 y Día 2 por tratamiento de las pieles de ratón en dispasa a 37 ° C durante una hora (hr tiempo estimado 5-7). </li><li> Combinar Día 2 y Día 3 mediante la infección de células con lentivirus después de células en placas durante dos horas (hr tiempo estimado 5-7). </li></ol>

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Ensayos de pelo reconstitución proporcionar un modelo de regeneración de órganos única para examinar el mecanismo de formación de novo folículo del cabello. Aquí se describe un ensayo de cámara de pelo modificado útil para determinar la función de genes en la formación de folículos pilosos. Nuestro ensayo se basa en el ensayo de reconstitución cámara informó cabello 5, 6,11, que se modificó para introducir una técnica de expresión lentiviral para lograr la sobreexpresión del gen o una caída en cualquiera de los tipos de células dérmicas o epidérmicas. Nuestro ensayo proporciona una alternativa rápida a la generación de tejidos específicos de knockout genético. Este ensayo nos permite demostrar la función de genes en la formación del folículo piloso en tan sólo tres semanas después de infectar células primarias con lentivirus a la colección del injerto. Nuestro ensayo pueden ser aplicados a las interacciones genéticas utilizando combinación shRNA / entrega de ADNc por lentivirus en un tipo de célula 12, así como permite el examen de la señalización entre el typ célula dérmica y epidérmicaes. Nuestro ensayo de pelo es el más adecuado para la detección de fenotipos fuertes ganancia o pérdida de función en la regeneración del folículo piloso, mientras que los defectos sutiles son más difíciles de observar. Hemos demostrado con éxito la función dérmica gen específico de unos pocos genes utilizando nuestro ensayo regeneración del cabello 1,12. Basado en el marcador GFP co-expresó a partir del vector lentivirus expresar shRNA 10, hemos demostrado que la expresión de shRNA células donantes dérmicos persistió en los injertos de pelo regeneradas. GFP-positivas las células estaban presentes en la papila dérmica (DP) de los folículos pilosos regeneradas (Figura 3). Las células DP probable constaba de diferentes niveles de gen desmontables como células expresaron niveles variables de GFP, por lo tanto el fenotipo del folículo del pelo observada fue de un rango de genética hypomorph a null. Una mejora para esta prueba será establecer una selección rápida y eficiente para los altos células que expresan shRNA antes grafting como el uso de FACS para purificar fuertes que expresan GFP-células. Una alternativa es sustituir las células mutantes knockout o condicional en este ensayo 9. Por otra parte, un sistema de cultivo que puede preservar la función DP celular es muy útil como potencia DP se pierde gradualmente una vez que las células dérmicas primarias se pasan. Sistemas de cultivo potenciales incluyen el uso de biomateriales derivados de nicho artificial o cultivos de agregación 2,7,8,13. Otra mejora será generar un método fiable epidérmico congelación celular con una velocidad de células de alta recuperación ya que esto reducirá el uso de la segunda serie de crías de ratón (paso 7) para generar queratinocitos frescas en dérmico específico de pérdida o de ganancia de- estudios de función. Este ensayo pelo cámara produce densidad de folículos pilosos y calidad similar a la piel de un ratón normal, aunque el crecimiento del pelo es un poco menos sincronizados y orientación folículo es más aleatoria. A pocas limitaciones del ensayo de regeneración del cabello genética incluídoe el requisito de gran cantidad de lentivirus y el número de células, y es una labor muy intensa en términos de métodos quirúrgicos en comparación con otras formas de ensayos de reconstitución del cabello tales como el parche y ensayos de solapa 3,4,14. Sin embargo, la calidad de los folículos pilosos y de escala de tiempo para detectar el crecimiento del cabello es superior a otros ensayos 4. Nuestro ensayo dirigido la regeneración capilar proporciona un compañero rápido y cómodo a los actuales modelos genéticos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-122 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% de tripsina-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> Cnt-07 </td><td> Celular N Tec </td><td> CnT-07 </td><td></td></tr><tr><td> AMINOMAX-C100 </td><td> Invitrogen </td><td> 17001-074 </td><td></td></tr><tr><td> AMINOMAX-C100 Suplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 12556-015 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / Estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15710-064 </td><td></td></tr><tr><td> Dispasa </td><td> Roche </td><td> 4942078001 </td><td></td></tr><tr><td> La colagenasa, Tipo 1 </td><td> Sigma </td><td> C-0130 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> Sigma </td><td> 107689-10G </td><td></td></tr><tr><td> Placa de cultivo de tejido </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772E </td><td></td></tr><tr><td> Tijeras de disección </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-999 </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-275 </td><td> curva </td></tr><tr><td> Scalpal </td><td> Medex Supply </td><td> GRF-2975 # 10 </td><td> Tamaño no. 10 </td></tr><tr><td> 70 micras de tinción celular </td><td> VWR </td><td> 21008-952 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tubos cónicos de centrífuga </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-49D </td><td></td></tr><tr><td> Hisopos de alcohol </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1368063 </td><td></td></tr><tr><td> Calibre 23 aguja </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-821-13F </td><td></td></tr><tr><td> Ojo lubricante </td><td> CVS </td><td> 8883660 </td><td></td></tr><tr><td> Providona-Lodine hisopos </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC0116841 </td><td></td></tr><tr><td> Silicio Cámaras </td><td> Renner GmbH </td><td> F2U, 30268 </td><td></td></tr><tr><td> Suturas </td><td> Acuderm </td><td> SUP3524 </td><td></td></tr><tr><td> Vendaje flexible </td><td> Fisher Scientific </td><html><td> 22-363-100 </td><td></td></tr><tr><td> Apósito no adherente </td><td> Telfa </td><td> 1050 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Materiales </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Solución de lavado PBS 500 g / ml penicilina / estreptomicina 12,5 ug / ml de Fungizone 100 ug / ml de gentamicina Dispasa solución HBSS 2,5 mg / ml final Dispasa 100 ug / ml de gentamicina Medios neutralizantes HBSS 15% (v / v) de FBS La colagenasa solución 0,25% (w / v) de colagenasa, Tipo 1 ONTENIDO &quot;&gt; 100 ug / ml de penicilina / estreptomicina 2,5 g / ml de Fungizone 50 ug / ml de gentamicina Polybrene solución HBSS 8 mg / ml (w / v) Polybrene </td></tr></tbody></table>

el análisis genético rápido de epitelio-mesenquimal de señalización durante la regeneración del cabello

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Morfogénesis del folículo piloso, un proceso complejo que requiere la interacción entre epitelios derivados de queratinocitos y el mesénquima subyacente, es un sistema de modelo atractivo para estudiar el desarrollo de órganos y la señalización específica de tejido. Aunque el desarrollo del folículo piloso es genéticamente tratable, análisis rápido y reproducible de los factores esenciales para este proceso sigue siendo un desafío. Aquí se describe un procedimiento para generar la sobreexpresión dirigida o shRNA mediada desmontables de factores utilizando lentivirus en una manera específica de tejido. Uso de una versión modificada de un modelo de la regeneración del cabello 5, 6, 11, se puede lograr robusta ganancia o pérdida de la función de análisis en los queratinocitos primarios de ratón o células dérmicas para facilitar el estudio de epitelio-mesenquimales vías de señalización que conducen a la morfogénesis del folículo piloso . Se describe cómo aislar frescas queratinocitos primarios de ratón y células dérmicas, que contienen células de la papila dérmica y sus precursores, entregar lentivirus contaiNing ya sea shRNA o de ADNc a una de las poblaciones de células, y las células se combinan para generar completamente formados folículos de pelo en la espalda de ratones desnudos. Este enfoque permite el análisis de tejidos específicos de los factores necesarios para generar los folículos pilosos en tres semanas y proporciona un compañero rápida y conveniente a los actuales modelos genéticos.

En la Figura 1 se muestra el resultado de la dermis-específico desmontables shRNA lentiviral de Smoothened (Smo), un componente crítico de señalización de Shh, en un injerto de pelo 3 semanas de edad regenerativa. Injertos de control usando vector lentiviral solo muestran el crecimiento del cabello robusta (Figura 1A). Por el contrario, cutánea específica de caída de los resultados de DOM en pérdida de crecimiento del pelo (Figura 1B). Hematoxilina y eosina representa la etapa de folículos pilosos en el control y las condiciones experimentales (Figura 1C, D). El fenotipo de crecimiento del cabello de tratamientos similares puede ser variable entre los experimentos, incluyendo el control positivo con infección lentiviral vector solo. Por lo tanto injertos de control positivos siempre debe ser incluido en cada experimento como referencia como 30% de los injertos pueden fallar como resultado de la cicatrización o una inserción incompleta de injertos. En el caso de pruebas de una interacción entre dos factores tales como la sobreexpresión de cDNA de un factor de volverSCUE shRNA mediada desmontables de otro factor, uno siempre debe incluir injertos desmontables únicamente para manifestar el resultado de pérdida de función en cada experimento. Esto proporcionará una gama necesaria para determinar cómo un gen en particular perturba el folículo piloso vía regeneración y cómo dos genes interactúan. La eliminación de la cámara (Figura 2A) se debe hacer con cuidado. El injerto recién formado debe ser ligeramente opaco con una superficie mate (Figura 2B). El injerto puede adherirse a la cámara, por lo que levantando suavemente un lado es importante asegurarse de que el injerto permanece unida al lecho de la herida. El injerto es bastante estable después de tres días, y debe presentar poca dificultad cuando se retira el vendaje. El crecimiento del cabello sólido debe ser observada después de tres semanas (Figura 2C). La omisión de cualquiera de mDCs o KCS resultará en un sitio de la herida se recuperaron sin pelo (Figura 2D) 11. La muerte celular o pérdida de células en uno de lostipos de células también da como resultado ningún pelo, en contraste con la regeneración del cabello reducida en dermo-Smo desmontables como se muestra en la Figura 1B. Para garantizar un ensayo de éxito, es fundamental para lograr mayor que 90% de infección viral de las células con sobreexpresión apropiado o eficiencia desmontables antes del injerto. Debido a las limitaciones de tiempo del procedimiento de injerto, se recomienda Eliminación de perturbaciones eficiencias de infección viral antes de iniciar un experimento de injerto, y siempre guardar una pequeña porción de las células en el día de injerto procedimiento para verificar la pérdida o ganancia de expresión. Título lentiviral variará dependiendo de la construcción utilizada y debe ser determinado antes de la infección para conseguir 90-100% de eficiencia. Nos supervisar la eficiencia de la infección viral con GFP coexpressed a partir del vector lentiviral. En forma rutinaria realizar PCR cuantitativa y / o Western blot para determinar el alcance de desmontables o sobreexpresión. Utilizando la expresión de doble vectores con marcadores fluorescentes para etiquetarlas células infectadas viralmente proporciona una manera de informar perdurance de señal y el número de células que expresan los constructos en los injertos maduros. Usamos GFP dirigido por un promotor CMV del vector lentiviral pSicoR-CMV-GFP 10 en combinación con Smo shRNA. En la figura 3, se muestra un 3 semanas de edad dermo-injerto específico donde se lentivirally GFP-expresado en la papila dérmica de un folículo piloso representante. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig1.jpg" /> Figura 1. El análisis histológico de crecimiento del folículo piloso. (A) Vista de injerto de control de la regeneración del cabello con células dérmicas infectadas con el vector lentiviral vacío y queratinocitos no tratados. (B) desmontables Smoothened utilizando shRNA lentiviral en células dérmicas combinados con los resultados queratinocitos no tratados en la pérdida de los folículos pilosos. (C) Hematoxilina y eosina tinción muestra f cabello anágenoollicles en los injertos de control se extienden hacia abajo en la dermis y (D) Smoothened de folículos pilosos siendo desmontables retraso en el crecimiento y en gran parte ausente. Todas las imágenes son tres semanas después del injerto. La barra de escala indica 100 micras. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig2.jpg" /> Figura 2. Injerto de células primarias. (A) nu / nu ratón con suturados alojamiento de cámara primarios células dérmicas y queratinocitos. (B) la eliminación de la cámara expone la piel recién formada que es opaco y opaco en el carácter. (C) pelos completamente crecido sobre injerto usando silvestre primaria Tipo de células dérmicas y queratinocitos a las tres semanas después del injerto. (D) Adición de células dérmicas primarias sin queratinocitos conduce a ningún pelo después de tres semanas. Se observan resultados similares con la adición de queratinocitos primarios sin células dérmicas. Figura 3. Mantenimiento de la expresión de GFP en papila dérmica. Confocal imágenes de papila dérmica de un injerto de 3 semanas de edad regenerado. GFP se expresó en la población de células dérmicas de un vector lentiviral y detectado en la papila dérmica (verde). Versican (rojo) demarca la papila dérmica y los núcleos se etiqueta con Hoechst (azul). Nota GFP se expresa específicamente en las células dérmicas, pero no en los queratinocitos circundantes. La barra de escala indica 20 m.

Tejido análisis específico de un modelo de regeneración del folículo del pelo utilizando lentivirus para mediar ganancia o pérdida de función.

El análisis genético rápido de epitelio-mesenquimal de señalización durante la regeneración del cabello

La morfogénesis del folículo piloso, un proceso complejo que requiere la interacción entre los queratinocitos derivados del epitelio y el mesénquima subyacente, es un ...

El objetivo general de este procedimiento es investigar las funciones específicas de los tejidos en vías de señalización que son fundamentales para la formación del folículo piloso. Esto se logra primero aislado células dérmicas y epidérmicas primarias de ratones recién nacidos. A continuación, la expresión génica se modifica infectando las células primarias con lentivirus.El tercer paso consiste en combinar las poblaciones celulares epidérmicas y dérmicas en cámaras fijadas sobre un lecho de herida en un ratón desnudo. A continuación, se monitorea el injerto para observar el crecimiento del vello. Finalmente, el efecto de la manipulación génica sobre la formación del folículo piloso puede evaluarse visualmente y mediante tinción histológica del sitio del injerto.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como un modelo murino de injerto cutáneo, es que el injerto puede completarse en tres semanas. Este método puede responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, como cómo los factores presentes en un tejido pueden afectar la señalización y la función en otro. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando deseábamos analizar funciones específicas de los tejidos de las moléculas del techo en la formación del folículo piloso tras lavar un ratón que había sido sacrificado por asfixia.Corte cada extremidad y la cola en la base del tronco con tijeras estériles. Luego, sujete firmemente el cuerpo entre un par de pinzas curvas y realice una incisión a lo largo de la piel dorsal desde la cabeza hasta la cola utilizando un escalpelo. No penetre la fascia subyacente.Ahora, retire cuidadosamente la piel desde la línea media del ratón. Sujete firmemente el ratón expuesto con el lado largo de la pinza curva e inserte otro par de pinzas curvas debajo de la piel en el extremo posterior del ratón. Ahora, desprenda cuidadosamente la piel completamente del ratón en un movimiento suave y deseche la carcasa.Coloque la piel en el primer recipiente con la solución de lavado con el lado de la dermis hacia abajo. Extienda la piel en la solución y agítela con la pinza. Luego, deje la piel en la solución de lavado mientras disecciona la siguiente piel.Después de colocar la siguiente piel diseccionada en el primer recipiente con solución de lavado, transfiera la piel anterior al segundo recipiente con solución de lavado. Mantenga las pieles en la segunda solución de lavado hasta que se hayan recolectado todas. Después del lavado final, transfiera hasta cinco pieles a un recipiente que contenga solución de disbe fría.Aplane las pieles con el lado dérmico hacia abajo y déjelas flotar durante ocho a 16 horas a cuatro grados Celsius. Transfiera una piel desde los recipientes fríos a un nuevo recipiente. Apánela con el lado dérmico hacia abajo.Sujete la epidermis con pinzas y retire lentamente la epidermis de la dermis. La epidermis debe desprenderse en una sola pieza, será blanca y delgada, mientras que la dermis será marronácea, más gruesa y gelatinosa. Separe los dos tejidos en placas de cultivo separadas para comenzar el aislamiento celular.Para aislar las células dérmicas, pique la dermis en trozos muy pequeños con dos escalpelos. Incube el tejido dérmico picado con una solución de colagenasa recién preparada a 37 grados Celsius durante una hora; cada 10 minutos, agite suavemente la mezcla celular. Cuando la digestión esté completa, continúe con el siguiente paso.La suspensión debe estar compuesta principalmente por células individuales, y la solución debe haber cambiado de transparente a turbia. Ahora, agregue un 10% en volumen de suero bovino fetal (FBS) a la suspensión celular. Páselas a través de un filtro celular de 70 micrones hacia tubos de 50 mililitros.Recopile hasta 30 mililitros de flujo a través por tubo. Continúe con el aislamiento de células dérmicas según el protocolo escrito. Para aislar los queratinocitos, corte cada epidermis en seis u ocho piezas más pequeñas.Incube el tejido cortado con tripsina al 0,05 % EDTA recién descongelada a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Continúe con el aislamiento de queratinocitos según el protocolo escrito, anestesie un ratón hembra desnudo de siete a doce semanas de edad utilizando ketamina y xilacina o un método preferido. Asegúrese de aplicar lubricante ocular y coloque al ratón sobre una almohadilla calefactora.Ahora desinfecte la piel de la espalda con yodo, seguido de torundas de alcohol. Con pinzas, pellizque la piel en la base del cuello y corte un orificio de un centímetro de diámetro en la piel pellizcada. Coloque la cámara sobre el lecho de la herida y cubra los bordes de la cámara con la piel circundante.Sujete la cámara con aproximadamente seis suturas. Únicamente a lo largo de sus bordes, coloque una cámara por ratón. Una vez asegurada la cámara, revise la suspensión celular. Si está condensada en el fondo, resuspenda suavemente con una punta de pipeta de un mililitro.Ahora, agite suavemente la suspensión celular y aspírela hacia una aguja de calibre 23 conectada a una jeringa de un mililitro. Perfore cada cámara con la aguja y gotee lentamente las células suspendidas en PBS sobre la herida. Cuando los ratones se recuperen de la anestesia, colóquelos en jaulas limpias esterilizadas por autoclave, con dos ratones por jaula.Asegúrese de administrar antibióticos y Tylenol mediante el agua de bebida. Después de siete a nueve días, anestesie el ratón desnudo tratado como se hizo anteriormente. Desinfecte la piel alrededor de la cámara con yodo y límpiela con torundas de alcohol.Corte cuidadosamente los puntos y retírelos de la cámara. Retire suavemente la cámara si la piel nueva se adhiere a ella. Separe suavemente el injerto de la cámara.Con unas pinzas, sujete el injerto hacia abajo. Durante la retirada de la cámara, el injerto debe verse mate y opaco. Aplique una gasa no adherente con una fina película de antibióticos sobre la herida abierta y sujétela con puntos, utilizando dos suturas.Envuelva al ratón con una venda para asegurar la almohadilla y proteger la herida. Suture la venda en su lugar. Después de tres días, retire las vendas y la almohadilla. No es necesario anestesiar al ratón durante este paso.El injerto debe estar seco y tener un color opaco a marrón. Revise periódicamente el injerto en busca de crecimiento de vello, el cual debería comenzar a observarse 16 días después del injerto. Se realizó un silenciamiento específico dérmico del gen smoothened, que es un componente esencial de la señalización de sonic hedgehog, en células dérmicas aisladas.Estas células se aplicaron a injertos de reconstrucción capilar siguiendo el protocolo descrito. Tras tres semanas de crecimiento, los injertos del control positivo con el vector lentiviral solo mostraron un crecimiento capilar robusto. Sin embargo, la inhibición del gen smoothened provocó una reducción severa del crecimiento capilar.Los injertos de control negativo, en los que se omitían ya sea las células dérmicas primarias o los queratinocitos, dieron como resultado un sitio de herida recuperado sin ningún vello. Asimismo, la muerte celular o la pérdida celular de uno de los tipos celulares en el injerto también provocó la ausencia de crecimiento del vello. Se determinó que el vector de lentivirus tenía una buena eficiencia de infección antes del experimento de injerto, y además fue diseñado para producir GFP junto con esta proteína Smoothened, S-H-R-N-A.Por lo tanto, la observación de la papila dérmica de los folículos pilosos mediante óptica fluorescente constituyó un control útil para confirmar la duración de la expresión lentiviral. Después de tres semanas, se utiliza la tinción H y E para mostrar la fase de crecimiento de los folículos pilosos en el injerto control y su fase de desarrollo retrasada cuando se silenció la expresión de smoothened. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 14 horas distribuidas a lo largo de tres días si se lleva a cabo correctamente. Esta técnica puede ampliarse para explorar la relación entre el tumor y el estroma durante la progresión del cáncer en el campo de la biología del cáncer.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estudiar la función génica en la formación del folículo piloso. Utilice nuestro ensayo rápido de reconstitución del cabello como una alternativa a los knockout genéticos tradicionales.

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Investigación

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Biology

Biología

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