La disección e inmunohistoquímica de larva, pupa y adulto Drosophila Retinas

El objetivo general de este procedimiento es obtener disecciones óptimas de las retinas de Drosophila y visualizar las proteínas expresadas en la retina en desarrollo. En primer lugar, las disecciones de retina se demuestran en tres etapas de desarrollo, la etapa larvaria, la etapa de la pupila y la etapa adulta. Los siguientes pasos son la fijación y la inmunohistoquímica.

En el paso final, las retinas se montan en portaobjetos para su visualización mediante microscopía confocal. En última instancia, este protocolo muestra el desarrollo y la diferenciación de las células de la retina a nivel de una sola célula. Históricamente, la retina de mosca ha sido un sistema ideal para abordar una amplia gama de cuestiones en biología del desarrollo y para estudiar los mecanismos reguladores genéticos subyacentes.

Aquí te mostramos técnicas para visualizar células de la retina en desarrollo desde una etapa pluripotente hasta un estado terminalmente diferenciado, te mostraré cómo diseccionar lava o retina. Demostraré disecciones en las retinas de la pupila media, ya que los núcleos de los fotorreceptores están casi en el mismo plano focal. Esta etapa es ideal para la comparación de la expresión de proteínas nucleares localizadas, como los factores de transcripción.

Hoy te mostraré cómo diseccionar las retinas de las moscas adultas. Para facilitar la estadificación reproducible de las fases de desarrollo, mantenga la drosófila a una temperatura constante de 25 grados Celsius y bajo un ciclo de luz y oscuridad de 1212 en estas condiciones. Las larvas del tercer estadio estarán disponibles aproximadamente 96 horas después de la regulación, cuando las larvas del tercer estadio tardío abandonan el alimento para comer.

Se pueden quitar con un cepillo suave o con una pinza. Después de recolectar las larvas, colóquelas en una gota de PBS frío en una placa de disección de protección silícola. Prepárese para diseccionar alrededor de 10 a 15 retinas por grupo experimental.

Bajo un microscopio de disección, localiza el extremo anterior de la lava, que contiene los ganchos bucales. Use una pinza para presionar suavemente la parte media de la lava contra la base del plato protector de sil. Use otra pinza para agarrar los ganchos bucales y tire suave y lentamente hacia afuera del cuerpo.

Deseche la parte principal del cuerpo y luego use las partes de la boca para sostener la parte anterior. El objetivo aquí es eliminar el tejido extraño del imagino, los discos y el cerebro. Ahora agarre los ganchos bucales con las pinzas y transfiera el cerebro con los discos imaginales a un plato de vidrio de tres mundos lleno de PBS.

A continuación, sustituya el PBS por un fijador recién preparado e incube el tejido en un agitador durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de 15 minutos, retire el fijador con una pipeta P 200. Enjuague el pañuelo dos veces con PBS y transfiéralo a un baño de PBS fresco.

Lave el pañuelo en una coctelera a temperatura ambiente durante 30 minutos. Ahora, retire el PBS y enjuague los pañuelos dos veces con PBST. A continuación, vuelva a añadir PBST fresco y prepárese para diseccionar aún más el tejido bajo el microscopio.

Extirpa las glándulas salivales y el tejido graso. A continuación, separe el disco imaginal del ojo del otro tejido. Ahora está listo para someterse a un procesamiento inmunohistoquímico.

Después de procesar los pañuelos, transfiéralos al centro de un portaobjetos de vidrio limpio. Con una pipeta P 20, retire el exceso de solución y luego use una pinza para alinear las retinas con el centro del portaobjetos. Para la obtención de imágenes.

Ahora aplique 10 microlitros de medio de montaje en las retinas. Cúbralos suavemente con un cubreobjetos y selle el portaobjetos al portaobjetos con esmalte de uñas transparente. A 25 grados centígrados, se observará un 50% de pube aproximadamente 48 horas después de la pupa.

La mejor manera de cronometrarlos es poniéndolos en círculos, recién formados de color blanco o 0% pube en el vial o simplemente moviéndolos a un nuevo vial. Después de 48 horas, la pupa media se puede extraer cuidadosamente con una pinza y transferir a PBS Bajo el microscopio, agarre el extremo posterior de la caja de la pupila con las pinzas. A continuación, agarre la superficie anterior de la cutícula con otra pinza y retire suavemente el opérculo.

Retira cualquier cutícula residual para exponer completamente la cabeza. Ahora, use las puntas de los fórceps para perforar el saco blando subyacente en la región dorsal anterior. Esto proporciona acceso a la cabeza.

Separe suavemente la cabeza del tórax aspirando lentamente la cabeza con una pipeta P 20 para expulsar la cabeza de la pipeta y llevarla a PBS fresco. Las retinas conectadas al cerebro flotarán libremente. Una gota adicional de PBS puede ayudar a localizar las retinas transparentes.

Una vez que los tejidos se asienten, retire el exceso de tejido, incluida la cutícula de la cabeza y los probos. Transfiera las retinas y el cerebro a PBS fresco con todas las retinas y cerebros aislados en PBS. Reemplace la solución con un fijador recién preparado.

A continuación, incubar el tejido en una coctelera durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de 15 minutos, retire el fijador con una pipeta y enjuague el pañuelo tres veces. Con PBST, permita que los tejidos permanezcan bañados en PBST y prepárese para una disección posterior.

Este es el paso más desafiante del protocolo. Extirpa la lámina y el cerebro estudiando primero el tejido. Perforar el lóbulo óptico con una aguja de disección muy afilada.

A continuación, inserte una aguja de disección igualmente afilada entre la lámina y la retina para separar la retina de la lámina y el lóbulo óptico. Las retinas ahora se pueden teñir, sin embargo, tenga mucho cuidado al manipularlas, ya que son muy endebles y pegajosas. Después de teñir el tejido, monte las retinas de la pupila media utilizando una pipeta P 20 para transferirlas al centro de un portaobjetos de vidrio limpio y cargado positivamente.

Retire cualquier exceso de PBST y luego use las agujas para alinear las retinas para la obtención de imágenes. Ahora aplique 10 microlitros de medio de montaje en las retinas. Con una toallita y una acción capilar, retire el PBST después de aplicar suavemente un cubreobjetos.

El portaobjetos está listo para la toma de imágenes. Comience recogiendo las cabezas de moscas de dos a cinco días de edad en un plato silvestre de vidrio que contenga un XPBS frío. Transfiera una sola cabeza a una gota de PBS frío en un plato S.

Comience la disección agarrando la cápsula anterior de la cabeza con un fórceps y luego retire las partes de la boca. A continuación, agarre la cutícula de la cabeza posterior ventral con una pinza y use la otra para separar un ojo de la cutícula rasgando a lo largo de su borde. Proceda a retirar la cutícula en el margen del ojo para manipulaciones posteriores.

Es conveniente dejar un pequeño trozo de cutícula adherido a la retina. Ahora transfiera la retina a una placa silvestre de vidrio que contenga PBS frío usando una pinza cuando todas las retinas estén diseccionadas. Reemplace el PBS con un fijador recién preparado.

Asegúrese de que la parte interna de la retina esté en contacto con el fijador. Incluso si la retina está flotando en la superficie, incubar el tejido en un agitador durante 15 minutos a temperatura ambiente Después de 15 minutos, retire el fijador con la pipeta P 200 y enjuague el tejido dos veces con PBS. A continuación, lave el pañuelo durante 30 minutos o más en una coctelera a temperatura ambiente.

Ahora, retire el PBS, agregue el PBST y prepárese para eliminar las láminas. Con frecuencia, la lámina permanece unida a la superficie interna de la retina disecada. Extraiérela agarrando la retina por un borde con las pinzas y tirando suavemente de la lámina con las otras pinzas.

A continuación, retira cualquier cutícula restante para que no se pliegue sobre la retina. Durante el montaje, los tejidos de la lámina y la cutícula interferirían con la visualización de los fotorreceptores teñidos. Ahora se pueden teñir las retinas.

La disección de retinas de adultos se puede dominar con unas pocas semanas de práctica. Escurrir y quitar las láminas es probablemente la parte más difícil. Mi consejo es que tengas paciencia y disecciones muchos más de los que crees que vas a necesitar.

También ayuda practicar con moscas de ojos rojos antes de intentar con moscas de ojos blancos. Una vez teñidas, las retinas deben orientarse en un portaobjetos puente para obtener la imagen. Una vez asegurada con cinta adhesiva, la luz del puente se puede almacenar a cuatro grados centígrados utilizando el procedimiento descrito.

Se preparan muestras de retinas en tres etapas de desarrollo para microscopía. Un disco de imagen ocular de larva se tiñó con anticuerpos que detectan dos factores de transcripción que se expresan en diferentes tipos de fotorreceptores. La proteína siete arriba se muestra en verde, y la proteína pequeña se muestra en magenta.

Se incubó una retina aislada de la pupila media con anticuerpos que visualizan diferentes tipos de fotorreceptores. Las manchas son contra LLV en azul, que marca todos los fotorreceptores y contra prospero. En cian, que marca a R siete fotorreceptores.

Se tiñó la retina de un adulto con dos gotas rojas de anticuerpos para visualizar dos subtipos de fotorreceptores. La expresión estocástica y mutuamente excluyente de RH cinco en cian y Rh seis en rojo ocurre en dos subtipos de fotorreceptores R ocho. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseccionar las retinas de las pupilas de las larvas y de los adultos de la gripe, y cómo visualizar las células de la retina mediante inmunohistoquímica.

Combinado con los enfoques disponibles de pérdida y ganancia de función específicos del ojo. Este protocolo te permitirá estudiar los mecanismos genéticos que subyacen al desarrollo ocular. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.