Name: Las nanopartículas virales para En vivo Imágenes de tumores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Aprende a propagar y purificar nanopartículas virales de plantas para imágenes de tumores en modelos murinos con xenoinjertos. Este método permite evaluar la biodistribución y localización tumoral mediante marcaje fluorescente.

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Este trabajo fue apoyado por el NIH / NIBIB subvenciones R00 EB009105 (para NFS) y EB011317 P30 (para NFS), un NIH / NIBIB formación de subvención T32 EB007509 (a AMW), un Case Western Reserve University Interdisciplinario Alliance Investment Grant (para NFS), y Un Caso Comprehensive Cancer Center subvención P30 CA043703 (para NFS). Agradecemos a los investigadores de laboratorio Steinmetz pregrado de estudiantes para sus prácticas en el apoyo: Nadia Ayat, Kevin Chen, Sourav (Sid) Dey, Alice Yang, Sam Alexander, Craig D&#39;Cruz, Hern Stephen Randolph Lauren, Brian lo tanto, Pablo y Chariou .

1. VNP (CPMV, BMV, PVX y TMV) Propagación <ol><li> Poner la cámara de planta de interior controla a 15 horas del día (100% de luz, 25 º C, 65% de humedad) y 9 h de la noche (0% de luz, 22 ° C, 60% de humedad). </li><li> Se inoculan las plantas de acuerdo a la escala de tiempo en la Tabla 1. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> CPMV </td><td> PVX, TMV, y BMV </td></tr><tr><td rowspan="2"> Día 0: Planta 3 caupí semillas / maceta. </td><td> Día 0: Plant ~ 30 N. benthamiana semillas / maceta. Fertilizar una vez por semana con un fertilizante cucharada 1/5 l de agua. </td></tr><tr><td> Día 14: Re-pot N. benthamiana en 1 planta / maceta. </td></tr><tr><td> Día 10: Infect deja las hojas primarias con CPMV (5 μg/50 l / hoja) por inoculación mecánica con una fina capa de carburo de silicio. </td><td> Día 28: Infect tres a five deja con PVX, TMV, o BMV (5 μg/50 l / hoja) por inoculación mecánica con una fina capa de carburo de silicio. </td></tr><tr><td> Día 20: Hojas de la cosecha y almacenar a -80 ° C. </td><td> Día 42: las hojas de la cosecha y almacenar a -80 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Cronograma para el cultivo, infectando, y cosechar las hojas. Nota: sólo propagación CPMV se demuestra como un ejemplo. 2. VNP (CPMV, BMV, PVX y TMV) Purificación Nota: Todos los pasos se llevan a cabo en hielo o a 4 º C. <ol><li> Homogeneizar 100 g de hojas congeladas en un mezclador estándar utilizando 2 volúmenes de tampón frío (véase la Tabla 2). Filtrar a través de 2-3 capas de estopilla. </li><li> Para PVX, ajustar el pH a 6,5 ​​utilizando 1 M de HCl. Añadir 0,2% (w / v) de ácido ascórbico y 0,2% (w / v) de sodio sulfiTE. </li><li> Centrifugar homogeneizado crudo planta a 5.500 xg durante 20 min. Recoger el sobrenadante. </li><li> Para BMV, capa de 25 ml de sobrenadante sobre 5 ml de 10% (w / v) de solución de sacarosa. Se centrifuga a 9.000 xg durante 3 horas y se resuspende el pellet en solución de CsCl 38,5% (w / v). Mezclar por agitación durante 5 horas, y luego continúe con el paso 2.12. </li><li> Extraer material de la planta mediante la adición de 0,7 volúmenes de 1:1 (v / v) de cloroformo :1-butanol. Revuelva la mezcla durante 30-60 min. </li><li> Centrifugar la solución a 5.500 xg durante 20 min. Recoger la fase acuosa superior. </li><li> Añadir NaCl a 0,2 M y 8% (w / v) PEG (MW 8.000). Para TMV, también añadir 1% (v / v) de Triton X-100. Se agita durante al menos 1 h, después se deja reposar durante al menos 1 h. </li><li> Se centrifuga la solución a 15.000 xg durante 15 min. Resuspender el sedimento en 10 ml de tampón. Para PVX, añadir 0,1% β-mercaptoetanol y urea a 0,5 M. </li><li> Centrifugar a 8.000 xg durante 30 min y recoger el líquido sobrenadante. </li><li> Ultracentrífuga sobrenadante a 160.000 xg durante 3 hr. Resuspender el sedimento en 5 ml de tampón overnight. </li><li> Preparar un gradiente de sacarosa al 10-40% usando volúmenes iguales de 10%, 20%, 30% y 40% de sacarosa en tampón (el más pesado primero). Permitir que el gradiente de equilibrar durante la noche a temperatura ambiente. </li><li> Ultracentrífuga precipitado resuspendido sobre gradiente de sacarosa a 100.000 xg durante 2 horas (24 horas para BMV). </li><li> Recoger banda de dispersión de luz y diálisis frente a tampón. </li><li> Caracterizar los VNPs (abajo) y se almacena a 4 º C. Para almacenamiento a largo plazo, almacenar a -80 ° C. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> CPMV y TMV </td><td> 0,1 M de tampón de fosfato de potasio (pH 7,0) 38,5 mM KH 2 PO 4 61,5 mM K 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> PVX </td><td> 0,5 M de tampón borato (pH 7,8) 0,5 M de ácido bórico Ajustar el pH con NaOH </td></tr><tr><td> BMV </td><td> SAMA tampón (pH 4,5) 250 mM de acetato de sodio 10 mM MgCl 2 2 mM β-mercaptoetanol (añadir nuevo) </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Buffers y sus recetas para cada VNP. Nota: sólo propagación CPMV se demuestra como un ejemplo. 3. VNP (CPMV, BMV, PVX y TMV) Caracterización <ol><li> Espectroscopía UV / visible para determinar la concentración de VNPs. <ol><li> Medir la absorbancia de 2 l de muestra utilizando un espectrofotómetro NanoDrop. </li><li> Determinar la concentración de partículas y colorantes utilizando la ley de Beer-Lambert (A εcl =, donde A es la absorbancia, ε es el coeficiente de extinción, c es la concentración, y l es la longitud del camino). La longitud del camino es de 0,1 cm para el NanoDrop. Los coeficientes de extinción VNP-específicos son: CPMV: 8,1 cm -1 mg -1 ml (a 260 nm) PVX: 2,97 cm -1 mg -1 ml (a 260 nm) TMV: 3,0 cm -1 mg -1 ml (a 260 nm) BMV: 5,15 cm -1 mg -1 ml (a 260 nm) </li></ol></li><li> Analizar las partículas por exclusión de tamaño rápido cromatografía líquida de proteínas (FPLC). <ol><li> El uso de un Superose 6 columna de exclusión por tamaño y el Explorador de ÄKTA, carga de 50-100 g de VNPs en 200 l de 0,1 M tampón fosfato de potasio (pH 7,0). </li><li> Establecer detectores a 260 nm (ácido nucleico), 280 nm (proteína), y la longitud de onda de excitación de los colorantes unidos. </li><li> Ejecute a una velocidad de flujo de 0,5 ml / min durante 72 min. </li><li> El perfil de elución y A260: A280 nm indica si la preparación VNP es puro y si las partículas están intactos y montados. El siguiente A260: 280 proporciones indican una preparación pura VNP: CPMV: 1,8 ± 0,1 PVX: 1,2 ± 0,1 TMV:1,1 ± 0,1 BMV: 1,7 ± ​​0,1 </li></ol></li><li> Realizar desnaturalización (pre-cast NuPAGE) Bis-Tris poliacrilamida 4-12% electroforesis en gel de gradiente para analizar la pureza de la preparación y la conjugación a proteínas de recubrimiento individuales. <ol><li> Añadir 3 ml de tampón de muestra LDS 4x a 10 g de las partículas en 9 l de tampón de fosfato de potasio. Añadir un adicional de 1 l de tampón de muestra LDS 4x y 3 l de β-mercaptoetanol a BMV para reducir el elevado número de enlaces disulfuro. </li><li> Incubar en bloque de calor durante 5 minutos a 100 ° C. </li><li> Cargar muestras en un gel de SDS. </li><li> Ejecutar las muestras a 200 V durante 1 h en 1x MOPS funcionamiento de amortiguación. </li><li> Documentar el gel bajo luz UV para visualizar las proteínas fluorescentes abrigo. </li><li> Para no fluorescente de proteínas, tinción con azul de Coomassie (0,25% (w / v) azul brillante de Coomassie R-250, 30% (v / v) de metanol, 10% (v / v) de ácido acético) durante 1 hr. </li><li> Destain con 30% de metanol, 10% de ácido acético durante la noche. Change la solución si se requiere. </li><li> Documentar el gel con luz blanca. </li></ol></li><li> Analizar la integridad de las partículas por microscopía electrónica de transmisión (TEM). <ol><li> Diluir las muestras a 0.1-1 mg / ml en 20 l de agua DI. </li><li> Coloque 20 gotas l de las muestras en Parafilm. </li><li> Cubra gotas con una rejilla TEM y deje reposar durante 2 min. Wick fuera de la solución en exceso en la rejilla con papel de filtro. </li><li> Lave la red mediante la colocación de una gota de agua DI luego mecha seca. </li><li> Mancha de red mediante la colocación de una gota en 20 l de 2% (w / v) de acetato de uranilo durante 2 min. Wick fuera el exceso de tinción con papel de filtro. </li><li> Lavar rejilla una vez más en agua. </li><li> Observe red con un microscopio electrónico de transmisión. </li></ol></li></ol> 4. Conjugación química de VNPs con PEG y fluoróforos, purificación y caracterización <ol><li> Para los cálculos para las reacciones siguientes, la masa molar de los VNPs son: CPMV: 5,6x 10 6 g / mol PVX: 35 x 10 6 g / mol TMV: 41 x 10 6 g / mol BMV: 4,6 x 10 6 g / mol </li><li> Conjugar tintes y PEG a las lisinas superficiales de CPMV y PVX utilizando un solo paso N-hidroxi succinimida reacción de acoplamiento: Añadir 2.500 equivalentes molares (todos los excesos molares se refieren a un exceso molar de por VNP) de Alexa Fluor 647 éster de succinimidilo y 4.500 equivalentes de NHS- PEG (PM 5.000) disuelto en DMSO a CPMV en 0,1 M tampón fosfato de potasio. Cuando se trabaja con PVX, añadir un exceso molar de 10.000 NHS-dye y PEG-NHS. Ajustar los volúmenes de tampón y DMSO tales que la concentración final de CPMV y PVX es 2 mg / ml y el contenido de DMSO es 10% del volumen total de reacción. Incubar la mezcla de reacción durante la noche a temperatura ambiente protegido de la luz. CPMV y PVX tiene 300 y 1.270 lisinas direccionables, respectivamente. (El lector puede consultar las siguientes referencias para lecturas adicionales sobremodificación química de CPMV y PVX: 13-15). </li><li> Colorantes conjugado y PEG a tirosinas del TMV mediante un acoplamiento de diazonio seguido por el cobre (I)-catalizada azida-alquino cicloadición. <ol><li> Preparar sal de diazonio (alquino) mediante la mezcla de 400 l de 0,3 M de monohidrato de ácido p-toluenosulfónico, 25 l de nitrito de sodio 3,0 M, y 75 l de 0,68 M destilada 3-etinilanilina disolvió en acetonitrilo a 4 º C durante 1 hr. </li><li> Añadir 3,3 ml de tampón borato, pH 8,8, que contiene 100 mM NaCl a 1,25 ml de TMV (20 mg / ml de solución madre). </li><li> Reaccionar el TMV con 450 l de la sal de diazonio (alquino) de solución en un baño de hielo durante 3 horas para añadir una ligadura alquino manejar a TMV por acoplamiento de diazonio. La solución se convertirá en un color marrón claro. TMV tiene 2.140 tirosinas disponibles para la conjugación. </li><li> Se purifica el producto final utilizando un colchón de sacarosa como se describe en el paso 4,4. </li><li> Adjuntar azida-funcional Alexa Fluor 647 y PEG-azida (PM 5.000) using de cobre (I)-catalizada azida-alquino cicloadición (CuAAC). Añadir 2 equivalentes de tinte y PEG-azida por proteína de la cubierta y se incuban con 1 mM CuSO 4, 2 mM AMG, y ascorbato de sodio 2 mM a temperatura ambiente durante 15 min. Ajustar el volumen del tampón de forma que la concentración final de reacción de TMV es 2 mg / ml. (El lector puede consultar las siguientes referencias para la lectura adicional sobre la modificación química de TMV: 16,17). </li></ol></li><li> Conjugar colorantes a lisinas y PEG a cisteínas de cisteína BMV mutante (cBMV): <ol><li> Añadir 2.000 equivalentes molares de Oregon Green 488 succinimidil éster disueltos en DMSO a cBMV en 0,1 M de tampón TNKM (50 mM Tris base, 50 mM NaCl, 10 mM KCl, 5 mM MgCl 2, pH 7,4). Ajustar los volúmenes de tampón y DMSO tales que la concentración final de BMV es 1 mg / ml y el contenido de DMSO es 10% del volumen total de reacción. Incubar la mezcla de reacción durante la noche a 4 º C protegida de la luz. </li><li> Purificar las partículas mediante centrifiltros fugados como se describe en el paso 4.4. </li><li> Añadir 2.000 exceso molar de PEG-maleimida (PM 2.000) usando las mismas condiciones de reacción como antes y se incuba la mezcla de reacción durante 2 horas a 4 ° C. cBMV tiene 180 lisinas reactivas y cisteína. (El lector puede consultar las siguientes referencias para la lectura adicional sobre la modificación química de la BMV, 18). </li></ol></li><li> Purificación: Pasar la solución a través de un colchón de sacarosa al 40% (w / v) a 160.000 xg durante 2,5 hr. Volver a disolver el precipitado en tampón. Alternativamente, se dializa frente a tampón apropiada, usando 10 kDa de corte filtros spin. </li><li> Caracterización: VNPs PEGilados y marcado fluorescentemente-se analizaron usando los métodos descritos anteriormente: UV / visible de espectroscopia, la electroforesis en gel de SDS, FPLC, y TEM (no se muestra, sin embargo, se refieren a las figuras 6 y 7). </li></ol> 5. Tumor de Metas e imágenes utilizando un modelo de xenoinjertos de ratón<ol><li> Cultura HT-29 células humanas de cáncer de colon en medio RPMI suplementado con FBS al 5%, 1% de penicilina-estreptomicina, y 1% de L-glutamina, a 37 ° C en 5% de CO 2 utilizando 175 cm 2 frascos de cultivo celular. </li><li> Lavar las células dos veces con PBS estéril y la cosecha mediante la incubación con 5 ml de tripsina-EDTA a 37 º C durante 5 min. Inactivar la tripsina con 5 ml de medio RPMI. Recoger las células por centrifugación a 500 xg durante 5 min. a 4 º C y se resuspende en medio fresco RPMI a 5x10 6 células/50 medio l (determinar recuento total de células usando azul de tripano y un hemocitómetro a). Mezclar con un volumen igual de matrigel antes de la inyección (mantener todas las soluciones y reactivos estériles). </li><li> Adquirir seis semanas de edad NCR nu / nu ratones y los mantienen en una dieta libre de alfalfa durante 2 semanas. [Nota:. Todos los procedimientos con animales debe ser aprobado por el IACUC] Inducir xenoinjertos de tumores mediante inyección subcutánea de 5x10 6 células/100 l / tumor en los flancos (2 tumores / ratón) usando un manómetro 18 1/2 estérilaguja. Monitorear los animales regularmente. Medir el tamaño del tumor usando calibres y permitir que los tumores crezcan a un volumen promedio de 20 mm 3 (dentro de los próximos 12 días). Asignar los ratones en dos grupos al azar: PBS y VNP (n = 3 animales / grupo / hora punta). Uso de un 1 ml jeringa de insulina de calibre 28, administrar por la vena de la cola de inyección intravenosa 100 l de PBS estéril o 10 mg / kg formulación VNP. </li></ol> Nota: los experimentos de cultivo de tejidos y estudios con animales vivos que no se ha demostrado. Demostración práctica se limitará a procesamiento de tejidos y de adquisición de datos. Para una referencia sobre la HT-29 modelo de xenoinjerto de tumor, se remite al lector a la ref. 19 Tres técnicas se utilizan para evaluar el tumor homing de VNPs: <ol start="4"><li> Imágenes de fluorescencia mediante Maestro Imaging System: ratones sacrificio en diferentes puntos de tiempo (2, 24, y 72 h) usando CO 2gas. Disecar los animales y especiales todos los órganos principales (cerebro, corazón, pulmones, el bazo, los riñones y el hígado), junto con los tumores en los flancos, colocar los tejidos en parafilm, y analizar con el instrumento de formación de imágenes de fluorescencia utilizando excitación amarillo y filtros de emisión (800 ms exposición) para detectar la presencia de señales fluorescentes en los tejidos (derivadas de A647 etiqueta conjugarse a los VNPs). Guarde las imágenes y analizar la intensidad de fluorescencia utilizando ImageJ software 1.44o ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij</a> ). Comparar el patrón de absorción de los VNPs en los tumores con otros tejidos importantes con el tiempo. </li><li> Después de la imagen, recortar cada tejido por la mitad e insertar un medio en compuesto OCT para el análisis de la crio-seccionamiento y confocal. Recoge la otra mitad en predosificados crio-viales y congelar inmediatamente utilizando N2 líquido. Almacenar a -80 ° C hasta que esté listo para su posterior procesamiento. </li><li> Fluorescencia de cuantificación: Retejidos de la médula pesos. Descongelar los tejidos congelados a temperatura ambiente y colocarlos en tubos separados Falcon de 50 ml que contienen 1 ml de PBS. El uso de un homogeneizador de tejidos de mano, homogeneizar los tejidos para 2-3 min en PBS a continuación, transferir el homogenado a tubos de microcentrífuga. Se centrifuga el homogeneizado durante 10 min a 13.000 xg para eliminar la no-tejido homogeneizado. </li><li> Pipetear 100 l del sobrenadante de los tejidos de cada grupo (formulaciones PBS y VNP / puntos de tiempo) en una placa de UV 384 y negro. Evaluar la intensidad de fluorescencia (Ex / Em longitudes de onda de 600/665), utilizando un lector de placas. Normalizar los valores obtenidos fluorescentes por los pesos de los tejidos. </li><li> Inmunohistoquímica: Preparar la crio-micrótomo secciones (10 micras) y se almacena a -20 ° C. Mancha de las secciones de tejido para núcleos de las células (DAPI) y marcador de células endoteliales (marcado con FITC anti-ratón CD31 de anticuerpos). Llevar a cabo el análisis por microscopía confocal para mapear la localización intra vascular y tumoral de marcado fluorescentemente VNPs. </li></ol> Nota: Este procedimiento no se ha demostrado, los datos representativos se muestran en la Figura 8. Para una referencia sobre la inmunohistoquímica y los métodos de tinción descritos, se remite al lector a la ref. 19

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<li>Yildiz, I., Tsvetkova, I., Wen, A. M., Shukla, S., Masarapu, M. H., Dragnea, B., Steinmetz, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+Brome+mosaic+virus+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Engineering of Brome mosaic virus for biomedical applications.</a> RSC Advances. , (2012).</li>
<li>Brunel, F. M., Lewis, J. D., Destito, G., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Stuhlmann, H., Dawson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrazone+ligation+strategy+to+assemble+multifunctional+viral+nanoparticles+for+cell+imaging+and+tumor+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting.</a> Nano Lett. 10, 1093-1097 (2010).</li>
<li>Shukla, S., Ablack, A., Wen, A., Lee, K., Lewis, J., Steinmetz, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+tumor+homing+and+tissue+penetration+of+the+filamentous+plant+viral+nanoparticle+Potato+virus+X%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Increased tumor homing and tissue penetration of the filamentous plant viral nanoparticle Potato virus X.</a> Molecular Pharmaceutics. , (2012).</li>
<li>Chatterji, A., Ochoa, W., Shamieh, L., Salakian, S. P., Wong, S. M., Clinton, G., Ghosh, P., Lin, T., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+conjugation+of+heterologous+proteins+on+the+surface+of+Cowpea+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea mosaic virus.</a> Bioconjug. Chem. 15, 807-813 (2004).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Este protocolo proporciona un método para la modificación química de VNPs y sus aplicaciones para la formación de imágenes de tumores in vivo. Las técnicas de formación de imágenes de fluorescencia de animales, la cuantificación de fluorescencia, y la inmunohistoquímica presentados aquí son útiles para el estudio de biodistribución y la evaluación de tumor homing. Estas técnicas proporcionan información valiosa con respecto al acceso de las nanopartículas en el tumor por el efecto EPR. Mediante la comb...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;fuerte&gt;Producción de VNP&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Cámara para plantas de interior</td><td>Percival Scientific</td><td>E-41L2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. unguiculata&lt;/em&gt; semillas (California black-eye n.º 5)</td><td>Burpee</td><td>51771A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N. benthamiana&lt;/em&gt; semillas</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Las semillas de N. benthamiana fueron un obsequio del Instituto Salk. Las semillas se producen mediante propagación vegetal.&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Carborundo</td><td>Fisher</td><td>C192-500</td><td></td></tr><tr><td>Sustrato para macetas Pro-mix BX</td><td>Premier Horticulture</td><td>713400</td><td></td></tr><tr><td>Fertilizante Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite</td><td>JR Peters</td><td>77860</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;fuerte&gt;Equipamiento&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>rotor Ti 50.2</td><td>Beckman</td><td>337901</td><td></td></tr><tr><td>Rotor SW 32 Ti</td><td>Beckman</td><td>369694</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90K ultracentrífuga</td><td>Beckman</td><td>365672</td><td></td></tr><tr><td>rotor SLA-3000</td><td>Thermo Scientific</td><td>07149</td><td></td></tr><tr><td>rotor SS-34</td><td>Thermo Scientific</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga Sorvall RC-6 Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Botella de polipropileno</td><td>Beckman</td><td>355607</td><td>Para rotor SLA-3000</td></tr><tr><td>Botella de policarbonato</td><td>Beckman</td><td>357002</td><td>Para rotor SS-34</td></tr><tr><td>Tubo Ultra-Claro</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>Para gradiente de sacarosa y rotor SW 32 Ti</td></tr><tr><td>Botella de policarbonato</td><td>Beckman</td><td>355618</td><td>Para la centrifugación y rotor 50.2 Ti</td></tr><tr><td>espectrofotómetro NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop2000c</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de geles precolados PowerEase 500</td><td>Invitrogen</td><td>EI8675EU</td><td></td></tr><tr><td>Columna de exclusión por tamaño Superose 6 10/300 GL (24 ml)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#196;Cromatógrafo KTA Explorer 100</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-66</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-12R</td><td>Beckman</td><td>392302</td><td>Centrífuga de banco</td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>Maestro 2</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td>&lt;em&gt;in vivo&lt;/em&gt; sistema de imagenología</td></tr><tr><td>Tissue-Tearor</td><td>Biospec Products</td><td>985370-395</td><td></td></tr><tr><td>Lector de microplacas</td><td>Tecan</td><td>Infinite-200</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de transmisión</td><td>ZEISS</td><td>Libra 200FE</td><td></td></tr><tr><td>microscopio confocal de barrido láser FluoView</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;fuerte&gt;Productos químicos y reactivos&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>3-etinilanilina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>498289-5G</td><td></td></tr><tr><td>placa negra de 384 pocillos</td><td>BD Biosciences</td><td>353285</td><td></td></tr><tr><td>Gel SDS-PAGE NuPAGE Bis-Tris 4-12 %</td><td>Invitrogen</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de muestra LDS 4X</td><td>Invitrogen</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Fisher</td><td>A385-500</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>271004-1L</td><td></td></tr><tr><td>azida Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A10277</td><td></td></tr><tr><td>Ácido carboxílico Alexa Fluor 647, éster succinimidilo</td><td>Invitrogen</td><td>A20006</td><td></td></tr><tr><td>Filtros centrífugos Amicon Ultra-0.5 ml</td><td>Millipore</td><td>UFC501096</td><td>corte de 10 kDa</td></tr><tr><td>Clorhidrato de aminoguanidina</td><td>Acros Organics</td><td>36891-0250</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Fisher</td><td>A74-500</td><td></td></tr><tr><td>Azul Brillante de Coomassie R-250</td><td>Fisher</td><td>BP101-25</td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Acros Organics</td><td>42285-1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>MP Biomedicals</td><td>157574</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Fisher</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Fisher</td><td>09-801K</td><td>Grado P5</td></tr><tr><td>FITC anti-murino CD31</td><td>BioLegend</td><td>102406</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra</td><td>Invitrogen</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>sal sódica del ácido L-ascórbico</td><td>Acros Organics</td><td>35268-0050</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>A412P-4</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Láminas para microscopio</td><td>Fisher</td><td>12-544-3</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos para microscopio</td><td>VWR</td><td>48366-277</td><td></td></tr><tr><td>tampón MOPS</td><td>Invitrogen</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-mal</td><td>Nanocs</td><td>PG1-ML-2k</td><td>PM 2000</td></tr><tr><td>mPEG-N₃</td><td>Nanocs</td><td>PG1-AZ-5k</td><td>PM 5000</td></tr><tr><td>mPEG-NHS</td><td>Nanocs</td><td>PG1-SC-5k</td><td>PM 5000</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green 488 éster succinimidilo *isómero 6*</td><td>Invitrogen</td><td>O-6149</td><td></td></tr><tr><td>ácido p-toluenosulfónico monohidrato</td><td>Acros Organics</td><td>13902-0050</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato dipotásico</td><td>Fisher</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato monobásico de potasio</td><td>Fisher</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>acetato de sodio</td><td>Fisher</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Nitrito de sodio</td><td>Acros Organics</td><td>42435-0050</td><td></td></tr><tr><td>Sulfito de sodio</td><td>Amresco</td><td>0628-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Fisher</td><td>S6-500</td><td></td></tr><tr><td>rejilla para microscopía electrónica de transmisión</td><td>Ted Pella</td><td>FCF-400Cu</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Tritón X-100</td><td>EMD Chemicals</td><td>TX1568-1</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercapto&amp;#8211;etanol</td><td>Fisher</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;fuerte&gt;Cultivo de tejidos&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Suero bovino fetal</td><td>Invitrogen</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Fisher</td><td>0267110</td><td></td></tr><tr><td>Células HT-29</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-080</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Invitrogen</td><td>31800-089</td><td></td></tr><tr><td>Frascos para cultivo de tejidos</td><td>Corning</td><td>431080</td><td>175 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Azul de tripano</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30084.01</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, 0,05 % (1X) con EDTA 4Na, líquido</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;fuerte&gt;Estudios con animales&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Dieta para roedores con 18 % de proteína</td><td>Harlan Teklad</td><td>Teklad Global 2018S</td><td>Dieta libre de alfalfa</td></tr><tr><td>Jeringa para insulina</td><td>BD Biosciences</td><td>329410</td><td>28 gauge</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter</td><td>AHN3637</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de membrana basal Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>ratones NCR nu/nu</td><td></td><td></td><td>Escuela CWRU&lt;br/&gt; de Medicina Instalaciones Centrales de Animales Atímicos y Xenoinjertos</td></tr><tr><td>Jeringa estéril</td><td>BD Biosciences</td><td>305196</td><td>18 1/2 gauge</td></tr><tr><td>Tissue-Tek CRYO-OCT Compound</td><td>Andwin Scientific</td><td>4583</td><td></td></tr></tbody></table>

las nanopartículas virales para<em&gt; en vivo</em&gt; imágenes de tumores

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

El uso de nanomateriales tiene el potencial de revolucionar la medicina y ciencia de los materiales. Actualmente, un número de diferentes nanopartículas están siendo investigados para aplicaciones en la formación de imágenes y terapia. Nanopartículas virales (VNPs) derivados de plantas pueden ser considerados como auto-ensambladas bionanomaterials con tamaños definidos y formas. Los virus de plantas bajo investigación en el laboratorio de Steinmetz incluyen partículas icosaédricas formadas por virus del mosaico del caupí (CPMV) y el virus del mosaico de Brome (BMV), ambos de los cuales son 30 nm de diámetro. También estamos desarrollando estructuras en forma de varilla y filamentosas derivados de los virus de las plantas siguientes: virus del mosaico del tabaco (TMV), que forma varillas rígidas con unas dimensiones de 300 nm por 18 nm, y Potato virus X (PVX), que forman partículas filamentosas 515 nm de longitud y 13 nm de ancho (se remite al lector a las refs. 1 y 2 para obtener más información sobre VNPs). <p class="jove_content"&gt; Desde el punto de un científico de materiales de vista, VNPs son bloques de construcción atractivos por varias razones: las partículas son monodispersas, se puede producir con facilidad a gran escala en planta, son excepcionalmente estables, y biocompatible. También, VNPs son &quot;programables&quot; unidades, que pueden ser específicamente diseñados mediante modificación genética o métodos químicos bioconjugación 3. La estructura de VNPs se conoce a resolución atómica, y modificaciones pueden llevarse a cabo con precisión espacial a nivel atómico 4, un nivel de control que no se puede lograr utilizando nanomateriales sintéticos con estado actual de la técnica de las tecnologías. En este trabajo se describe la propagación de CPMV, PVX, TMV, y la BMV en Vigna ungiuculata y plantas de Nicotiana benthamiana. Protocolos de extracción y purificación para cada VNP se dan. Métodos para la caracterización de purificado y VNPs químicamente marcados se describen. En este estudio, nos centramos en chetiquetado emical de VNPs con fluoróforos (por ejemplo, Alexa Fluor 647) y polietilenglicol (PEG). Los colorantes de facilitar el seguimiento y la detección de los VNPs 5-10, y PEG reduce la inmunogenicidad de las nanopartículas proteináceos al tiempo que mejora su farmacocinética 8,11. Demostramos tumor homing de VNPs PEGilados utilizando un modelo de ratón xenograft tumor. Una combinación de imágenes de fluorescencia de tejidos ex vivo mediante Maestro del sistema de imágenes, la cuantificación de fluorescencia en tejidos homogeneizados, y la microscopía confocal se utiliza para estudiar la biodistribución. VNPs se eliminan a través del sistema reticuloendotelial (RES); tumor homing se logra pasivamente a través del aumento de la permeabilidad y retención (EPR) efecto 12. La nanotecnología VNP es un potente plug-and-play de tecnología para el tratamiento de la imagen y sitios de la enfermedad in vivo. Seguimos desarrollando VNPs para llevar cargas de drogas y restos de formación de imágenes clínicamente relevantes, así como ligandos específicos de tejido aorientar receptores moleculares sobreexpresa en el cáncer y la enfermedad cardiovascular.

<img alt="Análisis comparativo del crecimiento vegetal; configuración experimental, estudio de la variación del color de las hojas, método de clorosis." src="/files/ftp_upload/4352/4352fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figura 1"> 
 Figura 1. Plantas infectadas con virus vegetales. Plantas de Vigna unguiculata infectadas con CPMV (A). Plantas de Nicotiana benthamiana infectadas con PVX (B), TMV (C) y BMV (D). Las imágenes se to...

Nanopartículas de plantas virales (VNPs) son prometedoras plataformas para aplicaciones en biomedicina. A continuación, se describen los procedimientos para la propagación de plantas VNP, purificación, caracterización y bioconjugación. Finalmente, mostramos la aplicación de VNPs para la recalada del tumor y la formación de imágenes mediante un modelo de xenotrasplante de ratón y de imágenes de fluorescencia.

Las nanopartículas virales para<em&gt; En vivo</em&gt; Imágenes de tumores

El uso de nanomateriales tiene el potencial de revolucionar la ciencia de materiales y la medicina. Actualmente, se están empleando diversas nanopartículas...

El objetivo general de este procedimiento es estudiar in vivo la localización tumoral y la biodistribución de nanopartículas virales marcadas con fluorescencia. En modelos de tumor murinos, primero propague y purifique el virus, luego conjuge los colorantes y el PEG a las partículas. Después de caracterizar las partículas funcionalizadas, proceda a inyectarlas en ratones con xenoinjertos tumorales.Los resultados del imagenológico maestro, la intensidad de fluorescencia, las mediciones de homogeneidad tisular y la inmunofluorescencia muestran la localización de las nanopartículas virales en el tumor y diversos órganos a lo largo del cuerpo. Plataforma. Las nanopartículas o BMP son plataformas prometedoras para aplicaciones en biomedicina. Aquí describimos los procedimientos para PLA VMP, propagación, purificación, caracterización y conjugación intestinal.Finalmente, mostramos la aplicación de V mps para el direccionamiento tumoral y la obtención de imágenes mediante un modelo de injerto malino y técnicas de imagenología por fluorescencia. Actualmente, se están investigando varios tipos de nanopartículas diferentes para aplicaciones en imagenología y terapia. Las principales ventajas

viral-nanoparticles-for-in-vivo-tumor-imaging

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Se presenta un nuevo enfoque para cuantificar la localización de las nanopartículas en los vasos sanguíneos de los tumores humanos transplantados con dinámica y en tiempo real de imágenes intravital en un modelo de embrión aviar.

Evaluación de la absorción de nanopartículas en los tumores en tiempo real utilizando intravital imagen

Fuente: Kim, B. D., et al. Entrega de nanopartículas de una carga útil de oligonucleótidos en un modelo animal de glioblastoma multiforme. J. Vis. Exp. (2024)Este video demuestra la inyección intravenosa de nanopartículas terapéuticas en un ratón portador de glioblastoma. El método permite la administración dirigida a través de la barrera hematoencefálica y admite imágenes no invasivas para evaluar la biodistribución de nanopartículas y la eficacia terapéutica en tumores cerebrales.

Administración intravenosa de nanopartículas terapéuticas en un modelo de glioblastoma murino

El video muestra un método de imagen de fluorescencia para la localización de anticuerpos in vivo en un modelo de xenoinjerto tumoral de ratón. Consiste en la inyección de células tumorales en un ratón para generar xenoinjertos sólidos debajo de la piel. La inyección posterior de anticuerpos fluorescentes confirma la localización específica a través de señales de fluorescencia mejoradas dentro del xenoinjerto tumoral.

Imágenes de fluorescencia in vivo para localizar anticuerpos en un modelo de xenoinjerto tumoral de ratón

Este video muestra una técnica que involucra un radioinmunoconjugado para la obtención de imágenes in vivo de un tumor en un modelo de ratón. Tras la inyección del radioinmunoconjugado, los anticuerpos del conjugado se unen a un antígeno de membrana específico en las células cancerosas. El radiotrazador del conjugado emite positrones que interactúan con los electrones vecinos para producir energía, que es detectada por un escáner de tomografía por emisión de positrones (PET) para crear una...

Una técnica de imagen PET in vivo para detectar tumores en un modelo murino utilizando anticuerpos radiomarcados

Este artículo detalla los procedimientos para el análisis de imágenes ópticas de las nanopartículas de tumor específico, Herdox. En particular, se describe aquí el uso detallada del dispositivo de formación de imágenes multimodo para la detección de tumor de la orientación y la evaluación de la penetración del tumor.

Análisis de la proteína viral dirigida Nanopartículas Entregado a tumores HER2 +

Este protocolo describe los pasos necesarios para realizar la validación ex vivo de experimentos de imágenes de xenoinjertos de fluorescencia de infrarrojo cercano in vivo en ratones utilizando nanocuerpos marcados con fluoróforos y anticuerpos convencionales.

Validación de nanocuerpo y basados ​​en anticuerpos<em&gt; En Vivo</em&gt; Experimentos tumor de xenoinjerto NIRF-de formación de imágenes en ratones utilizando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Citometría de flujo y microscopía

La escasa comprensión del rendimiento in vivo de las nanomedicinas obstaculiza su traslación clínica. Aquí se describen los procedimientos para evaluar el comportamiento in vivo de los nanomedicamentos contra el cáncer a nivel sistémico, tisular, unicelular y subcelular en ratones inmunocompetentes portadores de tumores. Este enfoque puede ayudar a los investigadores a identificar nanomedicamentos prometedores contra el cáncer para su traslación clínica.

Un procedimiento adecuado para evaluar la<em&gt; En Vivo</em&gt; Rendimiento de cáncer Nanomedicinas

Se describe un protocolo para la preclínica en vivo rastreo de metástasis del cáncer. Se basa en un reportero con radionúclidos-fluorescencia combina el sodio yoduro symporter, detectado por tetrafluoroborato de no invasivo [18F]-PET y una proteína fluorescente para la confirmación de racionalización ex vivo . El método es aplicable para la preclínica en vivo de la célula de seguimiento más allá de la biología del tumor.

Gen reportero de radionúclido-fluorescencia de imagen para seguir la progresión del Tumor en modelos de roedores Tumor

Aquí, presentamos métodos detallados para la preparación y evaluación de la vacuna nasal autoensamblada para tumores de nanoemulsión in vitro e in vivo.

Preparación, características, toxicidad y evaluación de la eficacia de la vacuna nasal autoensamblada para tumores de nanoemulsión in vitro e in vivo

Presentamos un enfoque novedoso para la microscopía de dos fotones de la administración tumoral de nanopartículas de óxido de hierro marcadas con fluorescencia al glioblastoma en un modelo de ratón.

Microscopía intravital de dos fotones de glioblastoma en un modelo murino

La barrera hematoencefálica es un obstáculo importante en la administración de terapias para el glioblastoma, una enfermedad para la que no hay cura. Aquí, reportamos una nano plataforma terapéutica de óxido de hierro guiada por imágenes in vivo que puede eludir esta barrera fisiológica en virtud de su tamaño y acumularse en el tumor.

Entrega de nanopartículas de una carga útil de oligonucleótidos en un modelo animal de glioblastoma multiforme

Aprende a propagar y purificar nanopartículas virales de plantas para imágenes de tumores en modelos murinos con xenoinjertos. Este método permite evaluar la biodistribución y localización tumoral mediante marcaje fluorescente.

Las nanopartículas virales para

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