Name: Genoma escala supresiones de genes en Streptococcus sanguinis Por PCR de alto rendimiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 7 s
Description: Aprende a generar deleciones de genes a escala genómica en Streptococcus sanguinis mediante PCR de alto rendimiento. Este método permite estudiar funciones genéticas bacterianas con eficiencia y precisión en microbiología.

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Este trabajo fue apoyado por becas R01DE018138 de los Institutos Nacionales de Salud (PX) y, en parte, por la Virginia Commonwealth University Programa Presidencial de Incentivos de Investigación (PRIP) 144602-3 (PX). Agradecemos a los Dres. Lei Chen, Yuetan Dou y Wang Xiaojing para ayudar con la construcción de mutantes del genoma de ancho. Agradecemos también a la facilidad de la base de ADN en la Universidad Virginia Commonwealth University para la secuenciación del ADN.

1. Primer Diseño <ol><li> Los cebadores se diseñan utilizando en los guiones de las casas basado en el S. sanguinis SK36 secuencia del genoma. Tres conjuntos de cebadores, F1/R1, F2/R2, y F3/R3 están diseñados para la amplificación de la 1-kb secuencia arriba del gen diana, la aphA-3 gen que codifica la resistencia a la kanamicina (Km r) proteína 3 y 1 el -kb aguas abajo secuencia del gen diana, respectivamente (Figura 1). Entre estos cebadores, F1 y R3 están diseñados usando ePrimer3 en la suite de programas de EMBOSS ( <a href="http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html" target="_blank">http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html</a> ) para amplificar las regiones flanqueantes aguas arriba o aguas abajo de la diana gen. Cebadores específicos de genes, R1 y F3, se han diseñado basándose en el 5 &#39;y 3&#39; secuencias del gen diana. Cebadores R1 y F3 contiene 25-bp secuencias de adaptador en su extremo 5 &#39;que son complementarias a la aphA-3gen. Las temperaturas de fusión de cada cebador fueron diseñados para ser lo más cercano posible a 60 ° C para permitir el uso de una temperatura de recocido uniforme para todas las reacciones de PCR en 96-y formato. </li><li> F1, R1, R3 F3 y cebadores se sintetizan en placas de 96 pocillos con base en una orden de genes. Cada placa contiene un tipo de cebadores en el orden mismo gen. Diluir los cebadores en 96-y la placa de cebador de trabajo a una concentración final de 10 mM para la amplificación por PCR utilizando una pipeta multicanal. </li></ol> 2. De alto rendimiento PCR amplificación y purificación <ol><li> Para alto rendimiento amplificar 1-kb aguas arriba o aguas abajo de la diana S. genes sanguinis, montar una mezcla de cóctel PCR en hielo en un tubo cónico de 15-ml que contiene 1640 l ddH 2 O, 250 l 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 200 l de 10 mM de mezcla dNTP, 100 l de 50 mM MgSO 4, 100 l de 10 ng / l S. sanguinis SK36 de ADN genómico y 10 l Platinum Taq ADN polymerase alta fidelidad y la transferencia de 23 l de la mezcla en cada pocillo en placas de 96 pocillos PCR usando una pipeta multicanal. Transferir 1 l de cada F1 y R1 (o F3 y R3) a partir de los 10 mM de trabajo placas de cebadores para la placa de PCR usando una pipeta multicanal. Sellar la placa de PCR y realizar la amplificación a 94 ° C durante 1 min, y 30 ciclos de 94 ° C durante 30 seg, 54 ° C durante 30 seg y 68 ° C durante 1,5 min. </li><li> Preparar un 1% en gel de agarosa que contengan bromuro de etidio con 48 pozos de ajuste de carga pipeta multicanal. Mezclar 4 l producto de PCR con 1 l de tampón de carga 5xDNA en placa de 96 pocillos y cargar las muestras en un gel de agarosa utilizando una pipeta multicanal 10-l. Ejecutar la electroforesis a 135 V durante 30 min. Examine la banda en el gel bajo UVP documentación y sistema de análisis. </li><li> Purificar los productos de PCR por PureLink 96 kit de purificación de PCR usando centrifugación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para eluir el ADN, añadir 40 l estéril ddH 2 O para el bienestar de la bncontrar plato. </li><li> Escoger al azar varios amplicones purificados en la placa para examinar las concentraciones de ADN utilizando espectrofotómetro NanoDrop. Ajustar la concentración de los amplicones en la placa a ~ 10 ng / ul. </li><li> Un plásmido que contiene kilometros casete r es digerido usando EcoR I como molde de PCR. El plásmido digerido se purificó por kit de purificación de PCR QIAquick y el ADN del plásmido lineal se ajusta a la concentración de ADN final de 10 ng / ul. Ensamble mezcla 25 l para amplicón kilometros casete r incluyendo 16.4 l O ddH 2, 2,5 l 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 l de 10 mM dNTP mezcla, 1 l de 50 mM Mg SO 4, 1 l de 10 mM F2, 1 l de 10 mM R2, 1 l de ADN plásmido lineal y 0,1 l de platino Taq ADN polimerasa de alta fidelidad. Realizar la amplificación de PCR a 94 ° C durante 1 min, y 30 ciclos de 94 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg y 68 ° C durante 1 min. Examine el producto de la PCR por electroforesis en gel de agarosa al 1%. Poola mayor parte de la amplificación de casete de 10 kilometros r individuo PCR purificado con el kit de purificación de PCR QIAquick. Ajustar la concentración de amplicón a 10 ng / ul. </li><li> Para obtener la última lineal amplicón PCR recombinante, tres amplicones de PCR se combinan con cada l 1 (en cantidades casi iguales-molar) en una placa de PCR así como la plantilla para la PCR. Otros componentes de la PCR se añade incluyendo 14.4 l O ddH 2, 2,5 l 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 l de 10 mM dNTP mezcla, 1 l de 50 mM Mg SO 4, 1 l de 10 mM F1, 1 l de 10 R3 mu M, 0,1 l Platinum Taq DNA polimerasa de alta fidelidad. Amplificación por PCR se realizó a 94 º C durante 2 min, 30 ciclos de 94 ° C durante 30 seg 55 ° C durante 30 seg y 68 ° C durante 3,5 min, y finalmente 68 ° C durante 4 min. </li><li> Examinar los amplicones de PCR en gel de agarosa. Purificar y cuantificar los amplicones de la PCR como se describe anteriormente. Congelar los recombinados amplicones de la PCR a -20 ° C. </li></ol> 3. ComCélulas Preparación competente <ol><li> Caldo Todd Hewitt se preparó, pH ajustado a 7,6 con NaOH 10 N, se calienta a ebullición y después se enfrió a temperatura ambiente y se esterilizó usando poliestireno 0,22 micras filtro 4. Añadir 300 l caballo inactivado por calor suero (concentración final de 2,5%) a 11,7 ml de caldo Todd Hewitt en 15-ml tubo cónico para compensar TH + HS medio. TH alícuota + HS medio a 2 ml y 10 ml en tubos. </li><li> Inocular 5 l de existencias S. sanguinis SK36 congelado a -80 ° C en 2 ml de medio de TH + HS e incubar el cultivo durante la noche con tapado herméticamente a 37 º C, acompañada de pre-incubación de la 10 ml-TH + tubo HS. </li><li> Después de toda la noche, transferir 50 cultura l en 10 ml TH + HS y se incuba el tubo a 37 º C durante 3 h (correspondiente a OD 660 de 0.07 hasta 0.08), de usar inmediatamente para la transformación. </li></ol> 4. Celular Transformación y selección de antibióticos <ol><li> Añadir 2 l de 70 ng S. sanguinis SK36 competenciatencia péptido estimulante (CSP) y 2 l lineal de amplificación de PCR recombinante (~ 50 ng) a tubos Eppendorf de 96 pocillos bloque y los pre-calentamiento a 37 º C. Transferir 330 l de 3 hr-incubado SK36 cultura en cada tubo. Incubar a 37 ° C durante 1 hr. Reemplazar con ADN estéril O ddH 2 como control. </li><li> Colocar el bloque de hielo y se extendió en 100 l de cada transformación en infusión de cerebro corazón (BHI) placa de agar con 500 mg / ml de kanamicina. Incubar las placas a 37 ° C durante 2 días bajo condiciones microaeróbicas. </li></ol> 5. Confirmación mutante y almacenamiento <ol><li> Para cada mutante de reemplazo, escoger al azar hasta 2 colonias individuales, inocular la colonia en 5 ml de BHI que contenía 500 ug / ml de kanamicina y se incuba el inóculo microaerobically durante la noche a 37 ° C. Criopreservar cada cultivo en 30% de glicerol a -80 ° C </li><li> Para examinar si el mutante que contiene el reemplazo de genes de esperar, realizar la PCR de colonias para cada mutante utilizando F1 y R3cebadores en placas de 96 pocillos PCR. Acerca de 1-l cultivo de una noche de colonia individual se utiliza como el molde de ADN en 25-l PCR-amplificación de la reacción. PCR se realizó a 94 º C durante 5 min, 35 ciclos de 94 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg y 68 ° C durante 3,5 min, y finalmente 68 ° C durante 4 min. </li><li> Para identificar con precisión doble banda mutantes o contaminante amplificación PCR, examine la amplificación de PCR mediante electroforesis durante 4 horas a&gt; 12 cm de largo 2% en gel de agarosa con tinción de bromuro de etidio. Bajo esta condición, la electroforesis en gel de agarosa, los amplicones con ≥ 100 pb se diferencia claramente identificados. Cuando las bandas resultantes de la amplificación de la casete r kilometros y el gen de tipo salvaje se prevé que difieren en &lt;100 pb, se utiliza un cebador T1 interna para determinar si un gen de tipo salvaje puede ser detectada por PCR. </li><li> Para confirmar aún más la eliminación, los amplicones se purificó por PureLink 96 kit de purificación de PCR y se secuenciaron usando el cebador P1 cualse une a la casete r kilometros. Mantener sólo mutantes correctos confirmados por secuenciación. </li></ol>

<ol><li>Sassetti, C. M., Boyd, D. H., Rubin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+mycobacterial+growth+defined+by+high+density+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis.</a> Mol. Microbiol. 48, 77-84 (2003).</li>
<li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+Bacillus+subtilis+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Essential Bacillus subtilis genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4678-4683 (2003).</li>
<li>Trieu-Cuot, P., Courvalin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+the+Streptococcus+faecalis+plasmid+gene+encoding+the+3%275%22-aminoglycoside+phosphotransferase+type+III%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3'5"-aminoglycoside phosphotransferase type III.</a> Gene. 23, 331-341 (1983).</li>
<li>Paik, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+virulence+determinants+for+endocarditis+in+Streptococcus+sanguinis+by+signature-tagged+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Identification of virulence determinants for endocarditis in Streptococcus sanguinis by signature-tagged mutagenesis.</a> Infect. Immun. 73, 6064-6074 (2005).</li>
<li>Lukomski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonpolar+inactivation+of+the+hypervariable+streptococcal+inhibitor+of+complement+gene+%28sic%29+in+serotype+M1+Streptococcus+pyogenes+significantly+decreases+mouse+mucosal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Nonpolar inactivation of the hypervariable streptococcal inhibitor of complement gene (sic) in serotype M1 Streptococcus pyogenes significantly decreases mouse mucosal colonization.</a> Infect. Immun. 68, 535-542 (2000).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol. Syst. Biol. 2, (2006).</li>
<li>de Berardinis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+collection+of+single-gene+deletion+mutants+of+Acinetobacter+baylyi+ADP1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 174(2008).</li>
<li>Rodriguez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+molecular+characterization+of+genetic+competence+in+Streptococcus+sanguinis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oral.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Physiological and molecular characterization of genetic competence in Streptococcus sanguinis.</a> Mol. Oral. Microbiol. 26, 99-116 (2011).</li>
<li>Perry, D., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Streptococcus+mutans+Infect%5BTitle%5D)+AND+%22Immun%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Streptococcus mutans Infect.</a> Immun. 32, 1295-1297 (1981).</li>
<li>Pakula, R., Walczak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+nature+of+competence+of+transformable+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">On the nature of competence of transformable streptococci.</a> J. Gen. Microbiol. 31, 125-133 (1963).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li>
<li>Xu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+essential+gene+identification+in+Streptococcus+sanguinis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Genome-wide essential gene identification in Streptococcus sanguinis.</a> Sci. Rep. 1, (2011).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Para minimizar los posibles efectos polares de la sustitución de un gen diana con el gen exógeno antibióticos en los genes vecinos, dos pasos se toman mientras imprimación inicial de diseñar. Para la mayoría de los genes suprimidos, la cebadores R1 y F3 están diseñadas para eliminar la región de codificación de 6 pb después del codón de inicio a 30 pb antes del codón de parada. Los últimos 30 pares de bases se mantienen para proteger potencial sitio de unión ribosómica utilizado por el gen corriente abajo adyacente. La ...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Nombres</strong</td&gt;<td<strong&gt; Empresa</strong</td&gt;<td<strong&gt; Catálogo #</strong</td&gt;<td<strong&gt; Comentarios (opcional)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer F2</td&gt;<td&gt; Integrated DNA Tecnologías</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; TGACTAACTAGGAGGAATAAATG<br/&gt; GCTAAAATGAGAATAT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer R2</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA<br/&gt; CAATTCATCCAGT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer F2P</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GATAAACCCAGCGAACCATTTGA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer P1</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer P2</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cebador 5 &#39;end_R1_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cebador 5 &#39;end_F3_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cebador 5 &#39;end_R1p_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; CSP</td&gt;<td&gt; Synprep</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; Secuencia: NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ADN polimerasa</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11304-102</td&gt;<td&gt; Platinum Taq ADN polimerasa de alta fidelidad</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EcoRI</td&gt;<td&gt; New England Biolabs Inc</td&gt;<tdR0101S&gt;</td&gt;<td&gt; Enzima de restricción</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Agar</td&gt;<td&gt; Bioanalytical americano</td&gt;<td&gt; AB01185</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Agarosa</td&gt;<td&gt; Promega</td&gt;<td&gt; V3125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BHI</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 237500</td&gt;<td&gt; Infusión de cerebro y corazón</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; El suero de caballo</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; SH3007403</td&gt;<td&gt; El suero de caballo</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Km</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; BP906-5</td&gt;<td&gt; Kanamicina</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TH caldo</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 249240</td&gt;<td&gt; Todd Hewitt caldo</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 96 PureLink</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; K310096</td&gt;<td&gt; PureLink 96 kit de purificación de PCR</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; QIAquick</td&gt;<td&gt; Qiagen</td&gt;<td&gt; 28106</td&gt;<td&gt; QIAquick PCR purification kit</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Filtro</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt; 431117</td&gt;<td&gt; 0,22 micras filtro de poliestireno</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sistema Anoxomat</td&gt;<td&gt; Mart Microbiología bv</td&gt;<td&gt; Anoxomat Mark II</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Centrífuga de sobremesa</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 75004377</td&gt;<td&gt; Sorvall Legend RT Plus rotor para microplacas</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Gel Documentación</td&gt;<td&gt; UVP LLC</td&gt;<td&gt; BioDoc-It 210</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Incubadora</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; 11-690-625D</td&gt;<td&gt; Isotemp</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Labnet de Gel XL</td&gt;<td&gt; Labnet</td&gt;<td&gt; E0160</td&gt;<td&gt; Labnet de Gel XL</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Microcentrífuga</td&gt;<td&gt; Eppendorf</td&gt;<td&gt; 22621408</td&gt;<td&gt; Microcentrífuga 5415 R</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pipetas multicanal</td&gt;<td&gt; Thermo Scientfic</td&gt;<td&gt; 4661040, 4661020</td&gt;<td&gt; Finnpipette F1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Thermal Cycler</td&gt;<td&gt; Applied Biosystems Inc.</td&gt;<td&gt; N805-0200</td&gt;<td&gt; GeneAmp PCR system 9700</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

genoma escala supresiones de genes en<em&gt; streptococcus sanguinis</em&gt; por pcr de alto rendimiento

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Mutagénesis de transposones y deleción de un solo gen son dos métodos aplicados en knockout de genes en todo el genoma en 1,2 bacterias. Aunque mutagénesis de transposones consume menos tiempo, menos costoso, y no requiere la información completa del genoma, hay dos puntos débiles en este método: (1) la posibilidad de una mutantes dispares en la biblioteca mixta mutante que contra-selecciona mutantes con competencia disminuido; y (2) la posibilidad de la inactivación parcial del gen mediante el cual los genes no totalmente perder su función después de la inserción de un transposón. De un solo gen análisis de deleción puede compensar los inconvenientes asociados con la mutagénesis de transposones. Para mejorar la eficiencia de todo el genoma deleción del gen individual, tratamos de establecer una técnica de alto rendimiento para todo el genoma deleción del gen único usando Streptococcus sanguinis como organismo modelo. Cada supresión construcción génica en S. sanguinis genoma está diseñado para comprender 1-Kb aguas arriba del gen diana, el gen aphA-3, proteína que codifica resistencia a la kanamicina, y 1-kb aguas abajo del gen diana. Tres conjuntos de cebadores F1/R1, F2/R2, y F3/R3, respectivamente, se diseñaron y sintetizaron en un formato de placa de 96 pocillos para PCR-amplificaciones de los tres componentes de cada construcción de deleción. Cebadores R1 y F3 contiene 25-bp secuencias que son complementarias a las regiones del gen aphA-3 en su extremo 5 &#39;. A gran escala amplificación por PCR del gen aphA-3 se realiza una vez para crear todas las construcciones de deleción de un solo gen. El promotor del gen aphA-3 está inicialmente excluidos para minimizar el potencial efecto polar de casete de kanamicina. Para crear las construcciones de deleción de genes, de alto rendimiento de la amplificación por PCR y la purificación se realizan en un formato de placa de 96 pocillos. Un amplicón de PCR recombinante lineal para cada gen de supresión se hace a través de cuatro reacciones de PCR de alta fidelidad utilizando ADN polimerasa. El expon inicialfase de crecimiento preferencial de S. sanguinis cultivadas en caldo Todd Hewitt suplementado con 2,5% de suero de caballo inactivado se utiliza para aumentar la competencia para la transformación de la PCR recombinante construcciones. Bajo esta condición, hasta el 20% de S. células sanguinis se puede transformar usando ~ 50 ng de ADN. Sobre la base de este enfoque, 2048 mutantes con deleción de un solo gen se obtuvieron en última instancia de los 2.270 genes en S. sanguinis excluyendo cuatro ORFs de genes contenida enteramente dentro de otros ORFs en S. sanguinis SK36 y 218 genes esenciales potenciales. La técnica en la creación de construcciones de genes de deleción es de alto rendimiento y podría ser fácil de usar en todo el genoma deleciones de genes individuales para cualquier bacteria transformables.

Después de la amplificación por PCR usando los cebadores F1 y R1, R3 y F3 y, aproximadamente 1-kb aguas arriba y aguas abajo de cada S. sanguinis gen se obtuvieron en formato de 96-pocillos, respectivamente (Figura 2A). Bajo nuestras condiciones de PCR y usando cebadores diseñados, un producto específico se amplificó a partir de S. sanguinis de ADN genómico en cada reacción de PCR. Este resultado indica los cebadores eran altamente específicos para los objetivos de S. sanguinis.</e...

Un genoma único método eficaz mutación del gen se ha establecido utilizando<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Como un organismo modelo. Este método se logra a través de PCR recombinante de alto rendimiento y transformaciones.

Genoma escala supresiones de genes en<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de alto rendimiento

La mutagénesis por transposones y la deleción de un solo gen son dos métodos aplicados para la inactivación génica (knockout) a escala genómica en bacterias 1,2. Aunque la mutagénesis por transposones es...

El objetivo general de este procedimiento es realizar deleciones genómicas a nivel de un solo gen en Streptococcus sanguinis mediante PCR de alto rendimiento. Esto se logra primero obteniendo tres amplicones mediante amplificación por PCR de alto rendimiento, incluyendo el gen de resistencia a antibióticos, así como las secuencias de ADN upstream y downstream del gen diana. El segundo paso consiste en obtener el amplicón recombinante lineal por PCR utilizando tres amplicones de PCR como plantillas.A continuación, se preparan las células competentes de s sanguineus. El paso final consiste en transformar el amplicón recombinante lineal de PCR en células competentes de s sanguineus. Finalmente, se utiliza la amplificación por PCR del gen colon A y la secuenciación de ADN para verificar los mutantes correctos.La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos agotados como el knockout con plásmido suicida es que este método puede generar directamente un mutante con deleción a nivel del genoma mediante alta productividad. Los cebadores para PCR pueden diseñarse y sintetizarse según se describe en el protocolo escrito, utilizando secuencias internas basadas en la secuencia del g

genome-wide-gene-deletions-streptococcus-sanguinis-high-throughput

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Sistemáticos ya gran escala sintéticos genéticos (gen-gen o epistasis) pantallas de interacción puede ser utilizado para explorar la redundancia genética y la vía de la diafonía. A continuación, se describe un alto rendimiento cuantitativo sintético tecnología de detección genética amplia, denominada eSGA que hemos desarrollado para la aclaración de las relaciones y explorar epistatic interacción en redes...

Mapeo bacterianas redes funcionales y vías en<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Utilizando matrices sintéticas genéticos

El método monstruo verde permite el montaje rápido de deleciones múltiples marcados con un gen reportero que codifica la proteína verde fluorescente. Este método se basa en la conducción de las cepas de levadura a través de ciclos repetidos de surtido sexual de las deleciones y de enriquecimiento basado en la fluorescencia de las células que llevan más deleciones.

El Proceso de Monstruo Verde para la generación de cepas de levadura que llevan deleciones múltiples genes

Fuente: Tomás, J. M., et al. Generación de mutantes nulos para dilucidar el papel de las glicosiltransferasas bacterianas en la motilidad bacteriana. J. Vis. Exp. (2022).Este video demuestra la amplificación dependiente del iniciador de un plásmido suicida en E. coli. El plásmido, que porta un gen de resistencia a los antibióticos, se replica solo en presencia de una proteína iniciadora codificada por el huésped. Después de la electroporación e incubación en medio de recuperación, la mezcla se...

Amplificación de un plásmido suicida en un huésped bacteriano

CRISPR/Cas9 es un sistema robusto para producir disrupción de genes y elementos genéticos. En este trabajo describimos un protocolo para la creación eficiente de deleciones genómicas en líneas celulares de mamíferos utilizando CRISPR/Cas9.

Generación de deleciones genómicas en líneas celulares de mamíferos a través de CRISPR / Cas9

La validación experimental de la actividad potenciadora se aborda mejor mediante el análisis de pérdida de función. Aquí se presenta un protocolo eficiente que utiliza la deleción mediada por CRISPR/Cas9 para estudiar la regulación específica de alelos de la transcripción génica en células ES F1 que contienen un genoma híbrido (Mus musculus129 x Mus castaneus).

La generación de CRISPR / Cas9 mediada monoallelic deleciones para estudiar la función del reforzador en las células madre embrionarias de ratón

Este manuscrito describe un ensayo de teléfono digital de dos PCR que se puede utilizar para cuantificar simultáneamente Enterococcus spp. Y los marcadores genéticos HF183 como indicadores de contaminación fecal general y asociada a humanos en aguas de recreo.

Un ensayo de PCR digital de dos vías para la cuantificación simultánea de la<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Y el marcador asociado HF183-fecal humana en las aguas

Se describe un método fácil, rápido y relativamente barato para la generación de gene-disrupted Streptococcus mutans cepas; Esta técnica puede ser adaptada para la generación de gene-disrupted cepas de varias especies.

Generación de un gen interrumpido Streptococcus mutans cepa sin gen clonación

Aquí presentamos un protocolo para el uso de preexistentes antibiótico resistencia-cassette borrado construcciones como base para la fabricación de mutantes de deleción en otras cepas de e. coli . Tales mutaciones de la canceladura pueden ser movilizados e inserta en el correspondiente locus de una cepa receptora mediante transducción de bacteriófago P1.

Producción de canceladuras del Gene en Escherichia coli por transducción de P1 con casetes de resistencia a los antibióticos

Aquí se describe un método simple para la purificación de un producto genético en Streptococcus mutans. Esta técnica puede ser ventajosa en la purificación de proteínas, especialmente proteínas de membrana y proteínas de alta masa molecular, y se puede utilizar con varias otras especies bacterianas.

Purificación de una proteína de masa molecular alta en Streptococcus mutans

Aquí se describe un método para la eliminación de genes dirigida y sin marcadores en Chlamydia trachomatis mediante mutagénesis de intercambio alélico de casete floxed, FLAEM.

Eliminación de genes sin marcadores por Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis en Chlamydia trachomatis

Aquí, describimos la construcción de mutantes nulos de Aeromonas en glicosiltransferasas específicas o regiones que contienen glicosiltransferasas, los ensayos de motilidad y la purificación de flagelos realizados para establecer la participación y función de sus enzimas codificadas en la biosíntesis de un glicano, así como el papel de este glicano en la patogénesis bacteriana.

Generación de mutantes nulos para dilucidar el papel de las glicosiltransferasas bacterianas en la motilidad bacteriana

Aprende a generar deleciones de genes a escala genómica en Streptococcus sanguinis mediante PCR de alto rendimiento. Este método permite estudiar funciones genéticas bacterianas con eficiencia y precisión en microbiología.

Genoma escala supresiones de genes en

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