Genoma escala supresiones de genes en

El objetivo general de este procedimiento es realizar deleciones genómicas a nivel de un solo gen en Streptococcus sanguinis mediante PCR de alto rendimiento. Esto se logra primero obteniendo tres amplicones mediante amplificación por PCR de alto rendimiento, incluyendo el gen de resistencia a antibióticos, así como las secuencias de ADN upstream y downstream del gen diana. El segundo paso consiste en obtener el amplicón recombinante lineal por PCR utilizando tres amplicones de PCR como plantillas.

A continuación, se preparan las células competentes de s sanguineus. El paso final consiste en transformar el amplicón recombinante lineal de PCR en células competentes de s sanguineus. Finalmente, se utiliza la amplificación por PCR del gen colon A y la secuenciación de ADN para verificar los mutantes correctos.

La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos agotados como el knockout con plásmido suicida es que este método puede generar directamente un mutante con deleción a nivel del genoma mediante alta productividad. Los cebadores para PCR pueden diseñarse y sintetizarse según se describe en el protocolo escrito, utilizando secuencias internas basadas en la secuencia del genoma de Streptococcus sanguineus SK36. Se diseñaron tres conjuntos de cebadores para la amplificación de la secuencia ascendente de un kilobase del gen diana, el gen ENC que codifica la proteína de resistencia a la anfotericina A, y la secuencia descendente de un kilobase del gen diana.

Primers específicos para el gen. R uno y F tres están diseñados basándose en las secuencias del extremo cinco primo y tres primo del gen diana para amplificar de forma de alto rendimiento la región de un kilobase ubicada aguas arriba o aguas abajo de los genes s sanguineos. Primero, ensamblar una mezcla de cóctel de PCR en hielo en un tubo cónico de 15 mililitros.

Consulte el texto para los componentes de la mezcla de PCR que contiene ADN genómico sanguíneo; transfiera 23 microlitros de la mezcla a cada pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal. Para la secuencia ascendente del gen diana, transfiera un microlitro de cada uno de los cebadores F1 y R1 procedentes de placas de cebadores de trabajo a 10 micromolar a la placa de PCR utilizando la pipeta multicanal. Haga lo mismo con los cebadores F3 y R3 para amplificar la secuencia descendente del gen diana. Selle la placa de PCR y realice la amplificación a 94 grados Celsius durante un minuto, seguido de 30 ciclos a 94 grados Celsius durante 30 segundos.

54 grados Celsius durante 30 segundos y 68 grados Celsius durante 1,5 minutos. Después de la amplificación, prepare un gel de agarosa al 1 % que contenga bromuro de etidio con 48 pocillos adecuados para la carga con pipeta multicanal. Mezcle cuatro microlitros del producto de PCR con un microlitro de tampón de carga de ADN 5X.

En una placa de 96 pocillos, cargue las muestras en un gel de agarosa utilizando pipetas multicanal de 10 microlitros. Realice la electroforesis a 135 voltios durante 30 minutos. Examine la banda en el gel bajo un sistema de documentación y análisis UVP.

Purifique los productos de PCR mediante el kit de purificación PCR Pure Link 96 utilizando centrifugación, según las instrucciones del fabricante para eludir el ADN. Añada 40 microlitros de agua estéril doblemente destilada a cada pocillo de la placa de unión. Seleccione aleatoriamente varios amplicones purificados en la placa para examinar las concentraciones de ADN.

Utilizando un espectrofotómetro NanoDrop, ajuste la concentración de los amplicones en la placa a aproximadamente 10 nanogramos por microlitro. A continuación, use eco R uno para digerir un plásmido que contiene la resistencia a la kanamicina gisette, de modo que pueda servir como molde para la PCR. Purifique el plásmido digerido utilizando el kit de purificación rápida kayak para PCR y ajuste el ADN del plásmido lineal a una concentración final de ADN de 10 nanogramos por microlitro.

Prepare una mezcla de PCR de 25 microlitros para el amplicón del cassette de resistencia a la kanamicina, incluyendo los cebadores F dos y R dos, como se indica en el procedimiento escrito. Acompañando este video, proceda a realizar la amplificación por PCR según las instrucciones aquí proporcionadas. Para examinar el producto de PCR, realice electroforesis en gel en un gel de agarosa al 1 %.

Luego, reúna un lote de los amplicones del casete de resistencia a canamicina procedentes de 10 individuos purificados por PCR. Ajuste la concentración del amplicón a 10 nanogramos por microlitro. El aspecto más difícil de este procedimiento consiste en obtener el amplicón lineal competente final a partir de sus tres amplicones de PCR.

Para garantizar el éxito, se ajustan los tres cebadores de PCR a cantidades casi iguales. Combine un microlitro de cada uno de los tres cebadores de PCR de 10 nanogramos por microlitro en una placa de PCR, así como la plantilla de PCR. Luego prepare la mezcla de PCR, incluyendo los cebadores F1 y R3 según se indica en el procedimiento escrito.

A continuación, realice la amplificación por PCR de las muestras. Examine los AMPLICONES de PCR en un gel de agarosa tras la purificación y cuantificación de los amplicones de PCR. Como antes, congele los amplicones de PCR recombinados a menos veinte grados Celsius.

Para comenzar, prepare el medio de Todd Hewitt y suero de caballo según las instrucciones del procedimiento escrito que acompaña a este video; alícuote dos mililitros de medio y 10 mililitros de medio en dos tubos cónicos de 15 mililitros. Inocule cinco microlitros del stock descongelado de s sanguine SK 36, que había sido congelado a -80 grados Celsius, en dos mililitros de medio. Incube la cultura, bien tapada, durante la noche a 37 grados Celsius.

Además, precultive el tubo de medio de 10 mililitros bajo las mismas condiciones tras la incubación nocturna. Transfiera 50 microlitros de la cultura al tubo de medio de 10 mililitros. Incube el tubo a 37 grados Celsius durante tres horas.

Inmediatamente después de la incubación, agregue dos microlitros de péptido estimulador de la competencia sanguineous de 70 nanogramos, SK 36 y dos microlitros de amplicón recombinante lineal de PCR a tubos einor colocados en una placa de 96 pocillos y precálquelas a 37 grados Celsius. Transfiera 330 microlitros de la cultura de SK 36 incubada durante tres horas a cada tubo. Sustituya el ADN por agua doblemente destilada estéril como control.

Incubar los tubos a 37 grados Celsius durante una hora tras la incubación. Colocar la placa sobre hielo y distribuir 100 microlitros de cada transformación en placas de agar de infusión cerebral y cardíaca o BHI con 500 microgramos por mililitro de canamicina. Incubar las placas a 37 grados Celsius durante dos días en condiciones microaeróbicas. Para cada mutante de reemplazo, seleccionar aleatoriamente dos colonias individuales e inocular cada colonia en cinco mililitros de BHI que contenga 500 microgramos por mililitro de canamicina. Incubar cada inóculo durante la noche a 37 grados Celsius en condiciones microanaeróbicas.

Criopreservar cada cultivo en glicerol al 30 % a menos 80 grados Celsius. Para examinar si el mutante contiene el reemplazo génico esperado, realizar PCR de colonias para cada mutante utilizando los cebadores F1 y R3 en una placa de PCR de 96 pocillos.

Utilice aproximadamente un microlitro de cultivo nocturno de cada colonia individual como molde de ADN en una reacción de amplificación por PCR de 25 microlitros. Proceda a realizar la amplificación por PCR para confirmar el reemplazo del gen mutante y así identificar con precisión mutantes con doble banda o amplicones contaminantes. Examine el amplicón de PCR mediante electroforesis en gel durante cuatro horas en un gel de más de 12 centímetros de longitud.

Un gel de agarosa al 2% con tinción de bromuro de etidio bajo esta condición de electroforesis en gel de agarosa permite identificar claramente cualquier amplicón con una diferencia mayor o igual a 100 pares de bases. Alternativamente, cuando se espera que las bandas resultantes de la amplificación del casete de resistencia a la kanamicina y del gen silvestre difieran en menos de 100 pares de bases, utilice un cebador interno T1 del gen diana para determinar si el gen silvestre puede detectarse mediante PCR.

Para confirmar aún más la eliminación, purifique los amplicones mediante el kit de purificación de PCR PureLink 96 y secuencie utilizando el cebador P uno, que se une al casete de resistencia a la kanamicina; conserve solo los mutantes correctos confirmados por secuenciación tras la amplificación por PCR utilizando los cebadores F1 y R uno para la secuencia ascendente y F tres y R tres para la secuencia descendente. Aproximadamente un kilobase ascendente y descendente de cada gen de s. sanguinis se obtuvo en formato de 96 pocillos bajo las condiciones de PCR y utilizando los cebadores diseñados.

Se amplificó un producto específico a partir del ADN genómico de s sanguineous en cada reacción de PCR, lo que indicó que los cebadores eran altamente específicos para los objetivos de s sanguine mediante la reamplificación por PCR utilizando los cebadores F1 y R tres y tres amplicones como plantillas de ADN. Se generaron construcciones de PCR recombinante lineales con alto rendimiento. En una placa de 96 pocillos compuesta por una región ubicada aguas arriba de cada gen diana, un cassette cany y una región ubicada aguas abajo de cada gen diana en ese orden, las construcciones de PCR recombinante se transformaron luego en s sanguine SK 36 y se seleccionaron mediante cany en placas de agar BHI.

Para la mayoría de las transformaciones, se obtuvieron más de 1000 colonias en cada placa tras una incubación microaerófila de dos días. Cuando estas colonias se amplificaron por PCR utilizando F1 y R tres, se observó una única banda de ADN correspondiente al tamaño esperado del mutante mediante electroforesis en gel al intentar eliminar genes esenciales potenciales. No se deberían obtener colonias en la mayoría de las transformaciones al eliminar algunos genes esenciales.

Sin embargo, aún se obtuvieron colonias tras la transformación, y tras la amplificación por PCR de estas colonias utilizando los cebadores F1 y R, aparecieron tres bandas de ADN 2D correspondientes al tamaño esperado del mutante y al tamaño del tipo silvestre, tal como se reveló mediante electroforesis en gel. Para algunos mutantes, el tamaño esperado del mutante y el tamaño del tipo silvestre del amplicón de PCR eran demasiado similares para ser separados en un gel de agarosa largo. En este caso, se diseñó un cebador interno T1 del gen diana basado en la secuencia del gen de tipo silvestre.

Se realizó PCR utilizando el cebador interno T uno y el cebador F1. Se utilizó el tipo salvaje SK 36 como cepa control positivo para esta PCR. Si se amplificó una banda del tamaño esperado a partir del mutante utilizando el cebador interno, el gen se identificó como un gen esencial.

Dado que la presencia del casete de canamicina en el mutante se confirmó previamente mediante secuenciación de ADN utilizando el cebador P uno. Según este protocolo, se recolectaron 2048 mutantes de genes no esenciales de S. sanguineus. Excluyendo los cuatro marcos de lectura abierta contenidos completamente dentro de otros marcos de lectura abierta.

Se identificaron 218 genes, esenciales para la supervivencia de s sanguine, bajo las condiciones experimentales. Después de ver estos videos, creo que deberías tener una buena comprensión de cómo realizar un análisis del genoma completo. Las ionizaciones genéticas utilizan PCR de alto rendimiento.