Name: Genoma escala supresiones de genes en Streptococcus sanguinis Por PCR de alto rendimiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 7 s
Description: Aprende a generar deleciones de genes a escala genómica en Streptococcus sanguinis mediante PCR de alto rendimiento. Este método permite estudiar funciones genéticas bacterianas con eficiencia y precisión en microbiología.

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Este trabajo fue apoyado por becas R01DE018138 de los Institutos Nacionales de Salud (PX) y, en parte, por la Virginia Commonwealth University Programa Presidencial de Incentivos de Investigación (PRIP) 144602-3 (PX). Agradecemos a los Dres. Lei Chen, Yuetan Dou y Wang Xiaojing para ayudar con la construcción de mutantes del genoma de ancho. Agradecemos también a la facilidad de la base de ADN en la Universidad Virginia Commonwealth University para la secuenciación del ADN.

1. Primer Diseño <ol><li> Los cebadores se diseñan utilizando en los guiones de las casas basado en el S. sanguinis SK36 secuencia del genoma. Tres conjuntos de cebadores, F1/R1, F2/R2, y F3/R3 están diseñados para la amplificación de la 1-kb secuencia arriba del gen diana, la aphA-3 gen que codifica la resistencia a la kanamicina (Km r) proteína 3 y 1 el -kb aguas abajo secuencia del gen diana, respectivamente (Figura 1). Entre estos cebadores, F1 y R3 están diseñados usando ePrimer3 en la suite de programas de EMBOSS ( <a href="http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html" target="_blank">http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html</a> ) para amplificar las regiones flanqueantes aguas arriba o aguas abajo de la diana gen. Cebadores específicos de genes, R1 y F3, se han diseñado basándose en el 5 &#39;y 3&#39; secuencias del gen diana. Cebadores R1 y F3 contiene 25-bp secuencias de adaptador en su extremo 5 &#39;que son complementarias a la aphA-3gen. Las temperaturas de fusión de cada cebador fueron diseñados para ser lo más cercano posible a 60 ° C para permitir el uso de una temperatura de recocido uniforme para todas las reacciones de PCR en 96-y formato. </li><li> F1, R1, R3 F3 y cebadores se sintetizan en placas de 96 pocillos con base en una orden de genes. Cada placa contiene un tipo de cebadores en el orden mismo gen. Diluir los cebadores en 96-y la placa de cebador de trabajo a una concentración final de 10 mM para la amplificación por PCR utilizando una pipeta multicanal. </li></ol> 2. De alto rendimiento PCR amplificación y purificación <ol><li> Para alto rendimiento amplificar 1-kb aguas arriba o aguas abajo de la diana S. genes sanguinis, montar una mezcla de cóctel PCR en hielo en un tubo cónico de 15-ml que contiene 1640 l ddH 2 O, 250 l 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 200 l de 10 mM de mezcla dNTP, 100 l de 50 mM MgSO 4, 100 l de 10 ng / l S. sanguinis SK36 de ADN genómico y 10 l Platinum Taq ADN polymerase alta fidelidad y la transferencia de 23 l de la mezcla en cada pocillo en placas de 96 pocillos PCR usando una pipeta multicanal. Transferir 1 l de cada F1 y R1 (o F3 y R3) a partir de los 10 mM de trabajo placas de cebadores para la placa de PCR usando una pipeta multicanal. Sellar la placa de PCR y realizar la amplificación a 94 ° C durante 1 min, y 30 ciclos de 94 ° C durante 30 seg, 54 ° C durante 30 seg y 68 ° C durante 1,5 min. </li><li> Preparar un 1% en gel de agarosa que contengan bromuro de etidio con 48 pozos de ajuste de carga pipeta multicanal. Mezclar 4 l producto de PCR con 1 l de tampón de carga 5xDNA en placa de 96 pocillos y cargar las muestras en un gel de agarosa utilizando una pipeta multicanal 10-l. Ejecutar la electroforesis a 135 V durante 30 min. Examine la banda en el gel bajo UVP documentación y sistema de análisis. </li><li> Purificar los productos de PCR por PureLink 96 kit de purificación de PCR usando centrifugación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para eluir el ADN, añadir 40 l estéril ddH 2 O para el bienestar de la bncontrar plato. </li><li> Escoger al azar varios amplicones purificados en la placa para examinar las concentraciones de ADN utilizando espectrofotómetro NanoDrop. Ajustar la concentración de los amplicones en la placa a ~ 10 ng / ul. </li><li> Un plásmido que contiene kilometros casete r es digerido usando EcoR I como molde de PCR. El plásmido digerido se purificó por kit de purificación de PCR QIAquick y el ADN del plásmido lineal se ajusta a la concentración de ADN final de 10 ng / ul. Ensamble mezcla 25 l para amplicón kilometros casete r incluyendo 16.4 l O ddH 2, 2,5 l 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 l de 10 mM dNTP mezcla, 1 l de 50 mM Mg SO 4, 1 l de 10 mM F2, 1 l de 10 mM R2, 1 l de ADN plásmido lineal y 0,1 l de platino Taq ADN polimerasa de alta fidelidad. Realizar la amplificación de PCR a 94 ° C durante 1 min, y 30 ciclos de 94 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg y 68 ° C durante 1 min. Examine el producto de la PCR por electroforesis en gel de agarosa al 1%. Poola mayor parte de la amplificación de casete de 10 kilometros r individuo PCR purificado con el kit de purificación de PCR QIAquick. Ajustar la concentración de amplicón a 10 ng / ul. </li><li> Para obtener la última lineal amplicón PCR recombinante, tres amplicones de PCR se combinan con cada l 1 (en cantidades casi iguales-molar) en una placa de PCR así como la plantilla para la PCR. Otros componentes de la PCR se añade incluyendo 14.4 l O ddH 2, 2,5 l 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 l de 10 mM dNTP mezcla, 1 l de 50 mM Mg SO 4, 1 l de 10 mM F1, 1 l de 10 R3 mu M, 0,1 l Platinum Taq DNA polimerasa de alta fidelidad. Amplificación por PCR se realizó a 94 º C durante 2 min, 30 ciclos de 94 ° C durante 30 seg 55 ° C durante 30 seg y 68 ° C durante 3,5 min, y finalmente 68 ° C durante 4 min. </li><li> Examinar los amplicones de PCR en gel de agarosa. Purificar y cuantificar los amplicones de la PCR como se describe anteriormente. Congelar los recombinados amplicones de la PCR a -20 ° C. </li></ol> 3. ComCélulas Preparación competente <ol><li> Caldo Todd Hewitt se preparó, pH ajustado a 7,6 con NaOH 10 N, se calienta a ebullición y después se enfrió a temperatura ambiente y se esterilizó usando poliestireno 0,22 micras filtro 4. Añadir 300 l caballo inactivado por calor suero (concentración final de 2,5%) a 11,7 ml de caldo Todd Hewitt en 15-ml tubo cónico para compensar TH + HS medio. TH alícuota + HS medio a 2 ml y 10 ml en tubos. </li><li> Inocular 5 l de existencias S. sanguinis SK36 congelado a -80 ° C en 2 ml de medio de TH + HS e incubar el cultivo durante la noche con tapado herméticamente a 37 º C, acompañada de pre-incubación de la 10 ml-TH + tubo HS. </li><li> Después de toda la noche, transferir 50 cultura l en 10 ml TH + HS y se incuba el tubo a 37 º C durante 3 h (correspondiente a OD 660 de 0.07 hasta 0.08), de usar inmediatamente para la transformación. </li></ol> 4. Celular Transformación y selección de antibióticos <ol><li> Añadir 2 l de 70 ng S. sanguinis SK36 competenciatencia péptido estimulante (CSP) y 2 l lineal de amplificación de PCR recombinante (~ 50 ng) a tubos Eppendorf de 96 pocillos bloque y los pre-calentamiento a 37 º C. Transferir 330 l de 3 hr-incubado SK36 cultura en cada tubo. Incubar a 37 ° C durante 1 hr. Reemplazar con ADN estéril O ddH 2 como control. </li><li> Colocar el bloque de hielo y se extendió en 100 l de cada transformación en infusión de cerebro corazón (BHI) placa de agar con 500 mg / ml de kanamicina. Incubar las placas a 37 ° C durante 2 días bajo condiciones microaeróbicas. </li></ol> 5. Confirmación mutante y almacenamiento <ol><li> Para cada mutante de reemplazo, escoger al azar hasta 2 colonias individuales, inocular la colonia en 5 ml de BHI que contenía 500 ug / ml de kanamicina y se incuba el inóculo microaerobically durante la noche a 37 ° C. Criopreservar cada cultivo en 30% de glicerol a -80 ° C </li><li> Para examinar si el mutante que contiene el reemplazo de genes de esperar, realizar la PCR de colonias para cada mutante utilizando F1 y R3cebadores en placas de 96 pocillos PCR. Acerca de 1-l cultivo de una noche de colonia individual se utiliza como el molde de ADN en 25-l PCR-amplificación de la reacción. PCR se realizó a 94 º C durante 5 min, 35 ciclos de 94 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg y 68 ° C durante 3,5 min, y finalmente 68 ° C durante 4 min. </li><li> Para identificar con precisión doble banda mutantes o contaminante amplificación PCR, examine la amplificación de PCR mediante electroforesis durante 4 horas a&gt; 12 cm de largo 2% en gel de agarosa con tinción de bromuro de etidio. Bajo esta condición, la electroforesis en gel de agarosa, los amplicones con ≥ 100 pb se diferencia claramente identificados. Cuando las bandas resultantes de la amplificación de la casete r kilometros y el gen de tipo salvaje se prevé que difieren en &lt;100 pb, se utiliza un cebador T1 interna para determinar si un gen de tipo salvaje puede ser detectada por PCR. </li><li> Para confirmar aún más la eliminación, los amplicones se purificó por PureLink 96 kit de purificación de PCR y se secuenciaron usando el cebador P1 cualse une a la casete r kilometros. Mantener sólo mutantes correctos confirmados por secuenciación. </li></ol>

<ol><li>Sassetti, C. M., Boyd, D. H., Rubin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+mycobacterial+growth+defined+by+high+density+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis.</a> Mol. Microbiol. 48, 77-84 (2003).</li>
<li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+Bacillus+subtilis+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Essential Bacillus subtilis genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4678-4683 (2003).</li>
<li>Trieu-Cuot, P., Courvalin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+the+Streptococcus+faecalis+plasmid+gene+encoding+the+3%275%22-aminoglycoside+phosphotransferase+type+III%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3'5"-aminoglycoside phosphotransferase type III.</a> Gene. 23, 331-341 (1983).</li>
<li>Paik, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+virulence+determinants+for+endocarditis+in+Streptococcus+sanguinis+by+signature-tagged+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Identification of virulence determinants for endocarditis in Streptococcus sanguinis by signature-tagged mutagenesis.</a> Infect. Immun. 73, 6064-6074 (2005).</li>
<li>Lukomski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonpolar+inactivation+of+the+hypervariable+streptococcal+inhibitor+of+complement+gene+%28sic%29+in+serotype+M1+Streptococcus+pyogenes+significantly+decreases+mouse+mucosal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Nonpolar inactivation of the hypervariable streptococcal inhibitor of complement gene (sic) in serotype M1 Streptococcus pyogenes significantly decreases mouse mucosal colonization.</a> Infect. Immun. 68, 535-542 (2000).</li>
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<li>de Berardinis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+collection+of+single-gene+deletion+mutants+of+Acinetobacter+baylyi+ADP1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 174(2008).</li>
<li>Rodriguez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+molecular+characterization+of+genetic+competence+in+Streptococcus+sanguinis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oral.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Physiological and molecular characterization of genetic competence in Streptococcus sanguinis.</a> Mol. Oral. Microbiol. 26, 99-116 (2011).</li>
<li>Perry, D., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Streptococcus+mutans+Infect%5BTitle%5D)+AND+%22Immun%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Streptococcus mutans Infect.</a> Immun. 32, 1295-1297 (1981).</li>
<li>Pakula, R., Walczak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+nature+of+competence+of+transformable+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">On the nature of competence of transformable streptococci.</a> J. Gen. Microbiol. 31, 125-133 (1963).</li>
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<li>Xu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+essential+gene+identification+in+Streptococcus+sanguinis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Genome-wide essential gene identification in Streptococcus sanguinis.</a> Sci. Rep. 1, (2011).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Para minimizar los posibles efectos polares de la sustitución de un gen diana con el gen exógeno antibióticos en los genes vecinos, dos pasos se toman mientras imprimación inicial de diseñar. Para la mayoría de los genes suprimidos, la cebadores R1 y F3 están diseñadas para eliminar la región de codificación de 6 pb después del codón de inicio a 30 pb antes del codón de parada. Los últimos 30 pares de bases se mantienen para proteger potencial sitio de unión ribosómica utilizado por el gen corriente abajo adyacente. La ...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Nombres</strong</td&gt;<td<strong&gt; Empresa</strong</td&gt;<td<strong&gt; Catálogo #</strong</td&gt;<td<strong&gt; Comentarios (opcional)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer F2</td&gt;<td&gt; Integrated DNA Tecnologías</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; TGACTAACTAGGAGGAATAAATG<br/&gt; GCTAAAATGAGAATAT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer R2</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA<br/&gt; CAATTCATCCAGT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer F2P</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GATAAACCCAGCGAACCATTTGA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer P1</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer P2</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cebador 5 &#39;end_R1_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cebador 5 &#39;end_F3_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cebador 5 &#39;end_R1p_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; CSP</td&gt;<td&gt; Synprep</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; Secuencia: NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ADN polimerasa</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11304-102</td&gt;<td&gt; Platinum Taq ADN polimerasa de alta fidelidad</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EcoRI</td&gt;<td&gt; New England Biolabs Inc</td&gt;<tdR0101S&gt;</td&gt;<td&gt; Enzima de restricción</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Agar</td&gt;<td&gt; Bioanalytical americano</td&gt;<td&gt; AB01185</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Agarosa</td&gt;<td&gt; Promega</td&gt;<td&gt; V3125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BHI</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 237500</td&gt;<td&gt; Infusión de cerebro y corazón</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; El suero de caballo</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; SH3007403</td&gt;<td&gt; El suero de caballo</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Km</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; BP906-5</td&gt;<td&gt; Kanamicina</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TH caldo</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 249240</td&gt;<td&gt; Todd Hewitt caldo</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 96 PureLink</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; K310096</td&gt;<td&gt; PureLink 96 kit de purificación de PCR</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; QIAquick</td&gt;<td&gt; Qiagen</td&gt;<td&gt; 28106</td&gt;<td&gt; QIAquick PCR purification kit</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Filtro</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt; 431117</td&gt;<td&gt; 0,22 micras filtro de poliestireno</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sistema Anoxomat</td&gt;<td&gt; Mart Microbiología bv</td&gt;<td&gt; Anoxomat Mark II</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Centrífuga de sobremesa</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 75004377</td&gt;<td&gt; Sorvall Legend RT Plus rotor para microplacas</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Gel Documentación</td&gt;<td&gt; UVP LLC</td&gt;<td&gt; BioDoc-It 210</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Incubadora</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; 11-690-625D</td&gt;<td&gt; Isotemp</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Labnet de Gel XL</td&gt;<td&gt; Labnet</td&gt;<td&gt; E0160</td&gt;<td&gt; Labnet de Gel XL</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Microcentrífuga</td&gt;<td&gt; Eppendorf</td&gt;<td&gt; 22621408</td&gt;<td&gt; Microcentrífuga 5415 R</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pipetas multicanal</td&gt;<td&gt; Thermo Scientfic</td&gt;<td&gt; 4661040, 4661020</td&gt;<td&gt; Finnpipette F1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Thermal Cycler</td&gt;<td&gt; Applied Biosystems Inc.</td&gt;<td&gt; N805-0200</td&gt;<td&gt; GeneAmp PCR system 9700</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

genoma escala supresiones de genes en<em&gt; streptococcus sanguinis</em&gt; por pcr de alto rendimiento

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Mutagénesis de transposones y deleción de un solo gen son dos métodos aplicados en knockout de genes en todo el genoma en 1,2 bacterias. Aunque mutagénesis de transposones consume menos tiempo, menos costoso, y no requiere la información completa del genoma, hay dos puntos débiles en este método: (1) la posibilidad de una mutantes dispares en la biblioteca mixta mutante que contra-selecciona mutantes con competencia disminuido; y (2) la posibilidad de la inactivación parcial del gen mediante el cual los genes no totalmente perder su función después de la inserción de un transposón. De un solo gen análisis de deleción puede compensar los inconvenientes asociados con la mutagénesis de transposones. Para mejorar la eficiencia de todo el genoma deleción del gen individual, tratamos de establecer una técnica de alto rendimiento para todo el genoma deleción del gen único usando Streptococcus sanguinis como organismo modelo. Cada supresión construcción génica en S. sanguinis genoma está diseñado para comprender 1-Kb aguas arriba del gen diana, el gen aphA-3, proteína que codifica resistencia a la kanamicina, y 1-kb aguas abajo del gen diana. Tres conjuntos de cebadores F1/R1, F2/R2, y F3/R3, respectivamente, se diseñaron y sintetizaron en un formato de placa de 96 pocillos para PCR-amplificaciones de los tres componentes de cada construcción de deleción. Cebadores R1 y F3 contiene 25-bp secuencias que son complementarias a las regiones del gen aphA-3 en su extremo 5 &#39;. A gran escala amplificación por PCR del gen aphA-3 se realiza una vez para crear todas las construcciones de deleción de un solo gen. El promotor del gen aphA-3 está inicialmente excluidos para minimizar el potencial efecto polar de casete de kanamicina. Para crear las construcciones de deleción de genes, de alto rendimiento de la amplificación por PCR y la purificación se realizan en un formato de placa de 96 pocillos. Un amplicón de PCR recombinante lineal para cada gen de supresión se hace a través de cuatro reacciones de PCR de alta fidelidad utilizando ADN polimerasa. El expon inicialfase de crecimiento preferencial de S. sanguinis cultivadas en caldo Todd Hewitt suplementado con 2,5% de suero de caballo inactivado se utiliza para aumentar la competencia para la transformación de la PCR recombinante construcciones. Bajo esta condición, hasta el 20% de S. células sanguinis se puede transformar usando ~ 50 ng de ADN. Sobre la base de este enfoque, 2048 mutantes con deleción de un solo gen se obtuvieron en última instancia de los 2.270 genes en S. sanguinis excluyendo cuatro ORFs de genes contenida enteramente dentro de otros ORFs en S. sanguinis SK36 y 218 genes esenciales potenciales. La técnica en la creación de construcciones de genes de deleción es de alto rendimiento y podría ser fácil de usar en todo el genoma deleciones de genes individuales para cualquier bacteria transformables.

Después de la amplificación por PCR usando los cebadores F1 y R1, R3 y F3 y, aproximadamente 1-kb aguas arriba y aguas abajo de cada S. sanguinis gen se obtuvieron en formato de 96-pocillos, respectivamente (Figura 2A). Bajo nuestras condiciones de PCR y usando cebadores diseñados, un producto específico se amplificó a partir de S. sanguinis de ADN genómico en cada reacción de PCR. Este resultado indica los cebadores eran altamente específicos para los objetivos de S. sanguinis.</e...

Un genoma único método eficaz mutación del gen se ha establecido utilizando<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Como un organismo modelo. Este método se logra a través de PCR recombinante de alto rendimiento y transformaciones.

Genoma escala supresiones de genes en<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de alto rendimiento

La mutagénesis por transposones y la deleción de un solo gen son dos métodos aplicados para la inactivación génica (knockout) a escala genómica en bacterias 1,2. Aunque la mutagénesis por transposones es...

El objetivo general de este procedimiento es realizar deleciones genómicas a nivel de un solo gen en Streptococcus sanguinis mediante PCR de alto rendimiento. Esto se logra primero obteniendo tres amplicones mediante amplificación por PCR de alto rendimiento, incluyendo el gen de resistencia a antibióticos, así como las secuencias de ADN upstream y downstream del gen diana. El segundo paso consiste en obtener el amplicón recombinante lineal por PCR utilizando tres amplicones de PCR como plantillas.A continuación, se preparan las células competentes de s sanguineus. El paso final consiste en transformar el amplicón recombinante lineal de PCR en células competentes de s sanguineus. Finalmente, se utiliza la amplificación por PCR del gen colon A y la secuenciación de ADN para verificar los mutantes correctos.La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos agotados como el knockout con plásmido suicida es que este método puede generar directamente un mutante con deleción a nivel del genoma mediante alta productividad. Los cebadores para PCR pueden diseñarse y sintetizarse según se describe en el protocolo escrito, utilizando secuencias internas basadas en la secuencia del genoma de Streptococcus sanguineus SK36. Se diseñaron tres conjuntos de cebadores para la amplificación de la secuencia ascendente de un kilobase del gen diana, el gen ENC que codifica la proteína de resistencia a la anfotericina A, y la secuencia descendente de un kilobase del gen diana.Primers específicos para el gen. R uno y F tres están diseñados basándose en las secuencias del extremo cinco primo y tres primo del gen diana para amplificar de forma de alto rendimiento la región de un kilobase ubicada aguas arriba o aguas abajo de los genes s sanguineos. Primero, ensamblar una mezcla de cóctel de PCR en hielo en un tubo cónico de 15 mililitros.Consulte el texto para los componentes de la mezcla de PCR que contiene ADN genómico sanguíneo; transfiera 23 microlitros de la mezcla a cada pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal. Para la secuencia ascendente del gen diana, transfiera un microlitro de cada uno de los cebadores F1 y R1 procedentes de placas de cebadores de trabajo a 10 micromolar a la placa de PCR utilizando la pipeta multicanal. Haga lo mismo con los cebadores F3 y R3 para amplificar la secuencia descendente del gen diana. Selle la placa de PCR y realice la amplificación a 94 grados Celsius durante un minuto, seguido de 30 ciclos a 94 grados Celsius durante 30 segundos.54 grados Celsius durante 30 segundos y 68 grados Celsius durante 1,5 minutos. Después de la amplificación, prepare un gel de agarosa al 1 % que contenga bromuro de etidio con 48 pocillos adecuados para la carga con pipeta multicanal. Mezcle cuatro microlitros del producto de PCR con un microlitro de tampón de carga de ADN 5X.En una placa de 96 pocillos, cargue las muestras en un gel de agarosa utilizando pipetas multicanal de 10 microlitros. Realice la electroforesis a 135 voltios durante 30 minutos. Examine la banda en el gel bajo un sistema de documentación y análisis UVP.Purifique los productos de PCR mediante el kit de purificación PCR Pure Link 96 utilizando centrifugación, según las instrucciones del fabricante para eludir el ADN. Añada 40 microlitros de agua estéril doblemente destilada a cada pocillo de la placa de unión. Seleccione aleatoriamente varios amplicones purificados en la placa para examinar las concentraciones de ADN.Utilizando un espectrofotómetro NanoDrop, ajuste la concentración de los amplicones en la placa a aproximadamente 10 nanogramos por microlitro. A continuación, use eco R uno para digerir un plásmido que contiene la resistencia a la kanamicina gisette, de modo que pueda servir como molde para la PCR. Purifique el plásmido digerido utilizando el kit de purificación rápida kayak para PCR y ajuste el ADN del plásmido lineal a una concentración final de ADN de 10 nanogramos por microlitro.Prepare una mezcla de PCR de 25 microlitros para el amplicón del cassette de resistencia a la kanamicina, incluyendo los cebadores F dos y R dos, como se indica en el procedimiento escrito. Acompañando este video, proceda a realizar la amplificación por PCR según las instrucciones aquí proporcionadas. Para examinar el producto de PCR, realice electroforesis en gel en un gel de agarosa al 1 %.Luego, reúna un lote de los amplicones del casete de resistencia a canamicina procedentes de 10 individuos purificados por PCR. Ajuste la concentración del amplicón a 10 nanogramos por microlitro. El aspecto más difícil de este procedimiento consiste en obtener el amplicón lineal competente final a partir de sus tres amplicones de PCR.Para garantizar el éxito, se ajustan los tres cebadores de PCR a cantidades casi iguales. Combine un microlitro de cada uno de los tres cebadores de PCR de 10 nanogramos por microlitro en una placa de PCR, así como la plantilla de PCR. Luego prepare la mezcla de PCR, incluyendo los cebadores F1 y R3 según se indica en el procedimiento escrito.A continuación, realice la amplificación por PCR de las muestras. Examine los AMPLICONES de PCR en un gel de agarosa tras la purificación y cuantificación de los amplicones de PCR. Como antes, congele los amplicones de PCR recombinados a menos veinte grados Celsius.Para comenzar, prepare el medio de Todd Hewitt y suero de caballo según las instrucciones del procedimiento escrito que acompaña a este video; alícuote dos mililitros de medio y 10 mililitros de medio en dos tubos cónicos de 15 mililitros. Inocule cinco microlitros del stock descongelado de s sanguine SK 36, que había sido congelado a -80 grados Celsius, en dos mililitros de medio. Incube la cultura, bien tapada, durante la noche a 37 grados Celsius.Además, precultive el tubo de medio de 10 mililitros bajo las mismas condiciones tras la incubación nocturna. Transfiera 50 microlitros de la cultura al tubo de medio de 10 mililitros. Incube el tubo a 37 grados Celsius durante tres horas.Inmediatamente después de la incubación, agregue dos microlitros de péptido estimulador de la competencia sanguineous de 70 nanogramos, SK 36 y dos microlitros de amplicón recombinante lineal de PCR a tubos einor colocados en una placa de 96 pocillos y precálquelas a 37 grados Celsius. Transfiera 330 microlitros de la cultura de SK 36 incubada durante tres horas a cada tubo. Sustituya el ADN por agua doblemente destilada estéril como control.Incubar los tubos a 37 grados Celsius durante una hora tras la incubación. Colocar la placa sobre hielo y distribuir 100 microlitros de cada transformación en placas de agar de infusión cerebral y cardíaca o BHI con 500 microgramos por mililitro de canamicina. Incubar las placas a 37 grados Celsius durante dos días en condiciones microaeróbicas. Para cada mutante de reemplazo, seleccionar aleatoriamente dos colonias individuales e inocular cada colonia en cinco mililitros de BHI que contenga 500 microgramos por mililitro de canamicina. Incubar cada inóculo durante la noche a 37 grados Celsius en condiciones microanaeróbicas.Criopreservar cada cultivo en glicerol al 30 % a menos 80 grados Celsius. Para examinar si el mutante contiene el reemplazo génico esperado, realizar PCR de colonias para cada mutante utilizando los cebadores F1 y R3 en una placa de PCR de 96 pocillos.Utilice aproximadamente un microlitro de cultivo nocturno de cada colonia individual como molde de ADN en una reacción de amplificación por PCR de 25 microlitros. Proceda a realizar la amplificación por PCR para confirmar el reemplazo del gen mutante y así identificar con precisión mutantes con doble banda o amplicones contaminantes. Examine el amplicón de PCR mediante electroforesis en gel durante cuatro horas en un gel de más de 12 centímetros de longitud.Un gel de agarosa al 2% con tinción de bromuro de etidio bajo esta condición de electroforesis en gel de agarosa permite identificar claramente cualquier amplicón con una diferencia mayor o igual a 100 pares de bases. Alternativamente, cuando se espera que las bandas resultantes de la amplificación del casete de resistencia a la kanamicina y del gen silvestre difieran en menos de 100 pares de bases, utilice un cebador interno T1 del gen diana para determinar si el gen silvestre puede detectarse mediante PCR.Para confirmar aún más la eliminación, purifique los amplicones mediante el kit de purificación de PCR PureLink 96 y secuencie utilizando el cebador P uno, que se une al casete de resistencia a la kanamicina; conserve solo los mutantes correctos confirmados por secuenciación tras la amplificación por PCR utilizando los cebadores F1 y R uno para la secuencia ascendente y F tres y R tres para la secuencia descendente. Aproximadamente un kilobase ascendente y descendente de cada gen de s. sanguinis se obtuvo en formato de 96 pocillos bajo las condiciones de PCR y utilizando los cebadores diseñados.Se amplificó un producto específico a partir del ADN genómico de s sanguineous en cada reacción de PCR, lo que indicó que los cebadores eran altamente específicos para los objetivos de s sanguine mediante la reamplificación por PCR utilizando los cebadores F1 y R tres y tres amplicones como plantillas de ADN. Se generaron construcciones de PCR recombinante lineales con alto rendimiento. En una placa de 96 pocillos compuesta por una región ubicada aguas arriba de cada gen diana, un cassette cany y una región ubicada aguas abajo de cada gen diana en ese orden, las construcciones de PCR recombinante se transformaron luego en s sanguine SK 36 y se seleccionaron mediante cany en placas de agar BHI.Para la mayoría de las transformaciones, se obtuvieron más de 1000 colonias en cada placa tras una incubación microaerófila de dos días. Cuando estas colonias se amplificaron por PCR utilizando F1 y R tres, se observó una única banda de ADN correspondiente al tamaño esperado del mutante mediante electroforesis en gel al intentar eliminar genes esenciales potenciales. No se deberían obtener colonias en la mayoría de las transformaciones al eliminar algunos genes esenciales.Sin embargo, aún se obtuvieron colonias tras la transformación, y tras la amplificación por PCR de estas colonias utilizando los cebadores F1 y R, aparecieron tres bandas de ADN 2D correspondientes al tamaño esperado del mutante y al tamaño del tipo silvestre, tal como se reveló mediante electroforesis en gel. Para algunos mutantes, el tamaño esperado del mutante y el tamaño del tipo silvestre del amplicón de PCR eran demasiado similares para ser separados en un gel de agarosa largo. En este caso, se diseñó un cebador interno T1 del gen diana basado en la secuencia del gen de tipo silvestre.Se realizó PCR utilizando el cebador interno T uno y el cebador F1. Se utilizó el tipo salvaje SK 36 como cepa control positivo para esta PCR. Si se amplificó una banda del tamaño esperado a partir del mutante utilizando el cebador interno, el gen se identificó como un gen esencial.Dado que la presencia del casete de canamicina en el mutante se confirmó previamente mediante secuenciación de ADN utilizando el cebador P uno. Según este protocolo, se recolectaron 2048 mutantes de genes no esenciales de S. sanguineus. Excluyendo los cuatro marcos de lectura abierta contenidos completamente dentro de otros marcos de lectura abierta.Se identificaron 218 genes, esenciales para la supervivencia de s sanguine, bajo las condiciones experimentales. Después de ver estos videos, creo que deberías tener una buena comprensión de cómo realizar un análisis del genoma completo. Las ionizaciones genéticas utilizan PCR de alto rendimiento.

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