Aislar las células melanocitos como primarios del corazón alfombrillas
29 de septiembre de 2014
En este protocolo, w e identificado una nueva población de células melanocitos como (también conocido como melanocitos cardíacos) en los corazones de los ratones y los seres humanos que contribuyen a la arritmia auricular provoca en ratones.
El objetivo general de este procedimiento es aislar células viables similares a melanocitos cardíacos del corazón de ratón. Esto se logra primero obteniendo corazones de ratones sacrificados. El segundo paso consiste en picar los corazones y disociar las células mediante digestión enzimática y agitación mecánica.
A continuación, la suspensión de células se centrifuga y el precipitado que contiene los cardiomiocitos y las células semejantes a melanocitos se resuspende. El último paso consiste en sembrar y cultivar las células. Las células aisladas finalmente, melanocitos cardíacos semejantes a células, pueden utilizarse para estudios de parche o análisis de microarreglos en respuesta a estímulos fisiopatológicos para evaluar la excitabilidad celular o el estado del transcriptoma.
La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes diseñados para aislar y cultivar los cardiomiocitos es que permite obtener un gran número de células similares a los melanocitos cardíacos viables. Bueno, tuvimos por primera vez la idea de este método cuando descubrimos una nueva población celular en el corazón del ratón y deseamos investigar su fisiología. Para comenzar, prepare dos juegos de instrumentos quirúrgicos esterilizados, uno para la disección de los corazones y otro para la picadura del tejido.
A continuación, prepare los suplementos del medio, pero espere a añadirlos al medio de cultivo hasta justo antes de sembrar las células. Después de preparar el medio de cultivo, filtre la solución para esterilizarla mientras trabaja en una cabina de cultivo de tejidos y almacene el medio a cuatro grados centígrados. Prepare la solución de DNA's agregando 0,05 gramos de DNA's a 100 mililitros de DPBS con 10 % de FBS más antibióticos.
A continuación, prepare una solución de tripsina al 0,5 % añadiendo 0,5 gramos de tripsina a 100 mililitros de DPBS con antibióticos. Por último, reúna el resto del equipo necesario para completar el procedimiento, incluyendo placas de Petri, tubos cónicos de 50 mililitros, filtros celulares de 40 micrones, DPBS con antibióticos, y placas de cultivo de 60 milímetros y 35 milímetros. Tras la eutanasia de crías de ratón neonatales de P cero a P dos, limpie el tórax con alcohol y colóquelas en una placa P dos de 10 centímetros con DPBS. Trabajando bajo un microscopio estereoscópico, abra cuidadosamente la cavidad torácica y extraiga todo el corazón con las aurículas adheridas.
Lave los corazones en DPBS y transfiéralos a una nueva placa de Petri de 10 centímetros. Lleve la placa de Petri con los corazones extraídos a una cabina de cultivo celular y siga técnicas estériles para los siguientes pasos. Primero, lave los corazones tres veces con DPBS estéril más antibióticos.
Coloque los corazones en una placa de cultivo de 60 milímetros y agregue de seis a ocho mililitros de tripsina al 0,5% en solución. A continuación, corte los corazones en trozos pequeños e incube durante 30 minutos a 37 grados Celsius. Una vez finalizada la incubación, aspire la solución resultante de la placa hacia un tubo cónico estéril de 10 mililitros.
Utilizando una pipeta estéril de 10 mililitros, resuspenda rápidamente pero suavemente la solución de 30 a 50 veces, y filtre la suspensión resultante a través de un filtro celular de 40 micrones hacia un nuevo tubo cónico limpio de 50 mililitros. Después de la centrifugación, aspire suavemente el sobrenadante y resuspenda el precipitado restante en seis a ocho mililitros de DPBS estéril. Repita este paso dos veces más.
Después de la tercera lavada tras la centrifugación, drene o aspire cuidadosamente la solución de lavado y resuspenda el precipitado en seis mililitros de medio de cultivo suplementado. A continuación, aspire la solución resuspendida en una pipeta estéril de transferencia y coloque las células en una placa de 35 milímetros. Recolecte las células cardíacas aisladas de tres ratones neonatos tras una incubación nocturna, aspire el medio de cultivo junto con cualquier célula no adherida, luego lave las placas una vez con DPBS, agregue medio fresco a las placas y reemplace el medio.
Cada dos días, las células aisladas de corazones neonatales o embrionarios pueden mantenerse en cultivo hasta por tres semanas, mientras que las células aisladas de corazones adultos pueden mantenerse en cultivo hasta por 10 días. Para aislar células similares a melanocitos del corazón de un ratón adulto, primero lave los corazones extraídos en DPBS estéril que contenga antibióticos en una cabina de cultivo celular. Presione ligeramente el corazón con pinzas de disección curvas para eliminar cualquier sangre residual y luego enjuague el corazón una vez más en DPBS.
A continuación, retire los atrios y el anillo aurículo-ventricular de los corazones y coloque las muestras de tejido extirpado en un recipiente de 35 milímetros. Corte los corazones en trozos pequeños utilizando tijeras curvas y pinzas. Añada de seis a ocho mililitros de tripsina al 0,5% en solución al recipiente e incube a 37 grados Celsius durante 45 a 60 minutos.
Después de la incubación, repita los pasos mostrados anteriormente para obtener una suspensión de células cardíacas adultas y plateras previamente. En este ejemplo, la flecha blanca identifica el melanocito cardíaco en ambos paneles. Observe que sin la ayuda del marcador fluorescente, es difícil identificar y distinguir el melanocito cardíaco de los miocitos auriculares adheridos al recipiente; la punta de flecha azul claro señala células auriculares que no se adhieren bien al recipiente, como se muestra aquí, un melanocito cardíaco sano aislado del corazón de un ratón neonato.
Desarrollan extensos procesos dendríticos y se asemejan estrechamente a los melanocitos cutáneos. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en unas pocas horas si se lleva a cabo correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar células de melanocitos viables del corazón.
Esto será adecuado para el análisis fisiológico y molecular.
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Descripción general
Este protocolo describe el aislamiento de células similares a melanocitos cardíacos a partir de corazones de ratón, que están implicadas en la arritmia auricular. El método consiste en la recolección, picado y digestión enzimática del tejido cardíaco para obtener células viables destinadas a análisis posteriores.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología cardíaca
- Fisiología celular
- Investigación de arritmias
Antecedentes
- Las células similares a melanocitos cardíacos son una población celular novedosa.
- Estas células podrían desempeñar un papel en los desencadenantes de arritmias.
- Comprender su función podría proporcionar información sobre las afecciones cardíacas.
- El aislamiento de estas células permite un estudio detallado de sus propiedades.
Objetivo del estudio
- Aislar células viables similares a melanocitos cardíacos de corazones de ratón.
- Evaluar el papel de estas células en la arritmia auricular.
- Permitir investigaciones adicionales sobre la excitabilidad celular y el estado transcriptómico.
Métodos Utilizados
- Recolección de corazones de ratones sacrificados.
- Fragmentación de corazones y disociación de células mediante digestión enzimática.
- Centrifugación de la suspensión celular para aislar el sedimento.
- Siembra y cultivo de las células aisladas para estudios posteriores.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de células similares a melanocitos cardíacos.
- Las células pueden utilizarse para estudios de parche o análisis de microarreglos.
- Información sobre la excitabilidad celular bajo factores de estrés fisiopatológicos.
- Implicaciones potenciales para comprender los mecanismos de las arritmias auriculares.
Conclusiones
- Las células similares a melanocitos cardíacos constituyen una población significativa en el corazón.
- Podrían contribuir a los desencadenantes de arritmias en ratones.
- Se necesita más investigación para explorar su papel en la salud cardíaca humana.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El aislamiento de células similares a melanocitos cardíacos permite la reducción mecanicista de riesgos asociados a dianas relacionadas con arritmias, al proporcionar un sistema relevante para la enfermedad con el que estudiar la excitabilidad celular y las respuestas transcriptómicas bajo estrés fisiopatológico. Esto apoya los esfuerzos de validación de dianas y de cribado fenotípico en programas de descubrimiento cardiovascular, al ofrecer una población celular purificada para el desarrollo de ensayos y la identificación de compuestos prometedores. El método mejora la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al vincular nuevos fenotipos celulares con resultados funcionales relevantes para los mecanismos de arritmia auricular.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas relacionadas con desencadenantes de arritmias mediante el aislamiento de una población novedosa de células cardíacas.
- Valor operativo: Proporciona una fuente purificada de células para estudios funcionales que aclaran los mecanismos biológicos subyacentes a la excitabilidad celular.
- Valor predictivo: Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al vincular las células similares a melanocitos cardíacos con el potencial arritmogénico en modelos murinos.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Produce células viables similares a melanocitos cardíacos adecuadas para análisis mediante parche de voltaje y microarreglos, lo que permite obtener lecturas fisiológicas cuantitativas.
- Valor operativo: Genera preparaciones celulares reproducibles que pueden sembrarse como poblaciones puras o en co-cultivo con cardiomiocitos para ensayos estandarizados.
- Preparación para ensayos: Proporciona un número suficiente de células para aplicaciones de cribado posterior que evalúen las respuestas celulares frente a factores de estrés fisiopatológicos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Las células aisladas modelan un nuevo factor contribuyente a los desencadenantes de arritmias auriculares en ratones, lo que apoya el desarrollo de modelos preclínicos.
- Continuidad traslacional: Permite el estudio de la excitabilidad celular y el estado del transcriptoma, conectando el descubrimiento con la comprensión mecanicista de los mecanismos de arritmia.
- Avance ajustado al riesgo: Proporciona un sistema para evaluar los efectos de la modulación de dianas sobre fenotipos relacionados con arritmias antes de la inversión preclínica.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método de aislamiento se integra en el continuo de descubrimiento que va desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la selección fenotípica, proporcionando un sistema relevante para la enfermedad que permite evaluar la función de las células cardíacas en las vías de las arritmias.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al aislar una población celular novedosa implicada en los desencadenantes de arritmias auriculares.
- Selección: Permite el desarrollo de ensayos mediante la generación de poblaciones celulares viables y puras adecuadas para análisis electrofisiológicos y transcriptómicos.
- Análisis: Facilita mediciones cuantitativas de los cambios en la excitabilidad celular y en la expresión génica en respuesta a factores de estrés fisiopatológicos.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento inicial con la validación preclínica mediante la modelización de un tipo celular putativo desencadenante de arritmias en un sistema murino.
- Reutilización Empresarial: Establece un protocolo de aislamiento reproducible que puede aplicarse en diversos estudios para generar preparaciones consistentes de células similares a melanocitos cardíacos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reducción del riesgo mecanicista de dianas arrítmicas mediante el acceso a un modelo celular relevante para la enfermedad.
- Valor operativo: Procedimiento estandarizado de aislamiento y siembra que garantiza la reproducibilidad y escalabilidad de la producción celular.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de avance o abandono al reducir la incertidumbre biológica en torno a nuevas poblaciones celulares en la fisiopatología cardíaca.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas vinculadas a mecanismos arrítmicos mediados por células tipo melanocito cardíacas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la disección de tejido cardíaco, disociación enzimática y técnicas de cultivo celular estériles.
- Depende del acceso a corazones de ratón neonatales o adultos, reactivos enzimáticos (tripsina) y filtros celulares para la eliminación de restos celulares.
- Necesita protocolos estandarizados para la preparación y suplementación de medios con el fin de mantener la viabilidad celular entre experimentos.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen el ajuste de los tiempos de incubación enzimática según la madurez del corazón (neonatal frente a adulto) para optimizar el rendimiento.
- Las limitaciones prácticas incluyen la necesidad de marcadores fluorescentes para identificar de forma confiable las células similares a melanocitos cardíacos aisladas debido a la similitud morfológica con los miocitos atriales.
