Un nuevo método para la Cultura y polarizado estimulación de explantes mucosa intestinal humana

El objetivo general del siguiente experimento consiste en imitar la situación in vivo para la estimulación de la mucosa intestinal humana. Esto se logra pegando un cilindro cave en el lado apical del tejido para evitar que el estímulo entre en contacto basolateral. Como segundo paso, se aplica el estímulo, lo que permitirá analizar la respuesta inmune inducida.

A continuación, se retira el estímulo del lado apical del tejido para mantenerlo viable durante 24 a 36 horas. Los resultados obtenidos pueden mostrar efectos diferenciales de diversas cepas probióticas basados en datos de inmunohistoquímica, secreción de citoquinas, análisis de perfiles, entre otros. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la cámara ASIC es que permite el análisis de hasta 20 condiciones al mismo tiempo.

Permite extender el tiempo de cultivo hasta 36 horas y además proporciona suficiente material para diversos análisis de lectura, como análisis de ADN-RNA, inmunohistoquímica, secreción de citoquinas, etc. Aunque este método puede aportar información en el campo de los probióticos, también puede utilizarse en otras tecnologías y para estudiar el efecto de otros inmunomoduladores como los productos biológicos, fármacos antiinflamatorios, entre otros. El tejido de mucosa intestinal de individuos sanos o con enfermedad inflamatoria intestinal debe obtenerse durante una cirugía.

Una vez que se extirpa el espécimen, transfiéralo rápidamente al laboratorio, manteniéndolo frío en HBSS con penicilina-estreptomicina. A continuación, comience por lavar el tejido con tampón y elimine cualquier material mesentérico. Luego, separe la capa de mucosa de la submucosa utilizando tijeras y pinzas estériles, manteniendo el tejido en el tampón HBSS.

En una placa de Petri, no es necesario mantener el tejido completamente sumergido, pero toque la superficie mucosa lo menos posible con la pinza. A continuación, corte la mucosa en tiras de al menos un centímetro de ancho y tan largas como sea posible, utilizando dos escalpelos estériles de manera similar a cómo se corta la comida. Una vez cortada, lave suavemente y limpie la mucosa en HBSS libre de calcio y magnesio.

Finalmente, extienda las tiras de mucosa sobre una placa de Petri con las caras apicales orientadas hacia arriba. Comience preparando DMEM TIS fresco. A continuación, llene una placa de Petri de 10 centímetros con aproximadamente 30 mililitros de F-B-S-N-A y sumerja completamente una rejilla de hierro en la solución.

Mantenga la placa abierta y coloque cilindros de plástico sobre la placa. Cubra. Ahora aspire tres microlitros de pegamento quirúrgico en una pipeta y aplique cuidadosamente el pegamento a uno de los bordes de un cilindro de plástico mientras lo sostiene firmemente con la pinza. A continuación, coloque suavemente el cilindro sobre el lado apical de la mucosa, lo más cerca posible de uno de los bordes de la tira, mientras el pegamento se seca.

Dispense 850 a 1000 microlitros de medio en el pocillo central de la placa de tejido, y apoye la rejilla de hierro sobre los bordes del pocillo central. Con dos escalpelos, corte el exceso de tejido de los bordes del cilindro. Ahora levante suavemente el cilindro con el tejido adherido y coloque el lado basolateral del tejido sobre la rejilla de hierro en el centro de la placa.

A continuación, continúe con la estimulación del tejido. Aplique los estímulos de interés en el centro del cilindro de plástico a la concentración deseada. No perturbe el cilindro ni la superficie mucosa con la punta de la pipeta y cubra uniformemente la superficie interna del cilindro.

Ahora incube el tejido durante hasta tres horas. También es factible una incubación mayor de tres horas utilizando un volumen menor de solución de estímulos. Después de la incubación, retire los estímulos de la superficie apical del tejido, pero no los reemplace con medio fresco.

Añadir medio asfixiaría el tejido. Ahora, llene el frasco de oxígeno con una atmósfera de presión de oxígeno al 100 % durante 24 horas de tiempo de cultivo. Tenga siempre cuidado al manipular el tanque de oxígeno y asegúrese de cerrarlo adecuadamente después de usarlo.

Después de la cultivo de estimulación de 24 horas, use un escalpelo para retirar cuidadosamente el cilindro del tejido raspando suavemente el pegamento. Luego, para ensayos de IHC o inmunofluorescencia, fije el tejido. O bien, para análisis de expresión génica o proteico, congele rápidamente el tejido en nitrógeno líquido.

A continuación, recolecte el medio lateral basal para el perfilado de la secreción de citoquinas. Después de esto, transfiera el medio a un tubo de centrífuga y peletee los residuos utilizando el protocolo descrito. La mucosa intestinal humana sana y con EII se cultivó durante al menos 24 horas preservando el bienestar de los tejidos.

Esto solo fue posible si al menos el 85 % del tiempo de cultivo transcurrió en un ambiente rico en oxígeno. La mucosa cultivada convencionalmente no tiene tan buen desempeño. Luego, el tejido sano fue estimulado con *Salmonella* invasiva proinflamatoria.

Dos horas después de la inoculación, ya era visible la destrucción de la capa superior del epitelio en comparación con los controles. Después de 24 horas, la degeneración se volvió bastante extensa. Una discusión más profunda sobre aplicaciones experimentales con resultados publicados se encuentra en el manuscrito escrito tras su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores que trabajan en el campo de la gastroenterología estudien la interacción entre el hospedador y los microorganismos en el tracto gastrointestinal. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo mantener una mucosa intestinal humana en cultivo y estimularla tópicamente. No olvide que trabajar con muestras humanas puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar las precauciones necesarias al realizar este procedimiento.