Resonancia magnética funcional (fMRI) con estimulación auditiva en Songbirds

El objetivo general de este procedimiento es demostrar un protocolo optimizado para la visualización exitosa de la percepción y el procesamiento del sonido en regiones auditivas y de control del canto en el cerebro del pájaro cantor. Mediante resonancia magnética funcional, esto se logra primero preparando estímulos auditivos de buena calidad, que pueden incorporarse a un paradigma de bloques alternados (encendido-apagado) para presentarlos al pájaro durante el escaneo mediante resonancia magnética funcional o FMRI. El segundo paso consiste en preparar al pájaro para el escaneo anestesiándolo primero y luego colocándolo sobre una camilla adaptada para animales, la cual posteriormente se coloca dentro del orificio del escáner de RM. A continuación, pueden adquirirse imágenes de FMRI durante la estimulación auditiva.

El paso final consiste en preprocesar los datos de RM adquiridos, incluyendo la normalización de las imágenes al atlas del pinzón cebra. En última instancia, se utiliza un análisis estadístico basado en vóxeles para permitir la visualización de los resultados obtenidos y localizar las activaciones cerebrales inducidas por los estímulos auditivos. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos más comúnmente utilizados en la investigación con suimangas, como la electrofisiología, la histología y las técnicas de mapeo molecular, es que la RM funcional es un método no invasivo in vivo, que permite estudiar al mismo sujeto a lo largo del tiempo y abordar todo el cerebro simultáneamente sin necesidad de hipótesis previas sobre la localización de los sustratos neuronales implicados en el proceso investigado.

Las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque la implementación de la resonancia magnética funcional en aves es muy diferente y mucho más desafiante que el uso de este mismo método en humanos o roedores. Esto no se debe únicamente al pequeño tamaño del cerebro de estos sujetos, sino también al hecho de que su cráneo está compuesto por numerosas cavidades aéreas, lo que induce artefactos de susceptibilidad; al utilizar una secuencia de eco de espín menos susceptible a estos artefactos en comparación con una secuencia de gradiente, podemos realizar imágenes funcionales de todo el cerebro del pájaro cantor con una especificidad espacial muy buena. El orificio del escáner es un espacio confinado que puede distorsionar los estímulos auditivos.

Por lo tanto, para comenzar la preparación de este protocolo, registre los estímulos sonoros mientras se reproducen dentro del orificio del sistema de RM de siete T utilizando un micrófono de fibra óptica y verifique las distorsiones del sistema de RM utilizado. Aquí podemos observar las frecuencias realzadas y suprimidas, tal como se muestra en las grabaciones de ruido blanco realizadas fuera del escáner y en la ubicación de la cabeza del ave dentro del orificio del imán. Para compensar este realce artificial, aplique una función ecualizadora a cada estímulo utilizando el software Wave Lab para el montaje mostrado.

En este protocolo, la función consiste en un kernel gaussiano con los parámetros que se muestran en pantalla. Aquí, los estímulos sonoros deben componerse de varios motivos individuales de canto de un pájaro específico intercalados con períodos de silencio; ajuste la duración de estos períodos silenciosos para mantener idéntica la cantidad total de sonido y silencio en todos los estímulos. La duración total de cada estímulo es de 16 segundos, lo que corresponde al tiempo de adquisición de dos imágenes de IRMf.

Utilizando software de preparación, normalice la intensidad de cada canción en términos de raíz media cuadrática igualada y filtro pasa-altos a 400 hertz antes de integrarla en el estímulo completo. El experimento puede diseñarse usando software de presentación con un diseño de bloques de activación y desactivación, alternando períodos de estimulación auditiva con períodos de reposo. Cada bloque debe durar 16 segundos, lo que corresponde al tiempo de adquisición de dos imágenes; presente cada tipo de estímulo 25 veces, lo que resulta en la adquisición de 50 imágenes por estímulo y por sujeto.

El orden de presentación de las condiciones debe aleatorizarse dentro y entre los sujetos. Además, configure el paradigma experimental de modo que reciba señales de activación del escáner. Esto asegura que, durante la adquisición, en cada repetición dentro de la secuencia de FMRI, el software del escáner envíe una señal de activación al software de presentación auditiva, el cual a su vez registra el número de escaneo y ejecuta el comando correspondiente.

Aquí presentamos un protocolo adaptado específicamente para el uso de pinzones cebra adultos. Los pinzones cebra deben alojarse en aviarios bajo un fotoperiodo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad, y deben tener acceso a alimento y agua ad libitum durante todo el estudio. El número mínimo de individuos por experimento es de 15.

Este número tiene en cuenta la sensibilidad de la resonancia magnética funcional con eco de espín y la variabilidad interindividual natural de los fenómenos biológicos medidos en el experimento. Para prepararse para el experimento, primero conecte la máscara bucal al dispositivo controlador de gas mediante tubos de plástico e instálela en la camilla de resonancia magnética de un sistema de siete T. Abra las botellas de oxígeno y nitrógeno y encienda el dispositivo controlador de gas.

Además, encienda el sistema controlado por retroalimentación y el dispositivo de flujo de aire cálido. A continuación, anestesie al pinzón cebra con un 3% de isoflurano en una mezcla de oxígeno y nitrógeno introduciendo su pico en la máscara y sosteniendo la cabeza hasta que el ave esté completamente anestesiada. Esto puede verificarse tirando suavemente de la pata.

Cuando el ave esté completamente sedada, no se retraerá la pata. Además, los ojos del ave estarán cerrados. Introduzca una sonda de temperatura cloacal para controlar la temperatura corporal durante todo el experimento y coloque un sensor neumático debajo del abdomen para monitorear la frecuencia respiratoria.

Luego coloque una camisa para restringir el cuerpo del ave durante todo el experimento. Mantenga la frecuencia respiratoria entre 40 y 100 respiraciones por minuto y mantenga la temperatura corporal constante a 40 grados. Si el rango respiratorio es demasiado bajo o alto, ajuste el nivel de anestesia en consecuencia.

Si el problema persiste, se debe detener el experimento y retirar al animal del montaje. Para la recuperación, coloque altavoces dinámicos no magnéticos a ambos lados de la cabeza del pinzón cebra y conéctelos al amplificador. Asegúrese de que los cables de los altavoces se dirijan lejos de la sonda de temperatura, ya que esto podría influir en la lectura de la temperatura.

Cuando esté demasiado cerca, coloque la bobina de RF de superficie encima de la cabeza del pinzón cebra. Luego, coloque al pinzón cebra en el centro del imán. Finalmente, reduzca el nivel de anestesia a 1,5 % de ISO fluorado antes del escaneo.

Para comenzar el escaneo, primero determine la posición del cerebro en el imán. Adquiera un conjunto de imágenes piloto de una sola rebanada con gradiente de eco en planos sagital, horizontal y coronal, así como imágenes piloto de múltiples rebanadas que se utilizarán posteriormente para la colocación de los escaneos funcionales. Luego, reduzca el ruido de los gradientes aumentando sus tiempos de rampa a 1000 microsegundos.

A continuación, prepare una resonancia magnética funcional ponderada en T2 con adquisición rápida mejorada por relajación, conocida también como FMRI rare. Luego, configure una secuencia con 15 cortes sagitales que cubran casi todo el cerebro. Ahora, seleccione el protocolo auditivo en el software de presentación para asegurarse de que el software de presentación auditiva no omita ningún disparador proveniente del escáner.

Inicie primero el protocolo auditivo. Luego, una vez que el protocolo esté completamente cargado, comience la secuencia de FMRI. Antes de cada experimento de FMRI se deben adquirir 10 imágenes ficticias para permitir que la señal alcance un estado estable antes de iniciar la estimulación auditiva.

Tras completar la adquisición, rellene los datos hasta 64 por 64. Para determinar la calidad de los datos, examine preliminarmente los resultados utilizando la herramienta funcional.

En el software ParaVision, calcule la respuesta BOLD diferencial entre todos los bloques activados y la línea base. Si no se observa ninguna activación en las áreas auditivas primarias, probablemente el ave no haya escuchado ni procesado los estímulos auditivos debido a problemas técnicos o al nivel de anestesia. Se debe verificar el montaje y repetir la medición.

Después de la adquisición funcional, realice una secuencia ponderada en T2 3D rare anatómica en la misma orientación que los escaneos de FMRI anteriores. Luego, rellene estos datos hasta 256 por 256 por 256.

Finalmente, retire al pinzón cebra de la camilla de RM y permita que se recupere de la anestesia en una jaula bajo una lámpara de calor. Normalmente, la recuperación de un pinzón cebra de la anestesia con fluoruro de isoflurano toma menos de cinco minutos. Después de solo unos minutos, el ave intentará ponerse de pie, y una vez que se haya recuperado completamente, se posará en una rama en lugar de permanecer sentada en el fondo de la jaula para comenzar el procesamiento de datos.

Primero, convierta los datos de RM a formato analyze o nifty. Luego, antes de iniciar el procesamiento de los datos en SPM, es necesario adaptar los datos de FMRI de pájaros cantores multiplicando el tamaño del vóxel por 10. Dado que el software de análisis de FMRI ha sido desarrollado para procesar datos de FMRI adquiridos en humanos, la forma más sencilla de proceder es aumentar artificialmente el tamaño del vóxel de los datos de FMRI de aves utilizando el software MRI Crow.

Tenga en cuenta que este ajuste no influye en los datos mismos. No se aplica ningún re-muestreo ni otra modificación a los datos. A continuación, los datos adquiridos se preprocesan.

Utilizando SPM, primero realinee ocho veces los datos de FMRI y coregistre el conjunto de datos anatómico 3D con la serie temporal de FMRI. Luego, normalice los datos 3D y la serie temporal de FMRI COREGISTRADA al atlas cerebral del pinzón cebra.

Aplique la matriz de transformación al conjunto de datos de FMRI y suavice los datos con un kernel gaussiano de 0,5 milímetros. Luego, realice un análisis estadístico basado en vóxeles en SPM ocho, primero a nivel de las aves individuales y seguido por un análisis a nivel grupal. Finalmente, para visualizar los resultados y localizar las activaciones funcionales, proyecte el mapa paramétrico estadístico sobre el atlas del pardillo doméstico, el atlas cerebral tridimensional de alta resolución del pardillo doméstico, y las coordenadas estereotácticas utilizadas en el análisis descrito de los resultados de FMRI del pardillo doméstico, diseñado para este experimento en el laboratorio de bioimagen, el conjunto de datos del atlas de RM.

Las delimitaciones del cerebro y las delimitaciones de los núcleos están disponibles gratuitamente a través del sitio web que se muestra aquí. Aquí se muestra una vista lateral de una representación tridimensional del hemisferio izquierdo, con estructuras delimitadas del atlas proyectadas sobre su corte midsagital. Aquí podemos ver un ejemplo de una respuesta BOLD de FMRI en el campo L de la región auditiva primaria, y en regiones auditivas secundarias adyacentes, evocadas por diferentes estímulos auditivos en comparación con la condición de reposo.

Los valores de T están codificados por colores según la escala mostrada en la figura, y solo se muestran los vóxeles en los que se encontró que la prueba T era significativa. Este es otro ejemplo de un experimento de FMRI en pinzones cebra. Las imágenes muestran respuestas selectivas a la canción propia del ave en las regiones cerebrales área XMLD y HVC.

Los números bajo las imágenes indican coordenadas en milímetros desde la línea media. El signo positivo indica que las secciones y los resultados estadísticos provienen del hemisferio derecho. El protocolo descrito en este video puede adaptarse fácilmente para aplicaciones en otros pájaros cantores, como los estorninos.

Este es un ejemplo de los resultados de un experimento de IRMf. En un estornino, la figura muestra las activaciones inducidas por estímulos auditivos frente al reposo en el mismo individuo a lo largo de las estaciones. La implementación y optimización de la resonancia magnética funcional en aves cantoras abre nuevas vías de investigación en el campo del estudio de las aves cantoras.

Ya se ha demostrado que es una técnica valiosa para el análisis experimental de procesos sensoriomotores y cognitivos complejos que subyacen a la comunicación vocal en estos modelos animales. Además, gracias a su enfoque no invasivo y de cerebro completo, la IRMf puede utilizarse como método complementario para complementar los métodos locales e invasivos más comúnmente empleados. El creciente número de experimentos de IRMf en zorzales demuestra su aplicabilidad a preguntas de investigación cognitiva, un esfuerzo futuro que debería realizarse para extender aún más los experimentos de IRM más allá del procesamiento auditivo, que es un proceso que permanece activo bajo anestesia, mediante el uso de sujetos despiertos habituados al protocolo de imagen.

Esto podría ofrecer nuevas posibilidades de investigación en las que las aves puedan participar activamente en experimentos de EMI y en las que la atención de las aves pueda controlarse experimentalmente.