Disección, Cultura y Análisis de

El objetivo general de este procedimiento es preparar un cultivo primario de células retinianas de Xenopus. Esto se logra primero eliminando los tejidos circundantes para exponer la retina. El segundo paso consiste en extirpar el tejido retiniano.

A continuación, el tejido retiniano se disocia en células individuales. El último paso consiste en sembrar las células retinianas en una placa UnCloned y añadir flu oh 4:00 AM para la imagen de calcio. Finalmente, se utiliza microscopía confocal para detectar la actividad de calcio en cultivo de células retinianas.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología del desarrollo, la neurobiología y la biología celular, como el papel del calcio y la actividad eléctrica en el desarrollo retiniano, así como la expresión génica a nivel de una sola célula. En general, las personas nuevas en este procedimiento tendrán dificultades porque son necesarios movimientos motores finos para realizar disecciones precisas y oportunas. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos del procedimiento son difíciles porque se requieren movimientos complejos de coordinación ojo-mano.

Para comenzar este procedimiento dentro de la campana, prepare y etiquete lo siguiente: un plato de Petri plástico de 60 milímetros que contenga 10 mililitros. El medio de cultivo celular que se utilizará como plato de disección. Opcionalmente, se pueden añadir 10 miligramos de colagenasa B al plato de disección para obtener una concentración final de 1,0 miligramo por mililitro, con el fin de facilitar la separación de las capas tisulares durante la disección de embriones en la etapa 25 o más jóvenes.

Además, prepare un plato de superficie de 35 milímetros con dos mililitros. Medio de cultivo celular que se utilizará como placa de cultivo, un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros vacío que se usará como tubo de disociación de explantes y un tubo cónico Falcon de 15 mililitros que contiene 15 mililitros.

Medio de cultivo celular. Luego, prepare dos placas de Petri plásticas de 35 milímetros que contengan dos mililitros, CMF para la disección, una que se utilizará como placa de disociación de explantes y la otra como placa de lavado de explantes fuera de la cabina. Prepare dos placas de Petri plásticas de 60 milímetros que contengan 10 mililitros.

0,1 XMMR, uno que se utilizará como placa de mantenimiento, el otro como placa hermana, y un plato de Petri plástico más de 60 milímetros que contiene 10 mililitros de 0,1 XMMR más 0,5 miligramos por mililitro de MS 2 22. Después de eso, añada 40 microlitros de tripsina al 5 % en CMF a la placa de disociación de explantes.

Agite suavemente para mezclar y luego deje aparte. A continuación, proceda con la disección utilizando un microscopio estereoscópico y dos pares de pinzas finas. Realice un corte sagital medio en la cara ventral del embrión, comenzando desde el extremo posterior y continuando a través de la glándula de cemento en la porción anterior del embrión.

Abra cuidadosamente el embrión separando ambos lados del corte. Esto hace que el lado dorsal del embrión quede orientado hacia la placa de disección. Luego, abra el ectodermo ventral para revelar el endodermo y el mesodermo.

A continuación, retire el endodermo y el mesodermo, la primera y capa más grande de este tejido. El endodermo tiene un aspecto muy esponjoso, con células grandes y poca organización evidente. Después de eliminar esta capa, se harán visibles los somitas y el Noor.

Para obtener un mejor contraste, transfiera el embrión a una placa de Petri plástica de 60 milímetros separada que contenga 10 mililitros de medio de cultivo celular y 100 microlitros de una solución al 1% de sulfato de azul de Nilo, e incube durante dos a tres minutos. Posteriormente, transfiera de nuevo al plato de disección. Esto tiñirá el ectodermo, los somitas y el Noor para facilitar su identificación y orientación.

Centrando la atención en la porción anterior del embrión, retire cuidadosamente el Noor y cualquier mesodermo remanente para exponer el cerebro y las vesículas ópticas. Una vez que el cerebro y las vesículas ópticas estén completamente expuestos, use la pinza para seccionar el tubo neural y el ectodermo subyacente justo posterior al cerebro. Gire esta porción de modo que el ectodermo quede en la parte superior.

Tenga cuidado para evitar dañar las vesículas ópticas subyacentes y retire cuidadosamente el ectodermo. Finalmente, separe las vesículas ópticas del cerebro con la pinza para diseccionar un embrión mayor a la etapa 25. Primero, retire la porción ventral del embrión con la pinza en la placa de anestesia.

Para obtener un mejor contraste, transfiera el embrión a una placa de Petri plástica de 60 milímetros que contenga 10 mililitros de MMR 0,1 X y 100 microlitros de sulfato de nile azul al 1 % durante dos a tres minutos para teñir el ectodermo. Luego, transfiéralo a la placa de disección. A continuación, sosteniendo cuidadosamente el embrión en su lugar, retire la retina o la vesícula óptica que se encuentra directamente debajo del ectodermo sobrepuesto.

Una vez que la vesícula óptica o la retina hayan sido diseccionadas, transfiéralas cuidadosamente a la placa de enjuague X con una micropipeta P100 utilizando una punta resistente al aerosol. Tenga cuidado de no permitir que entre en contacto con ninguna interfase aire-líquido. Luego, deje reposar la explanta durante 30 segundos.

A continuación, transfiera 80 microlitros de tripsina al 0,1 % en CMF desde la placa de disociación del explante al tubo de disociación del explante. Después, transfiera la retina o la vesícula óptica desde la placa de lavado del explante al tubo de disociación del explante. Evite transferir la solución de lavado del explante.

Luego, deje que el tejido se disocie en el tubo de disociación de explante durante una hora a temperatura ambiente. Si se van a tomar varias imágenes de las células a lo largo del experimento, fije una cuadrícula en la parte inferior de la placa de cultivo con pequeñas gotas de pegamento sintético. Esto permitirá tomar imágenes de células idénticas en orientaciones idénticas en diferentes momentos del procedimiento para sembrar las células.

Primero, retire lentamente 40 microlitros de la solución del tubo de disociación de explantes y deseche. Luego, utilice la pipeta P 100 con una punta resistente a aerosoles para transferir lentamente las células a la placa de cultivo. Al aspirar las células hacia la placa, pipetee lentamente y mantenga las células en un área pequeña en el centro de la placa.

Esta figura muestra un ejemplo de la actividad de calcio de una sola célula durante una hora de adquisición de imágenes. Estas figuras proporcionan los resultados representativos de experimentos de imágenes de calcio en células retinianas embrionarias, analizados en diferentes estadios de desarrollo. En resumen, los resultados indican que el calcio está regulado durante el desarrollo, con picos de actividad en el estadio 35 en cuanto a la correlación de la actividad de calcio con células positivas para una sonda específica.

En experimentos con peces, aunque no hubo diferencias estadísticamente significativas, se observó una tendencia de que las células positivas para un marcador GABAérgico mostraran niveles más altos de actividad de picos de calcio en comparación con las células positivas para un marcador glutamatérgico o para la codificación del gen PT F1 A.A, un factor de transcripción correlacionado con la promoción del fenotipo GABAérgico. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en aproximadamente tres horas y treinta minutos por placa si se realiza adecuadamente. Tras seguir este procedimiento, otros métodos como el cultivo celular, la hibridación C dos o los registros electrofisiológicos pueden utilizarse para responder preguntas adicionales, como qué células expresan marcadores fenotípicos específicos o para analizar registros electrofisiológicos. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo diseccionar el tejido retiniano, disociar el tejido retiniano y sembrar células retinianas.