Name: En electroporación in ovo de base miARN plásmidos en el tubo neural en desarrollo y evaluación de fenotipos por inyección de Dil en los preparativos libro abierto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Aprende electroporación in ovo con plásmidos basados en miARN para estudiar guía de axones conmuturales en el tubo neural de pollo. Este método permite silenciar genes específicamente por tipo celular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

El trabajo en el laboratorio de ES con el apoyo de la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia. Nos gustaría dar las gracias al Dr. Beat Kunz para obtener ayuda con el rodaje.

<ol><li>Chédotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+tales+of+the+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Further tales of the midline.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21, 68-75 (2011).</li>
<li>Avraham, O., Hadas, Y., Vald, L., Zisman, S., Schejter, A., Visel, A., Klar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+axonal+guidance+and+sorting+in+dorsal+interneurons+by+the+Lim-HD+proteins+Lhx9+and+Lhx1%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1.</a> Neural Development. 4, 21(2009).</li>
<li>Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+specific%2C+traceable+gene+silencing+for+functional+gene+analysis+during+vertebrate+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cell type specific, traceable gene silencing for functional gene analysis during vertebrate neural development.</a> Nucleic Acids Research. 39, e133(2011).</li>
<li>Das, R. M., van Hateren, N. J., Howell, G. R., Farrell, E. R., Bangs, F. K., Porteous, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+system+for+RNA+interference+in+the+chicken+using+a+modified+microRNA+operon%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon.</a> Developmental Biology. 294, 554-563 (2006).</li>
<li>Perrin, F. E., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+lipophilic+dyes+in+studies+of+axonal+pathfinding+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Use of lipophilic dyes in studies of axonal pathfinding in vivo.</a> Microscopy Research and Technique. 48, 25-31 (2000).</li>
<li>Timmer, J., Johnson, J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+in+ovo+electroporation+for+the+rapid+analysis+of+neural-specific+murine+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">The use of in ovo electroporation for the rapid analysis of neural-specific murine enhancers.</a> Genesis. 29, 123-132 (2001).</li>
<li>Kieleczawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+modifications+of+the+standard+DNA+sequencing+protocol+allow+for+sequencing+through+siRNA+hairpins+and+other+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Techniques%22%5BJournal%5D)">Simple modifications of the standard DNA sequencing protocol allow for sequencing through siRNA hairpins and other repeats.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 16, 220-223 (2005).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Boulland, J., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenotransplantation+of+Human+Stem+Cells+into+the+Chicken+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo.</a> J. Vis. Exp. (41), e2071(2010).</li>
<li>Kim, B. G., Dai, H. -N., McAtee, M., Vicini, S., Bregman, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+dendritic+spines+with+the+carbocyanine+dye+DiI+for+confocal+microscopic+imaging+in+lightly+fixed+cortical+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Labeling of dendritic spines with the carbocyanine dye DiI for confocal microscopic imaging in lightly fixed cortical slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162, 237-243 (2007).</li>
<li>Murphy, M. C., Fox, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+tracing+method+using+DiI+to+label+vagal+innervation+of+the+embryonic+and+early+postnatal+mouse+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Anterograde tracing method using DiI to label vagal innervation of the embryonic and early postnatal mouse gastrointestinal tract.</a> Journal of Neuroscience Methods. 163, 213-225 (2007).</li>
<li>Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127, 1185-1196 (2000).</li>
<li>Li, X., Lufkin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+recombinase+expression+in+the+floorplate%2C+notochord+and+gut+epithelium+in+transgenic+embryos+driven+by+the+Hoxa-1+enhancer+III%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Cre recombinase expression in the floorplate, notochord and gut epithelium in transgenic embryos driven by the Hoxa-1 enhancer III.</a> Genesis. 26, 121-122 (2000).</li>
<li>Mauti, O., Baeriswyl, T., Stoeckli, E. T. G. ene <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+by+Injection+and+Electroporation+of+dsRNA+in+Avian+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Silencing by Injection and Electroporation of dsRNA in Avian Embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2008).</li>
<li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Developmental Dynamics. 229, 433-439 (2004).</li>
<li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+and+confirming+the+specificity+of+RNAi+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhancing and confirming the specificity of RNAi experiments.</a> Nature Methods. 3, 677-681 (2006).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Esta simple, basado en vectores de expresión de miARN estrategia artificial puede ser utilizado para la expresión del gen endógeno caída en el tubo neural de pollo. Estas herramientas funcionales ofrecer silenciamiento de genes múltiples, control temporal y la especificidad de tipo celular, para facilitar la dilucidación de complejas vías de desarrollo. En particular, se ha demostrado la utilidad de estos plásmidos en guía de axones comisurales, ya que los plásmidos se pueden utilizar para distintos genes desmontables e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> 0,5 mm capilares de vidrio </td><td> World Precision Instruments </td><td> 1B120F-4 </td></tr><tr><td> Vidrio aguja extractor </td><td> Narishige </td><td> PC-10 </td></tr><tr><td> Electroporador </td><td> BTX </td><td> ECM 830 </td></tr><tr><td> Sylgard de elastómero de silicona </td><td> World Precision Instruments </td><td> SYLG184 </td></tr><tr><td> Alambre de tungsteno, 0,075 mm </td><td> World Precision Instruments </td><td> TGW0325 </td></tr><tr><td> Los alfileres entomológicos, 0,20 mm </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 26002-20 </td></tr><tr><td> Los alfileres entomológicos, 0,10 mm </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 26002-10 </td></tr><tr><td> Tijeras de primavera </td><td> Ciencia Para Fineoles </td><td> 15003-08 </td></tr><tr><td> Dumont # 5 fórceps </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Dumont # 55 pinzas </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 11255-20 </td></tr><tr><td> Fast Dil </td><td> Molecular Probes </td><td> D-7756 </td></tr><tr><td> Microscopios de fluorescencia </td><td> Olimpo </td><td> SZX12, BX51 </td></tr></tbody></table>

en electroporación in ovo de base miarn plásmidos en el tubo neural en desarrollo y evaluación de fenotipos por inyección de dil en los preparativos libro abierto

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

Comisurales ED1 neuronas han sido ampliamente estudiados para elucidar los mecanismos que subyacen guía de axones durante el desarrollo 1,2. Estas neuronas se localizan en la médula espinal dorsal y envían sus axones a lo largo de trayectorias estereotipados. Axones de la comisura ventral inicialmente proyectar hacia y luego a través de la placa del piso. Después de cruzar la línea media, estos axones hacer un giro brusco rostral y proyecto longitudinalmente hacia el cerebro. Cada uno de estos pasos está regulado por las actividades coordinadas de señales de orientación de atracción y repulsión. La correcta interpretación de estas señales es crucial para la orientación de los axones a lo largo de su ruta demarcada. Por lo tanto, la contribución fisiológica de una molécula particular para guía de axones de la comisura está idealmente investigado en el contexto de la embrión vivo. Por consiguiente, desmontables de genes in vivo deben ser controlados con precisión con el fin de distinguir cuidadosamente las actividades de orientación axón de genes que pueden jugar múltiplesfunciones durante el desarrollo. Aquí se describe un método para la expresión de gen desmontables en el tubo neural de pollo en un tipo de células específicas, de manera rastreable. Usamos nuevos vectores plasmídicos 3 albergar celulares específicos de tipo promotores / potenciadores que dirigen la expresión de un marcador de la proteína fluorescente, seguido directamente por un transcrito de miR30-RNAi 4 (localizado dentro de la UTR 3 &#39;del ADNc que codifica la proteína fluorescente) ( Figura 1). Cuando electroporación en el tubo neural en desarrollo, estos vectores provocar downregulation eficiente de la expresión génica y expresar proteínas marcadoras fluorescentes brillantes para permitir el rastreo directo de las células que experimentan desmontables 3. Mezclando diferentes vectores de RNAi antes de la electroporación permite la caída simultánea de dos o más genes en regiones independientes de la médula espinal. Esto permite complejas interacciones celulares y moleculares que se examinaron durante el desarrollo, de una manera que es rápida, simple, preciso y barato. En combinación con Dil trazado de trayectorias de axones comisurales en preparaciones de libro abierto 5, este método es una herramienta útil para estudios in vivo de los mecanismos celulares y moleculares de crecimiento de los axones de la comisura y orientación. En principio, cualquier promotor / potenciador se podría utilizar, lo que podría hacer la técnica más ampliamente aplicable para estudios in vivo de la función de genes durante el desarrollo 6. Este primer video muestra cómo controlar y huevos de ventana, la inyección de los plásmidos de ADN en el tubo neural y el procedimiento de electroporación. Para investigar guía de axones comisurales, la médula espinal se retira del embrión como una preparación a libro abierto, fijado, e inyectados con Dil, para permitir que las vías axonales a ser rastreado. La médula espinal está montado entre cubreobjetos y se visualizaron mediante microscopía confocal.

Un método por el cual la expresión de genes en el tubo neural puede ser regulada hacia abajo en un tipo de células específicas, de manera detectable se describe. Demostramos cómo<em&gt; In ovo</emElectroporación&gt; de base microRNA-plásmidos que provocan interferencia de ARN espaciotemporalmente controlada puede ser usada para investigar guiado de los axones de la comisura en el tubo neural en desarrollo.

En electroporación in ovo de base miARN plásmidos en el tubo neural en desarrollo y evaluación de fenotipos por inyección de Dil en los preparativos libro abierto

Las neuronas dI1 comisurales han sido estudiadas exhaustivamente para dilucidar los mecanismos subyacentes a la guía axonal durante el desarrollo1,2. Estas neuronas son ...

El objetivo de este procedimiento es evaluar los defectos en la guía axonal en el tubo neural de pollo tras la reducción específica de la expresión génica de manera rastreable según el tipo celular. Esto se logra preparando huevos de pollo fertilizados para la electroforesis in ovo, realizando una ventana en el cascarón. El segundo paso consiste en inyectar y electrotransfectar constructos de ADN que codifican microARNs en el tubo neural.A continuación, se disecan las médulas espinales electroestimuladas y se fijan en preparaciones planas montadas en forma de libro abierto. El paso final consiste en inyectar un colorante fluorescente para visualizar las proyecciones axónicas. Finalmente, se utiliza microscopía fluorescente para mostrar tanto las células que experimentan silenciamiento génico como para evaluar los efectos posteriores sobre la guía de los axones comisurales.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es el silenciamiento específico de genes según el tipo celular. Para preparar los plásmidos, consulte el protocolo escrito para obtener instrucciones. Incube los huevos a 38,5 grados Celsius y alrededor del 45 % de humedad hasta alcanzar la etapa deseada de desarrollo. Para estudiar la guía axonal de neuronas comisurales, incube los embriones durante aproximadamente tres días hasta que alcancen la etapa 17 a 18 de Hamburger y Hamilton.Una vez alcanzada la etapa deseada de desarrollo y antes de que la proteína de interés se acumule dentro del embrión, retire los huevos del incubador y colóquelos en una posición horizontal estable durante 20 minutos para reposicionar el embrión encima de la yema, en la parte superior del huevo. Después de que los embriones se hayan reposicionado encima de la yema, saque los huevos del incubador y límpielos con etanol al 70 %. A continuación, coloque una tira de cinta a lo largo del eje longitudinal del huevo y use un escalpelo para hacer un pequeño orificio en el extremo romo del huevo y otro en la esquina de la zona que se va a abrir.Luego, inserte una jeringa equipada con una aguja de calibre 18 en el orificio del extremo romo del huevo con un ángulo de 45 grados y aspire aproximadamente tres mililitros de albúmina, teniendo cuidado de no dañar la yema. Utilice tijeras pequeñas sostenidas horizontalmente para cortar una ventana en el huevo sin dañar el embrión. A continuación, selle la ventana utilizando la cinta.Finalmente, utilice un pincel para aplicar cera de parafina fundida y sellar el orificio en el extremo romo del huevo, y selle cualquier grieta en el huevo de la misma manera. Luego, devuelva el huevo al incubador. Repita el proceso con todos los huevos que se vayan a electroporar.Retire la cinta de uno de los huevos con ventana y determine la etapa del embrión según Hamburger y Hamilton. Luego, use pinzas para levantar las membranas extraembrionarias de la mitad cordal del embrión en la región donde se encuentran las principales venas vitelinas derecha e izquierda. Ingrese suavemente al tronco, rompa o corte las membranas con tijeras de resorte y desplácelas hacia la cola.Ahora use succión suave para cargar la mezcla de ADN que se va a electroportar en una microcapilar de vidrio con tubo conectado. Introduzca la microcapilar en el canal central del tubo neural justo por encima de las extremidades posteriores e inyecte la solución de ADN controlando el volumen de inyección mediante la boca. El colorante azul debe extenderse desde la punta de la cola hasta el ventrículo del cerebro en desarrollo.Agregue unas gotas de PBS estéril encima del embrión y coloque los electrodos paralelos al eje anterior-posterior del embrión sin tocar el embrión ni ningún vaso sanguíneo. Luego sostenga los electrodos firmemente y realice la electro poración. Tras la electro poración, retire los electrodos y enjuague rápidamente con agua estéril para eliminar las proteínas desnaturalizadas del clara del huevo.Finalmente, agregue un poco más de PBS estéril sobre el embrión y luego selle nuevamente el huevo con cinta adhesiva. Como antes, un sellado adecuado es crucial para evitar la deshidratación del embrión. A continuación, devuelva el embrión al incubador hasta alcanzar la etapa deseada de desarrollo.Una vez que el embrión alcance la etapa 25 a 26 de Hamburger Hamilton, utilice pinzas para retirar el embrión del huevo y colóquelo en una placa de Petri recubierta con elastómero de sil guard. Use las pinzas para eliminar las membranas extraembrionarias y coloque el embrión con el lado dorsal hacia abajo. Ahora use alfileres para insectos de 0,2 milímetros para estirar suavemente y sujetar el embrión a través del cuello y la cola.Luego sujete las extremidades del embrión, insertando las agujas en un ángulo de manera que no interfieran con la disección posterior. Ilumine el recipiente que contiene el embrión desde abajo para poder percibir la densidad del tejido. Utilice tijeras de resorte para abrir la cavidad abdominal y raspe suavemente con pinzas para extraer el corazón y los órganos internos.Cuando todos los órganos hayan sido completamente removidos, serán visibles las vértebras segmentadas y la médula espinal. A continuación, gire el embrión 180 grados y use tijeras de resorte para hacer un corte superficial a través de las vértebras que se encuentran sobre la médula espinal en la región del cuello. Luego, realice dos cortes longitudinales cortos a través de las vértebras a ambos lados de la médula espinal, desde el cuello hasta la cola.Utilice pinzas para levantar las vértebras laminares lejos de la médula espinal y luego desprenda las vértebras en una sola tira hacia la cola. A continuación, estire suavemente y vuelva a fijar el embrión a través de la cola y las extremidades. Ahora identifique las meninges de la médula espinal, que deben aparecer como una línea oscura y densa de tejido entre el tubo neural y los ganglios de la raíz dorsal, y luego use una aguja estéril o un escalpelo microquirúrgico fino para cortar longitudinalmente las meninges a lo largo de cada lado de la médula desde el cuello hasta la cola.Las meninges deben separarse fácilmente de la médula espinal debido al estiramiento del embrión fijado. Finalmente, corte la médula espinal a nivel del brote de la aleta y caudal al brote del miembro. Luego, use pinzas para extraer la médula espinal con un movimiento rostral-caudal, asegurándose de que la médula permanezca sumergida en el PBS First.Extienda la médula espinal aislada sobre una espátula y transfiérala a un plato recubierto con sylgard fresco que contenga paraformaldehído al 4% en PBS. Luego, sujete cuidadosamente la médula espinal rostralmente, medialmente y en cuartos con alfileres de insectos de 0,1 milímetros para obtener una preparación en montaje plano, e incube el paraformaldehído durante 30 minutos a una hora. Tenga cuidado de no sobrefijar.Esto aumentará el fondo y reducirá la eficiencia de la difusión del diod. Luego, vierta cuidadosamente el paraformaldehído y sustitúyalo por PBS. Después de preparar cinco miligramos por mililitro de di rápido en etanol, rompa la punta de una micropipeta de vidrio de pequeño diámetro conectada a un tubo de plástico e introduzca la solución en la pipeta iet.Introduzca la aguja llena en un recipiente con PBS y verifique que el colorante no se filtre desde la aguja. Si ocurre filtración, el diámetro es demasiado amplio y debe prepararse una nueva aguja. Asegúrese de que la preparación de libro abierto esté iluminada desde abajo y localice la franja longitudinal más densa ubicada aproximadamente a un quinto del ancho del hemilibro desde el borde lateral; los cuerpos celulares de las neuronas comisurales se encuentran justo por dorsal a esta línea oscura.Introduzca la punta de la micropipeta de vidrio en el tejido y, al retirar la aguja, aplique un pequeño chorro de D eye mediante una pipeta de boca; repita rápidamente el procedimiento cada 0,5 milímetros a lo largo de la longitud del libro abierto. Una vez finalizadas las inyecciones, utilice una pipeta de transferencia para aspirar y desechar cualquier exceso de di; si no se hace esto, se producirá un fondo elevado.Repita el procedimiento para todas las preparaciones de libro abierto. Luego coloque el recipiente que contiene las preparaciones inyectadas a cuatro grados Celsius durante aproximadamente tres días para permitir que el colorante se difunda a lo largo de los axones. Transcurrido este tiempo, monte las preparaciones según las instrucciones del protocolo escrito.Se obtuvieron secciones transversales y libros abiertos de embriones de pollo en la etapa 25 a 26 de Hamburger Hamilton que fueron electro porados en la etapa 18 de Hamburger Hamilton. Como se observa aquí en sección transversal, el promotor de beta-actina dirige una expresión ubicua. La flecha indica la dirección dorsal-ventral.Esta imagen muestra un ejemplo de patrones de expresión de proteínas fluorescentes obtenidos tras la electroforesis de los vectores plasmídicos. Aquí se observa la expresión ubicua del promotor de la beta-actina en una preparación de libro abierto. La flecha indica la dirección cordal rostral.Esta imagen muestra una sección transversal tras la electroforesis con un constructo que contiene un potenciador de math one. Esto induce la expresión en neuronas di una. Aquí se observa la expresión del constructo con el potenciador de math one en una preparación de libro abierto.Esta sección transversal muestra la expresión del enhancer de halcón A uno tras la electroporación bilateral del constructo. El enhancer de halcón A uno induce expresión específicamente en la placa del suelo. Esta preparación de tipo libro abierto muestra el patrón de expresión del constructo de halcón A uno en la placa del suelo.Esta imagen muestra una imagen de campo brillante de la aplicación de los sitios de inyección de Dai. En una preparación de libro abierto, Dai se inyectó en un patrón punteado cerca del margen lateral del libro abierto. En el lado electroestimulado, esta imagen muestra la visualización de la expresión de GFP en la misma preparación, y aquí se visualiza Dai.Después de tres días de difusión, debería ser posible visualizar las comisuras en trayectorias bajo microscopía de fluorescencia. Las trayectorias normales de los axones crecerán hacia la placa del suelo, cruzarán la placa del suelo y luego girarán y continuarán creciendo. Tal como se observa aquí.Fenotipos anormales derivados de la inhibición génica, como el mostrado aquí, pueden compararse con la trayectoria arquetípica. En el ejemplo, algunos axones se detienen en la placa del suelo o toman decisiones de giro erróneas en el lado contralateral. Al intentar este procedimiento, es importante tener cuidado y paciencia durante todos los pasos delicados de inyección y disección.Esto requiere algo de práctica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inyectar plásmidos de ARNi para investigar la función génica durante el desarrollo del tubo neural de manera específica a un tipo celular.

in-ovo-electroporation-mirna-based-plasmids-developing-neural-tube

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este video muestra la forma de visualizar las vías axonales de grupos genéticamente definidos de neuronas en la médula espinal de embriones de pollo que...

Descifrar Caminos axonal de los grupos definidos genéticamente las neuronas en el tubo neural del polluelo Utilizando In ovo La electroporación

En la electroporación in utero es un método valioso para la transfección de células progenitoras neuronales in vivo. Dependiendo de la colocación de los electrodos y el punto de tiempo en el desarrollo de la electroporación, ciertos subconjuntos de células corticales pueden ser atacadas. Células afectadas puede ser analizada en vivo o in vitro para los efectos de la alteración genética.

En el útero de electroporación seguido por cultivos neuronales primarias para estudiar la función génica en el subconjunto de neuronas corticales

En el útero de la electroporación permite la entrega rápida de genes en un espacio-temporal y controlado de manera en el desarrollo del sistema nervioso central (SNC). Aquí se describe una muy adaptable en el protocolo de electroporación in utero que puede ser utilizado para entregar las construcciones de expresión en múltiples dominios del SNC embrionario, incluyendo el telencéfalo, diencéfalo y la retina.

Entrega génica eficaz en los territorios del SNC múltiples utilizando In Utero La electroporación

Este estudio describe el desarrollo de...

En electroporación in vitro del labio inferior rómbico mitad de la gestación de embriones de ratón

Para evaluar la función y la regulación de los genes durante el desarrollo de las neuronas del cerebro medio dopaminérgico, se describe un método que consiste...

En electroporación in ovo en el mesencéfalo polluelo para estudiar la función génica en el desarrollo neuronal dopaminérgica

El control de la expansión de células madre somáticas es un factor importante que impide su estudio y uso en terapia. Aquí se describe un sistema para controlar temporalmente madre neural expansión células durante el desarrollo y la edad adulta, que se puede utilizar para aumentar el número de neuronas generadas en el cerebro de ratón.

La expansión de las células madre embrionarias y adultas neurales por<em&gt; In Utero</em&gt; La electroporación o inyección estereotáxica Viral

La expresión ectópica es una técnica para dilucidar el papel microRNAs en el desarrollo del cerebro. Sin embargo, la focalización en áreas específicas mediante electroporación in ovo es un reto. Aquí, se muestra una forma eficiente a las regiones del cerebro medio ventral y dorsal selectiva electroporar.

En Expression in ovo de microARN en ventral del polluelo Midbrain

Presentamos la transgénesis y transitoria gen desmontables en Ciona intestinalis, un grupo hermano cordado a los vertebrados, utilizando técnicas de microinyección y electroporación. Tales métodos facilitan la genómica funcional en este sencillo de invertebrados que cuenta con características rudimentarias de vertebrados, incluyendo notocorda y epitelios sensoriales cabeza, y muchos ortólogos de genes de enfermedades humanas asociadas.

La microinyección de embriones y la electroporación en el Chordate<em&gt; Ciona intestinalis</em

Hemos desarrollado un nuevo enfoque de pérdida de función que implica la introducción e integración genómica de secuencias artificiales de micro-ARN en embriones de pollo mediante el uso de electroporación in ovo y el sistema de transposones Tol2. Esta técnica proporciona una metodología de eliminación de genes robusta y estable para estudios de la función de los genes durante el desarrollo.

Enfoque de pérdida de función en la retina embrionaria de pollo mediante el uso de la expresión transgénica mediada por transposones Tol2 de microARN artificiales

En este protocolo, describimos cómo inyectar lentivirus la cavidad amniótica del ratón en E7.5, lo que lleva a una transducción uniforme de toda la placa neural, con efectos perjudiciales mínimos sobre la supervivencia o el desarrollo embrionario.

Focalización de la placa neural murina mediante nanoinyección in utero (NEPTUNE) en el día embrionario 7.5

Aprende electroporación in ovo con plásmidos basados en miARN para estudiar guía de axones conmuturales en el tubo neural de pollo. Este método permite silenciar genes específicamente por tipo celular.

En electroporación in ovo de base miARN plásmidos en el tubo neural en desarrollo y evaluación de fenotipos por inyección de Dil en los preparativos libro abierto (Video) | JoVE Journal

En electroporación in ovo de base miARN plásmidos en el tubo neural en desarrollo y evaluación de fenotipos por inyección de Dil en los preparativos libro abierto

Explorar más videos