Name: En electroporación in ovo de base miARN plásmidos en el tubo neural en desarrollo y evaluación de fenotipos por inyección de Dil en los preparativos libro abierto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Aprende electroporación in ovo con plásmidos basados en miARN para estudiar guía de axones conmuturales en el tubo neural de pollo. Este método permite silenciar genes específicamente por tipo celular.

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El trabajo en el laboratorio de ES con el apoyo de la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia. Nos gustaría dar las gracias al Dr. Beat Kunz para obtener ayuda con el rodaje.

<ol><li>Chédotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+tales+of+the+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Further tales of the midline.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21, 68-75 (2011).</li>
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<li>Boulland, J., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenotransplantation+of+Human+Stem+Cells+into+the+Chicken+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo.</a> J. Vis. Exp. (41), e2071(2010).</li>
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<li>Murphy, M. C., Fox, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+tracing+method+using+DiI+to+label+vagal+innervation+of+the+embryonic+and+early+postnatal+mouse+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Anterograde tracing method using DiI to label vagal innervation of the embryonic and early postnatal mouse gastrointestinal tract.</a> Journal of Neuroscience Methods. 163, 213-225 (2007).</li>
<li>Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127, 1185-1196 (2000).</li>
<li>Li, X., Lufkin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+recombinase+expression+in+the+floorplate%2C+notochord+and+gut+epithelium+in+transgenic+embryos+driven+by+the+Hoxa-1+enhancer+III%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Cre recombinase expression in the floorplate, notochord and gut epithelium in transgenic embryos driven by the Hoxa-1 enhancer III.</a> Genesis. 26, 121-122 (2000).</li>
<li>Mauti, O., Baeriswyl, T., Stoeckli, E. T. G. ene <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+by+Injection+and+Electroporation+of+dsRNA+in+Avian+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Silencing by Injection and Electroporation of dsRNA in Avian Embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2008).</li>
<li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Developmental Dynamics. 229, 433-439 (2004).</li>
<li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+and+confirming+the+specificity+of+RNAi+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhancing and confirming the specificity of RNAi experiments.</a> Nature Methods. 3, 677-681 (2006).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Esta simple, basado en vectores de expresión de miARN estrategia artificial puede ser utilizado para la expresión del gen endógeno caída en el tubo neural de pollo. Estas herramientas funcionales ofrecer silenciamiento de genes múltiples, control temporal y la especificidad de tipo celular, para facilitar la dilucidación de complejas vías de desarrollo. En particular, se ha demostrado la utilidad de estos plásmidos en guía de axones comisurales, ya que los plásmidos se pueden utilizar para distintos genes desmontables e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> 0,5 mm capilares de vidrio </td><td> World Precision Instruments </td><td> 1B120F-4 </td></tr><tr><td> Vidrio aguja extractor </td><td> Narishige </td><td> PC-10 </td></tr><tr><td> Electroporador </td><td> BTX </td><td> ECM 830 </td></tr><tr><td> Sylgard de elastómero de silicona </td><td> World Precision Instruments </td><td> SYLG184 </td></tr><tr><td> Alambre de tungsteno, 0,075 mm </td><td> World Precision Instruments </td><td> TGW0325 </td></tr><tr><td> Los alfileres entomológicos, 0,20 mm </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 26002-20 </td></tr><tr><td> Los alfileres entomológicos, 0,10 mm </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 26002-10 </td></tr><tr><td> Tijeras de primavera </td><td> Ciencia Para Fineoles </td><td> 15003-08 </td></tr><tr><td> Dumont # 5 fórceps </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Dumont # 55 pinzas </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 11255-20 </td></tr><tr><td> Fast Dil </td><td> Molecular Probes </td><td> D-7756 </td></tr><tr><td> Microscopios de fluorescencia </td><td> Olimpo </td><td> SZX12, BX51 </td></tr></tbody></table>

en electroporación in ovo de base miarn plásmidos en el tubo neural en desarrollo y evaluación de fenotipos por inyección de dil en los preparativos libro abierto

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

Comisurales ED1 neuronas han sido ampliamente estudiados para elucidar los mecanismos que subyacen guía de axones durante el desarrollo 1,2. Estas neuronas se localizan en la médula espinal dorsal y envían sus axones a lo largo de trayectorias estereotipados. Axones de la comisura ventral inicialmente proyectar hacia y luego a través de la placa del piso. Después de cruzar la línea media, estos axones hacer un giro brusco rostral y proyecto longitudinalmente hacia el cerebro. Cada uno de estos pasos está regulado por las actividades coordinadas de señales de orientación de atracción y repulsión. La correcta interpretación de estas señales es crucial para la orientación de los axones a lo largo de su ruta demarcada. Por lo tanto, la contribución fisiológica de una molécula particular para guía de axones de la comisura está idealmente investigado en el contexto de la embrión vivo. Por consiguiente, desmontables de genes in vivo deben ser controlados con precisión con el fin de distinguir cuidadosamente las actividades de orientación axón de genes que pueden jugar múltiplesfunciones durante el desarrollo. Aquí se describe un método para la expresión de gen desmontables en el tubo neural de pollo en un tipo de células específicas, de manera rastreable. Usamos nuevos vectores plasmídicos 3 albergar celulares específicos de tipo promotores / potenciadores que dirigen la expresión de un marcador de la proteína fluorescente, seguido directamente por un transcrito de miR30-RNAi 4 (localizado dentro de la UTR 3 &#39;del ADNc que codifica la proteína fluorescente) ( Figura 1). Cuando electroporación en el tubo neural en desarrollo, estos vectores provocar downregulation eficiente de la expresión génica y expresar proteínas marcadoras fluorescentes brillantes para permitir el rastreo directo de las células que experimentan desmontables 3. Mezclando diferentes vectores de RNAi antes de la electroporación permite la caída simultánea de dos o más genes en regiones independientes de la médula espinal. Esto permite complejas interacciones celulares y moleculares que se examinaron durante el desarrollo, de una manera que es rápida, simple, preciso y barato. En combinación con Dil trazado de trayectorias de axones comisurales en preparaciones de libro abierto 5, este método es una herramienta útil para estudios in vivo de los mecanismos celulares y moleculares de crecimiento de los axones de la comisura y orientación. En principio, cualquier promotor / potenciador se podría utilizar, lo que podría hacer la técnica más ampliamente aplicable para estudios in vivo de la función de genes durante el desarrollo 6. Este primer video muestra cómo controlar y huevos de ventana, la inyección de los plásmidos de ADN en el tubo neural y el procedimiento de electroporación. Para investigar guía de axones comisurales, la médula espinal se retira del embrión como una preparación a libro abierto, fijado, e inyectados con Dil, para permitir que las vías axonales a ser rastreado. La médula espinal está montado entre cubreobjetos y se visualizaron mediante microscopía confocal.

Un método por el cual la expresión de genes en el tubo neural puede ser regulada hacia abajo en un tipo de células específicas, de manera detectable se describe. Demostramos cómo<em&gt; In ovo</emElectroporación&gt; de base microRNA-plásmidos que provocan interferencia de ARN espaciotemporalmente controlada puede ser usada para investigar guiado de los axones de la comisura en el tubo neural en desarrollo.

En electroporación in ovo de base miARN plásmidos en el tubo neural en desarrollo y evaluación de fenotipos por inyección de Dil en los preparativos libro abierto

Las neuronas dI1 comisurales han sido estudiadas exhaustivamente para dilucidar los mecanismos subyacentes a la guía axonal durante el desarrollo1,2. Estas neuronas son ...

El objetivo de este procedimiento es evaluar los defectos en la guía axonal en el tubo neural de pollo tras la reducción específica de la expresión génica de manera rastreable según el tipo celular. Esto se logra preparando huevos de pollo fertilizados para la electroforesis in ovo, realizando una ventana en el cascarón. El segundo paso consiste en inyectar y electrotransfectar constructos de ADN que codifican microARNs en el tubo neural.A continuación, se disecan las médulas espinales electroestimuladas y se fijan en preparaciones planas montadas en forma de libro abierto. El paso final consiste en inyectar un colorante fluorescente para visualizar las proyecciones axónicas. Finalmente, se utiliza microscopía fluorescente para mostrar tanto las células que experimentan silenciamiento génico como para evaluar los efectos posteriores sobre la guía de los axones comisurales.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es el silenciamiento específico de genes según el tipo celular. Para preparar los plásmidos, consulte el protocolo escrito para obtener instrucciones. Incube los huevos a 38,5 grados Celsius y alrededor del 45 % de humedad hasta alcanzar la etapa

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Este video muestra la forma de visualizar las vías axonales de grupos genéticamente definidos de neuronas en la médula espinal de embriones de pollo que...

Descifrar Caminos axonal de los grupos definidos genéticamente las neuronas en el tubo neural del polluelo Utilizando In ovo La electroporación

En la electroporación in utero es un método valioso para la transfección de células progenitoras neuronales in vivo. Dependiendo de la colocación de los electrodos y el punto de tiempo en el desarrollo de la electroporación, ciertos subconjuntos de células corticales pueden ser atacadas. Células afectadas puede ser analizada en vivo o in vitro para los efectos de la alteración genética.

En el útero de electroporación seguido por cultivos neuronales primarias para estudiar la función génica en el subconjunto de neuronas corticales

En el útero de la electroporación permite la entrega rápida de genes en un espacio-temporal y controlado de manera en el desarrollo del sistema nervioso central (SNC). Aquí se describe una muy adaptable en el protocolo de electroporación in utero que puede ser utilizado para entregar las construcciones de expresión en múltiples dominios del SNC embrionario, incluyendo el telencéfalo, diencéfalo y la retina.

Entrega génica eficaz en los territorios del SNC múltiples utilizando In Utero La electroporación

Este estudio describe el desarrollo de...

En electroporación in vitro del labio inferior rómbico mitad de la gestación de embriones de ratón

Para evaluar la función y la regulación de los genes durante el desarrollo de las neuronas del cerebro medio dopaminérgico, se describe un método que consiste...

En electroporación in ovo en el mesencéfalo polluelo para estudiar la función génica en el desarrollo neuronal dopaminérgica

El control de la expansión de células madre somáticas es un factor importante que impide su estudio y uso en terapia. Aquí se describe un sistema para controlar temporalmente madre neural expansión células durante el desarrollo y la edad adulta, que se puede utilizar para aumentar el número de neuronas generadas en el cerebro de ratón.

La expansión de las células madre embrionarias y adultas neurales por<em&gt; In Utero</em&gt; La electroporación o inyección estereotáxica Viral

La expresión ectópica es una técnica para dilucidar el papel microRNAs en el desarrollo del cerebro. Sin embargo, la focalización en áreas específicas mediante electroporación in ovo es un reto. Aquí, se muestra una forma eficiente a las regiones del cerebro medio ventral y dorsal selectiva electroporar.

En Expression in ovo de microARN en ventral del polluelo Midbrain

Presentamos la transgénesis y transitoria gen desmontables en Ciona intestinalis, un grupo hermano cordado a los vertebrados, utilizando técnicas de microinyección y electroporación. Tales métodos facilitan la genómica funcional en este sencillo de invertebrados que cuenta con características rudimentarias de vertebrados, incluyendo notocorda y epitelios sensoriales cabeza, y muchos ortólogos de genes de enfermedades humanas asociadas.

La microinyección de embriones y la electroporación en el Chordate<em&gt; Ciona intestinalis</em

Hemos desarrollado un nuevo enfoque de pérdida de función que implica la introducción e integración genómica de secuencias artificiales de micro-ARN en embriones de pollo mediante el uso de electroporación in ovo y el sistema de transposones Tol2. Esta técnica proporciona una metodología de eliminación de genes robusta y estable para estudios de la función de los genes durante el desarrollo.

Enfoque de pérdida de función en la retina embrionaria de pollo mediante el uso de la expresión transgénica mediada por transposones Tol2 de microARN artificiales

En este protocolo, describimos cómo inyectar lentivirus la cavidad amniótica del ratón en E7.5, lo que lleva a una transducción uniforme de toda la placa neural, con efectos perjudiciales mínimos sobre la supervivencia o el desarrollo embrionario.

Focalización de la placa neural murina mediante nanoinyección in utero (NEPTUNE) en el día embrionario 7.5

Aprende electroporación in ovo con plásmidos basados en miARN para estudiar guía de axones conmuturales en el tubo neural de pollo. Este método permite silenciar genes específicamente por tipo celular.

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