Name: 1 F O ATPasa preparación de vesículas y técnica para realizar Patch clamp grabaciones de membranas de la vesícula submitocondriales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Aprende a aislar vesículas submitocondriales con F1FO ATPasa de cerebro de rata para realizar grabaciones de patch clamp. Este método permite estudiar la actividad y modulación del complejo ATP sintasa mitocondrial.

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1. Cerebro mitocondrial aislamiento (Adaptado de Brown MR et al. 9) <ol><li> Sacrificar la rata utilizando métodos aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión (IACUC). </li><li> Cortar la cabeza del animal por decapitación, cortar la piel y exponer el cráneo. </li><li> Abra el cráneo suavemente cortando con unas tijeras o pinzas gubias. Retire el cerebro. </li><li> Picar finamente el cerebro sin cerebelo en tampón de aislamiento (véase el cuadro 1) y transferirlo a un ml de vidrio / teflón homogeneizadora 5 (ver lista de equipo). </li><li> Homogeneizar el tejido con cuidado 10 veces (sin burbujas), aproximadamente 5 min. </li><li> Centrifugar la muestra a 1500 × g durante 10 min a 4 ° C en una centrífuga de sobremesa. </li><li> Guardar el sobrenadante (mitocondrial y sinaptosomas) y desechar el sedimento (materiales nucleares y desechos celulares). Centrifugar a 16.000 × g durante 10 min a 4 ° C en una centrífuga de sobremesa. </li><li> Descartarsobrenadante y volver a suspender el pellet en 500 l de tampón de aislamiento. Interrumpir sinaptosomas con un vaso ruptura celular (ver lista de equipo). Aplicar una presión de 1200 psi durante 10 min, seguido de una descompresión rápida. </li><li> Capa de la mezcla en gradientes de Ficoll (ver Tabla 2), lugar en el SW-50.1 rotor y se centrifuga a 126500 × g durante 20 min a 4 ° C en una ultracentrífuga (ver lista de equipo). El sedimento es la mitocondria purificada, la capa entre las diferentes densidades de Ficoll es sinaptosomas ininterrumpido. </li><li> Lavar la pella por centrifugación en tampón de aislamiento a 16.000 × g durante 10 min a 4 ° C en una centrífuga de sobremesa. </li></ol> 2. Submitocondriales vesículas (SMV) Aislamiento (Adaptado de Chan et al. 10) <ol><li> Vuelva a suspender las mitocondrias en 200 l de tampón de aislamiento combinada con un volumen igual de 1% de digitonina y dejar reposar en hielo durante 15 min. </li><li> Agregue más Buff Aislamientoer y se centrifuga a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C en una centrífuga de sobremesa. Haga esto dos veces. </li><li> Vuelva a suspender el pellet en 200 l de tampón de aislamiento y añadir 2 l de 10% Lubrol PX (C12E9). Mezcle y deje reposar en hielo durante 15 min. </li><li> Capa de mezcla en tampón de aislamiento, lugar en SW-50.1 rotor y se centrifuga a 182000 × g a 4 º C durante 1 hora. </li><li> Lavar sedimento final mediante centrifugación en una centrífuga de sobremesa en tampón de aislamiento a 16.000 × g durante 10 min a 4 ° C. </li></ol> 3. Registro electrofisiológico <ol><li> Una típica plataforma de electrofisiología incluye un amplificador, un ordenador PC equipado con una interfaz de convertidor de analógico a digital Digidata 1440A en conjunto con software de pClamp10.0, manipuladores, un microscopio, una mesa de aislamiento de vibraciones, jaula de Faraday. </li><li> Tubos capilares de vidrio de borosilicato se insertan en un Flaming / Brown Micropipetas Extractor modelo P-87. Un programa de pipeta-extractor está optimizado paragenerar pipetas con resistencias entre 80 a 100 mW. </li><li> SMVS se colocan en una solución fisiológica intracelular (ATP se añadió en el momento apropiado durante la grabación) (Tabla 3). Pipetas de patch clamp se llenan con la misma solución (sin ATP). Las grabaciones se realizan mediante la formación de un sello giga-ohmios en SMVS a temperatura ambiente. Las vesículas se visualizan por microscopía de contraste de fases con un microscopio invertido Nikon o Zeiss. </li><li> El potencial de membrana se mantiene a voltajes que van desde -100 mV a + 100 mV durante períodos de 10 segundos. Las grabaciones se filtraron a 5 kHz utilizando los circuitos del amplificador. Nivel de ruido eléctrico o parásita no específica de menos de 1 pA son deseables para la grabación de éxito. </li><li> Los datos se analizaron con el software de Clampfit 10.0, por ejemplo, para determinar la frecuencia y la amplitud de los eventos de un solo canal. La dependencia de voltaje es determinada por el trazado de una relación actual tensión. </li></ol>

<ol><li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li>
<li>Duchen, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+calcium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and calcium in health and disease.</a> Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).</li>
<li>Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+mitochondrial+membrane+permeability+in+pathogenesis%2C+autophagy+and+control+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism.</a> J. Gastroenterol. Hepatol. 22, Suppl 1. S31-S37 (2007).</li>
<li>Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothesis.+The+mechanism+of+ATP+synthase.+Conformational+change+by+rotation+of+the+beta-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit.</a> Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).</li>
<li>Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+ATP+synthase%3A+a+reassessment+of+the+functions+of+the+b+and+a+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits.</a> Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).</li>
<li>Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bcl-2+family%3A+roles+in+cell+survival+and+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis.</a> Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).</li>
<li>Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+proteins%3A+regulators+of+apoptosis+or+of+mitochondrial+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis.</a> Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).</li>
<li>Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-xL+regulates+metabolic+efficiency+of+neurons+through+interaction+with+the+mitochondrial+F1FO+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase.</a> Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).</li>
<li>Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+disruption+of+synaptoneurosomes%3A+an+alternative+method+to+isolate+brain+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria.</a> Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).</li>
<li>Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+ultrastructural+properties+of+a+mitochondrial+inner+membrane+fraction+deficient+in+outer+membrane+and+matrix+activities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities.</a> J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).</li>
<li>Young, H. K. o, Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ATP+Synthasomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ATP Synthasomes.</a> J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Los métodos descritos en este documento permiten el aislamiento de las mitocondrias pura al final de la etapa 1 y las vesículas submitocondriales (SMVS) después de la etapa 2 a partir de todo el cerebro y sin distinción de células phenotypes.SMVspurified por este método están esencialmente libres de contaminación por otros orgánulos subcelulares como se muestra en Figura 1 y nuestro trabajo anterior (Alavian KN et al. 8) y conservar su integridad estructural y funcional antes de la c...

<table><tbody><tr><td>Mortero de tejidos Potter-Elvehjem con pistilo de PTFE</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>1-7725T-5</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Eppendorf 5424 </td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente para la ruptura celular 4639</td><td>Parr Instrument Company</td><td>4639</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5415</td><td></td></tr><tr><td>Tubos centrífugos de policarbonato</td><td>Beckman Coulter</td><td>P20314</td><td></td></tr><tr><td>Rotor SW-50.1 </td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga L8-70M</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>Lubrol PX (C12E9) </td><td>Calbiochem</td><td>205534</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B </td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440A </td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pClamp10.0</td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manipulador</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capilar de vidrio borosilicatado</td><td>World Precision Instruments</td><td>1308325</td><td></td></tr><tr><td>Modelo de micropipeteador Flaming/Brown P-87</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

<sub&gt; 1</sub&gt; f<sub&gt; o</sub&gt; atpasa preparación de vesículas y técnica para realizar patch clamp grabaciones de membranas de la vesícula submitocondriales

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Las mitocondrias están implicadas en muchas funciones celulares importantes, incluyendo el metabolismo, la supervivencia a 1, el desarrollo y la señalización de calcio 2. Dos de las funciones mitocondriales más importantes están relacionados con la producción eficiente de ATP, la energía de la célula, por la fosforilación oxidativa, y la mediación de señales para la muerte celular programada 3. La enzima principal responsable de la producción de ATP es la sintasa F1FO-ATP, también llamada ATP sintasa 4-5. En los últimos años, el papel de las mitocondrias en la muerte celular apoptótica y necrótica ha recibido una atención considerable. En la muerte celular apoptótica, Bcl-2 proteínas de la familia tales como Bax entran en la membrana mitocondrial externa, oligomerize y permeabilizan la membrana externa, la liberación de factores pro-apoptóticos en el citosol 6. En la muerte celular necrótica clásico, tal como la producida por la isquemia o la excitotoxicidad en neuronas, un largE, aumento mal regulado en calcio matriz contribuye a la apertura de un poro de la membrana interna, el poro de transición de permeabilidad mitocondrial o mPTP. Esto despolariza la membrana interna y causa cambios osmóticos, lo que contribuye a la ruptura de la membrana externa, la liberación de factores pro-apoptóticos, y la disfunción metabólica. Muchas proteínas incluyendo Bcl-xL 7 interactúan con F1FO ATP sintasa, modulando su función. Bcl-xL interactúa directamente con la subunidad beta de la ATP sintasa F1FO, y esta interacción disminuye la conductancia de una fuga dentro de la F1FOATPasecomplex, el aumento de la red de transporte de H + por F1FO durante F1FO actividad ATPasa 8 y aumentando así la eficiencia mitocondrial. Para estudiar la actividad y la modulación de la ATP sintasa, se aislaron a partir de cerebro de roedores vesículas submitocondriales (SMVS) que contienen F1FO ATPasa. Los SMVS conservan la integridad estructural y funcional de la F1FO ATPasa como se muestra en Alavian et al. Aquí se describe un métodoque hemos usado con éxito para el aislamiento de SMVS de cerebro de rata y delinear la técnica de patch clamp para analizar la actividad del canal (la conductancia de iones de fuga) de los SMVS.

El primer paso de nuestro protocolo permite el aislamiento de mitocondrias purificadas como se muestra por Western blot en la Figura 1. En la Figura 2 se muestra un ejemplo de una grabación parche vesícula submitocondriales derivado del cerebro. Uso de la configuración de parche de dentro a fuera se demuestra la actividad del canal modulado por la ATP. El control (CTL) de grabación (izquierda) muestra la actividad del canal de múltiples conductancia con un pico de conductancia de 600 pS...

Un método para aislar vesículas submitochondrial enriquecidas en F1FO complejos ATP sintasa de cerebro de rata se describe. Estas vesículas permiten el estudio de la actividad de ATPasa F1FO complejo y su modulación mediante la técnica de la grabación de patch clamp.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; ATPasa preparación de vesículas y técnica para realizar Patch clamp grabaciones de membranas de la vesícula submitocondriales

Las mitocondrias participan en muchas funciones celulares importantes, entre ellas el metabolismo, la supervivencia1, el desarrollo y la señalización de calcio2. Dos de las más...

El objetivo general de este procedimiento consiste en aislar vesículas F1 F cero APAs del cerebro de rata para realizar grabaciones mediante el método de "patch clamp". Esto se logra primero extrayendo el cerebro de una rata y homogenizándolo. El segundo paso consiste en interrumpir las zonas sinápticas aplicando presión.A continuación, los sinaptosomas se colocan en capas sobre los gradientes de frascos. El último paso consiste en incubar con digitonina y L para obtener las vesículas finales destinadas a la grabación mediante el método de "patch clamp". Una función importante de las mitocondrias es la producción de ATP mediante fosforilación oxidativa.La enzima responsable de la producción de TP es la ATP sintasa ubicada en la membrana interna mitocondrial. Para estudiar en detalle la función de la ATP sintasa, aislamos unas vesículas submitocondriales especiales que denominamos SMVs. Estas contienen la enzima ATP sintasa en una configuración invertida (de adentro hacia afuera).Luego registramos estos VMPS con un electrodo de registro por parche y determinamos la permeabilidad de su membrana. Esto nos indica la eficiencia de la producción de TP por parte de las mitocondrias. Hoy, Sylvia Ti, investigadora posdoctoral en mi laboratorio de la Universidad de Yale, demostrará este procedimiento.En este procedimiento, tras obtener la cabeza de una rata mediante decapitación, corte la piel para exponer el cráneo y luego abra el cráneo suavemente cortándolo con un par de tijeras o Rons. Posteriormente, retire el cerebro, pique el cerebro sin el cerebelo finalmente aislado, tampone y luego transfiéralo a un homogenizador de vidrio y teflón de cinco mililitros; homogenice suavemente el tejido 10 veces, aproximadamente cinco minutos en total. Después de eso, centrifugue la muestra a 1.500 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius en una centrífuga de banco.Guarde el sobrenadante con mitocondrias y sinaptosomas y deseche el sedimento. A continuación, centrifugue nuevamente a 16.000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius en una centrífuga de mesa. Luego, deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento en 500 microlitros de tampón de aislamiento. Rompa los sinaptosomas utilizando un recipiente de ruptura celular aplicando una presión de 1.200 PSI durante 10 minutos, seguido de una descompresión rápida. Aplique las zonas sinápticas disruptadas sobre los tubos de centrífuga con dos concentraciones diferentes de fial que formarán dos capas.A continuación, coloque los tubos en un rotor SW 50.1 y centrifugue a 126.500 ×g durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. En una ultracentrífuga, el sedimento es la mitocondria purificada. La capa entre las diferentes densidades del fial es el sinaptosoma no interrumpido.A continuación, lave el precipitado mediante centrifugación en tampón de aislamiento a 16.000 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius en una centrífuga de sobremesa. Ahora, resuspenda las mitocondrias en 200 microlitros de tampón de aislamiento, combinado con un volumen igual de digitonina al 1 %.Colóquelo en hielo durante 15 minutos. A continuación, agregue más tampón de aislamiento y centrifugue a 16.000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Repita este procedimiento dos veces, luego resuspenda el pellet en 200 microlitros de tampón de aislamiento y agregue dos microlitros de 10 % Lu bra, PX, mezcle y coloque en hielo durante 15 minutos.Después de eso, coloque la mezcla en capas en el tampón de aislamiento dentro de los tubos de centrífuga. Coloque los tubos en un rotor SSW 50.1 y centrifugue a 182,000 ×g a cuatro grados Celsius durante una hora. Después de una hora.Lave la paleta final centrifugándola en tampón de aislamiento a 16.000 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Un equipo típico de electrofisiología incluye un amplificador, un ordenador PC equipado con un digi data 1,440, una interfaz conversora analógica-digital junto con manipuladores de software P clamp 10.0, un microscopio, una mesa de aislamiento de vibraciones y una jaula de Faraday. Primero, tire de un pipeta a partir de un tubo capilar de vidrio borosilicatado en un tirador de micropipetas flaming brown.La resistencia óptima de la pipeta debe estar entre 80 y 100 megaohmios. Añada las vesículas submitocondriales en una solución intracelular fisiológica. A continuación, llene una pipeta para registro de parche con la misma solución.Visualice las vesículas en contraste de fase. Microscopía después de que las SMV se sellen a temperatura ambiente. Registre la actividad cuando el potencial de membrana se mantiene en un voltaje que varía desde -100 milivoltios hasta +100 milivoltios durante 10 segundos en cada período.Los datos registrados se filtran a cinco kilohercios utilizando la circuitería del amplificador y se analizan con el software Clampfit 10.0. Esta figura muestra la transferencia de lisado preparado a partir del citosol y las mitocondrias. El panel superior muestra una inmunotransferencia utilizando un anticuerpo contra la proteína citosólica GA dh.El panel inferior muestra una tinción con un anticuerpo contra la proteína de la membrana interna mitocondrial. Cox cuatro Aquí se presentan dos grabaciones representativas de registro de parche antes y después de la adición de un milimolar de a TP. El potencial de sostenimiento es de setenta milivoltios positivos. La línea punteada representa cero picoamperios.Cada traza se registra durante 10 segundos y hay 10 segundos entre trazas y se muestran. A continuación se muestran trazas de ejemplo de los cambios en la intensidad de fluorescencia del indicador CMA a lo largo del tiempo en presencia de VMs y en ausencia y presencia de una TP. Después de ver este video, debería tener una comprensión clara de cómo aislar mitocondrias y una vesícula submitocondrial que contiene la ATP sintasa F1 FO 80 TP. Además, debería comprender cómo formar un sello resistente de tipo sellado con un electrodo sobre la membrana de la vesícula para analizar la actividad del canal del complejo ATP sintasa.

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Esta pretende ser una introducción a la revisión de la grabación de la abrazadera ovocitos de Xenopus laevis. Cubre la eliminación vitelina membrana, la formación de un sello gigaohm (gigaseal), y la conversión opcional de la revisión a la topología de fuera-out.

Parche de grabación Clamp de canales iónicos expresados ​​en ovocitos de Xenopus

Corriente iónica de los canales BK se registraron con la técnica de patch clamp. Canales BK se expresan...

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

Este protocolo describe una técnica llamada electrofisiología de pinza de parche de célula completa, que es un método para estudiar las propiedades eléctricas de las neuronas de Mauthner y otras células reticuloespinales en embriones de pez cebra.

Electrofisiología de pinza de parche de célula completa: un método para estudiar las propiedades eléctricas de las neuronas

Hemos desarrollado una preparación espinal cerebral espinal intacta para registrar y monitorear la actividad eléctrica a través de la grabación de patch clamp de las neuronas y otras células de Mauthner reticulospinal en embriones de pez cebra. Por lo tanto, somos capaces de registrar las corrientes sinápticas excitatorias e inhibitorias, la actividad del canal dependiente de voltaje y los potenciales de acción de las neuronas clave en un embrión en desarrollo.

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Reconstitución de una proteína transmembrana, el canal iónico dependiente de voltaje, KvAP, en Gigante vesículas unilamelares para Microscopía y Patch Clamp Estudios

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Aprende a aislar vesículas submitocondriales con F1FO ATPasa de cerebro de rata para realizar grabaciones de patch clamp. Este método permite estudiar la actividad y modulación del complejo ATP sintasa mitocondrial.

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