₁ F _O ATPasa preparación de vesículas y técnica para realizar Patch clamp grabaciones de membranas de la vesícula submitocondriales

El objetivo general de este procedimiento es aislar vesículas F1 F zero APAs del cerebro de rata para realizar registros de pinzas de parche. Esto se logra primero extrayendo el cerebro de una rata y homogeneizándolo. El segundo paso es interrumpir las zonas sinápticas mediante la aplicación de presión.

A continuación, los sinaptosomas se superponen sobre los gradientes de la ampolla. El paso final es incubar con los dedos toin y L para obtener las vesículas finales para el registro de la pinza del parche. Una función importante de las mitocondrias es la producción de TP por fosforilación oxidativa.

La enzima responsable de la producción de TP es la A TP sintasa ubicada en la membrana interna mitocondrial. Para estudiar en detalle la función de la A TP sintasa, aislamos vesículas submitocondriales especiales que llamamos SMVs. Contienen la enzima A TP sintasa en una configuración de adentro hacia afuera.

A continuación, registramos estos SMV con un electrodo de fijación de parche y determinamos la permeabilidad de su membrana. Eso nos habla de la eficiencia de la producción de TP por parte de las mitocondrias. La demostración de este procedimiento estará hoy a cargo de Sylvia ti, becaria postdoctoral en mi laboratorio en la Universidad de Yale.

En este procedimiento, después de obtener la cabeza de una rata por decapitación, se corta la piel para exponer el cráneo, luego se abre el cráneo suavemente cortándolo con unas tijeras o Rons. Posteriormente, extraiga el cerebro, triture el cerebro sin el cerebelo finalmente en aislamiento, tampone, luego transfiéralo a un homogeneizador de teflón de vidrio de cinco mililitros para homogeneizar suavemente el tejido 10 veces, aproximadamente cinco minutos en total. Después de eso, centrifugar la muestra a 1.500 veces G durante 10 minutos a cuatro grados Celsius en una centrífuga de sobremesa.

Guarde el sobrenadante con mitocondrias y sinaptosomas y deseche la bolita. A continuación, vuelva a centrifugarlo a 16.000 veces, G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados en una centrífuga de sobremesa. A continuación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el paladar En 500 microlitros de tampón de aislamiento interrumpa el sinaptosoma con un recipiente de disrupción celular aplicando una presión de 1, 200 PSI durante 10 minutos, seguido de una capa de descompresión rápida de las zonas de sinapa interrumpidas en los tubos de centrífuga con dos concentraciones diferentes de fial que formarán dos capas.

A continuación, coloque los tubos en un rotor SW 50.1 y centrifugue a 126, 500 veces G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. En una ultracentrífuga, el paladar es la mitocondria purificada. La capa entre las diferentes densidades de fial es el sinaptosoma ininterrumpido.

Después, lave el pellet centrifugando de forma aislada. Tampón a 16.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados en una centrífuga de sobremesa. Ahora Resus, suspenda las mitocondrias en 200 microlitros de tampón de aislamiento, combinado con un volumen igual de 1%digit toin.

Colócalo sobre hielo durante 15 minutos. A continuación, agregue más aislamiento, tampón y centrifuga a 16.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Repita este procedimiento dos veces, luego vuelva a suspender el paladar en 200 microlitros de tampón de aislamiento, y agregue dos microlitros de sujetador 10%Lu, PX, mezcle y coloque en hielo durante 15 minutos.

Después de eso, coloque la mezcla en capas de aislamiento, tampón en los tubos de centrífuga. Coloque los tubos en un rotor SSW 50.1 y centrifugue a 182.000 veces G a cuatro grados centígrados durante una hora. Después de una hora.

Lave la paleta final centrifugandola en un tampón de aislamiento a 16.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Un equipo de electrofisiología típico incluye un amplificador, una computadora PC equipada con un digi data 1, 440, una interfaz de convertidor de analógico a digital junto con una abrazadera P, manipuladores de software 10.0, un microscopio, una mesa de aislamiento de vibraciones y una jaula de Faraday. En primer lugar, extraiga una pipeta de un tubo capilar de vidrio de silicato Boros en un extractor de micropipetas de color marrón llameante.

La resistencia óptima de la pipeta debe estar entre 80 y 100 mega ohmios. Añadir las vesículas submitocondriales en una solución intracelular fisiológica. A continuación, llene una pipeta de pinza de parche con la misma solución.

Visualice las vesículas bajo contraste de fase. Microscopía después de parchear los SMV a temperatura ambiente. Registre la actividad cuando el potencial de membrana se mantiene a un voltaje que oscila entre 100 milivoltios negativos y 100 milivoltios positivos durante 10 segundos en cada período.

Los datos registrados se filtran a cinco kilohercios utilizando el circuito del amplificador y se analizan con el software clamp fit 10.0. Esta figura muestra el ceblo de lisado preparado a partir de citosol y mitocondrias. El panel superior muestra un inmunoblot utilizando un anticuerpo contra la proteína citosólica GA dh.

El panel inferior muestra una transferencia que utiliza un anticuerpo contra la proteína de la membrana interna mitocondrial. A continuación, se presentan dos registros representativos de la pinza de parche antes y después de la adición de un milimolar a TP. El potencial de retención es positivo de 70 milivoltios. La línea discontinua representa cero picoamperios.

Cada seguimiento se registra durante 10 segundos y hay 10 segundos entre los seguimientos y se muestran. A continuación se muestran los ejemplos de trazas de los cambios en la intensidad de fluorescencia del indicador A CMA a lo largo del tiempo en presencia de SMV y en ausencia y presencia de un TP. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar las mitocondrias, una vesícula submitocondrial que contiene F1 FO 80 TP Synthes. Además, debe comprender el sellado resistente de la forma I con un electrodo en la membrana de la vesícula para analizar la actividad del canal del complejo A TP Syntasa.