Name: Citometría de masas: Protocolo para la afinación y servicio diario muestras de células en un citómetro de masas CyTOF (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Aprende el protocolo de afinación diaria y análisis de muestras celulares en citómetro de masas CyTOF. Este método optimiza la preparación de muestras y la tasa de flujo para maximizar la señal y garantizar datos celulares de alta calidad.

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Nos gustaría dar las gracias al Dr. Evan Newell y el Dr. Sean Bendall para la retroalimentación. También nos gustaría dar las gracias Ciencias DVS y el Dr. Sean Bendall para una muestra de las perlas de poliestireno múltiples que contienen lantánidos. Estamos muy agradecidos por la financiación de los NIH subvención AI057229 U19 2.

Todas las muestras de células para la CyTOF debe ser fijada y permeabilizada. Esto permite una mayor entrada de la intercalador de ADN que contiene iridio, y también previene la lisis celular durante el lavado con agua MilliQ y resuspensión inmediatamente antes de la inyección en el citómetro de masa. 1. Puesta en marcha del citómetro de masas <ol><li> Abra el programa CyTOF. Seleccione Configuración del instrumento. En la ficha canastilla para tarjetas, vaya a la esquina inferior derecha y haga clic Calentador botón &quot;ON&quot;. Encender el calentador de al menos 15 min antes de tiempo deseado para permitir tiempo suficiente para que el manto cámara de pulverización para llegar a 200 ° C. </li><li> Sustituir el blanco Norm-Ject 3 ml jeringa en la bomba de jeringa con una jeringa llena de agua fresca MilliQ. </li><li> Limpieza del nebulizador. Dejen pasar el nebulizador mediante el uso de la jeringa y el tubo para tirar 5% Citranox 2-3 veces a través del puerto más pequeño de introducción de líquido y el orificio de introducción de gas más grande. Repita el lavado a contracorriente con agua MilliQ to eliminar Citranox residual. </li><li> Confirme que las luces en el panel frontal de la CyTOF se encienden como en la figura 1. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig1.jpg" /> Figura 1. CyTOF luces del panel antes de arrancar. <ol start="5"><li> Abra la válvula del tanque de gas argón. Esto debería hacer que el &quot;ARGON&quot; luz en la parte frontal para encenderla. </li><li> Conecte el nebulizador para el maquillaje de entrada de gas. Desenrosque el maquillaje conector de gas y retire la tubería de caucho negro o-ring y la pieza de plástico blanco cónico. Tenga en cuenta la más amplia &quot;nudillo&quot; en el vástago del orificio de introducción de gas del nebulizador. Coloque el conector en el orificio de introducción de gas. Coloque el negro o-anillo sobre el extremo de la conexión de gas, y la fuerza de la junta tórica más allá de la parte más ancha del vástago de puerto. Coloque la pieza cónica de plástico blanco en la parte superior con el extremo estrecho señalado, y el tornillo en el tubo de gas de maquillaje. </li><li&gt; Conecte el nebulizador para el tubo de introducción de líquido. Cuidadosamente inserte el tubo pequeño en la abertura en el extremo del nebulizador. Habrá dos paradas, similar en sentir a las paradas en una micropipeta. En primer lugar, presione hasta que encuentre resistencia a la luz, y el extremo del tubo pequeño debe estar al final de la recta de vidrio. En segundo lugar, presionar con más fuerza para obligar al final de la sección recta de vidrio adicional en la conexión y apriete el tornillo de ajuste para sellar. Insertar el extremo del nebulizador en la abertura blanco en el manto de calentamiento. </li><li> En la ficha Controlador RFG de la ventana de configuración del instrumento, pulse el botón &quot;Start Plasma&quot;. Desde el nebulizador ya está insertado, pulse el botón &quot;OK&quot;. El software se encenderá el enfriador, iniciar el flujo de gas, y encender un plasma. El detector de tensión se elevará. Habrá una ventana pop-up diciendo &quot;Plasma secuencia de arranque ha finalizado con éxito&quot; cuando haya terminado, pulse el botón &quot;OK&quot;. Nuevas luces debe estar activada en el panel frontal (Figura 2 </strong<html> &gt;). </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig2.jpg" /> Figura 2. CyTOF luces del panel de plasma después de encendido y puesta en marcha se completó correctamente. <ol start="9"><li> Encender la bomba de jeringa. En la esquina superior derecha, pulse el botón verde &quot;play&quot; para iniciar la bomba de jeringa y comience a fluir líquido a través del tubo y la pulverización del nebulizador. Los ajustes por defecto son para jeringas 3 ml de agua. Para que muestra que se circula a través del bucle de muestra, la bomba de jeringa debe ser cambiado periódicamente cuando se ejecuta fuera del agua. En la parte superior de la pantalla, hay un contador que indica la cantidad de líquido ha fluido fuera de la bomba de jeringa. La bomba de jeringa se detendrá cuando este contador llega a &quot;3,000&quot; o el émbolo llega al final de la jeringa. Al rellenar la jeringa, se debe pulsar &quot;stop&quot; en lugar de la nada &quot;pausa&quot; para reiniciar el contador. </li></ol>e &quot;2&gt;. Calibración diaria del citómetro de masas <ol><li> El citómetro de masas se requiere aproximadamente 20 minutos para conseguir un plasma caliente y estable antes de la calibración. El propósito de los pasos de sintonía es maximizar la señal deseada de Tm169 o Tb159 manteniendo &quot;Gd155&quot; (óxido; La139 + O16) de la señal por debajo del 3% del valor más alto. Haga clic en el botón Configuración para abrir Adquisición de adquisición de datos Configuración de la ventana. En la pestaña de analitos, haga clic en la tabla periódica para abrir el panel de selección de isótopos. Seleccione los isótopos en la solución de sintonización DVS Ciencias aparecen en el manual, a continuación, haga clic en &quot;Guardar&quot;. </li><li> Haga clic en los Isótopos por lectura para abrir la Masa (s) por la ventana de lectura. Seleccione &quot;impulsos de contaje&quot;, y reescalar el eje introduciendo un nuevo número y pulsar &quot;enter&quot;. </li><li> Llene un verde 1 ml Norma-Ject jeringa con la solución de sintonización. Gire el selector de puerto de la muestra a &quot;LOAD&quot;, inyectar 450 l de solución de sintonización, gire el selector a &quot;inyectar&quot;. En la ficha Calibración de masas de la Acquisit datos<html> ion ventana de Configuración, pulse el botón &quot;Ejecutar&quot; para controlar masas que fluyen por. El lado izquierdo de la ventana es menor masa, mientras que el lado derecho es mayor masa. Nota: ya habrá señales en la región TOF 9400-9800, debido a isótopos de xenón en el gas argón (Figura 3). Espere hasta que los isótopos de afinación solución comenzará a aparecer en forma de líneas en esta pantalla (Figura 4). </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig3.jpg" /> Figura 3. Calibración de masas pestaña de la ventana, que muestra los niveles de base para varios isótopos después de la solución de lavado y enjuague con agua. La región alrededor de TOF 9400-9800 corresponde a los isótopos de xenón en el gas argón, y siempre debe estar presente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . 4 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4398/4398fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. Calibración de masas ventana de la ficha, que muestra rayas verticales para varios isótopos en la solución de sintonización DVS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <ol start="4"><li> Volver a la Masa (s) por la lectura ventana y pulse el botón verde botón &quot;Play&quot; en la esquina superior izquierda. Cada isótopo seleccionado en el paso 2,1 se representa por una línea de color diferente. El valor por defecto del eje X es &quot;Time&quot;, en el s. Monitorear los niveles de los diferentes isótopos hasta que se firme. </li><li> Sintonización de la corriente. En la ficha Parámetros de la ventana Configuración de adquisición de datos, seleccione &quot;Actual&quot; en el menú desplegable. Vamos a empezar a = 0, final = 10, valor de paso = 0,5, tiempo de establecimiento = 200, y pulse &quot;Guardar&quot;. Haga clic de nuevo en la Masa (s) por la ventana de lectura y pulsar el botón Reproducir. El eje x es ahora &quot;actual&quot;. Tenga en cuenta que las señales de los picos de los isótopos (Figura 5), y r<html> ECORD. En la pestaña Configuración de canales DAC de la ventana de configuración del instrumento, desplácese hacia abajo para &quot;actual&quot; e introduzca el nuevo valor. Pulse el botón &quot;Ajustar valor real actual&quot;, y luego &quot;Guardar&quot;. </li></ol><img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig5.jpg" /> Figura 5. Perfil de ajuste actual. <ol start="6"><li> Sintonización del gas de maquillaje. Cambiar el menú desplegable de &quot;Maquillaje de gas&quot;. Vamos a empezar = 0,55, final = 0,95, valor del paso = 0,05, tiempo de establecimiento = 200. Pulse Guardar. Regresar a la Masa (s) por la ventana de lectura y pulsar el botón Reproducir. El eje x es ahora &quot;maquillaje gas&quot; velocidad de flujo. Grabar en donde las señales de los picos de los isótopos. Observar el rápido aumento de la &quot;Gd155&quot; señal cerca del extremo (Figura 6). Volver a la ficha Configuración de canales DAC, desplácese hacia abajo para &quot;Maquillaje gas&quot;, e introduzca el nuevo valor. Pulse el botón &quot;Ajustar valor real actual&quot;, y luego &quot;Guardar&quot;. </li></ol>igura 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4398/4398fig6.jpg &quot;/&gt; Figura 6. Maquillaje perfil de ajuste de gas. <ol start="7"><li> Relación de grabación de isótopo deseado óxido vs. Hacer una segunda inyección de 450 l de solución de sintonización. En la ficha Parámetros, seleccione &quot;Time&quot; en el menú desplegable, vamos start = 0, final = 10, valor de paso = 1, el tiempo de establecimiento = 200. Pulse el botón &quot;guardar&quot;. Haga clic en &quot;play&quot; en Masa (s) por la lectura ventana. Después de que las líneas se han estabilizado (Figura 7), utilice el cursor para leer el valor en los cuadros superiores de la izquierda para Tm169 o Tb159 (valor superior) y también el &quot;Gd155&quot; valor (&lt;3% del valor más alto). Estos valores también se pueden guardar en un archivo de sintonización para referencia futura. </li></ol><img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig7.jpg" /> Figura 7. Medición de la intensidad de la señal de ajuste de solución después de la optimización gas actual y Maquillaje. <ol start="8"><li> La limpieza de sample circuito. Inyectar 3 ml de agua MilliQ a través del bucle de muestra, seguido por 500 l de solución de lavado DVS. Monitorear el progreso de la limpieza con el botón &quot;Ejecutar&quot; en la ficha Calibración de masas. Lavar hasta que la intensidad de las bandas (figura 4) empieza a disminuir, a continuación, siga por 3 ml de agua MilliQ y el monitor hasta que se establecen a niveles de fondo (Figura 3). </li></ol> 3. Muestras de servicio <ol><li> Abra la ventana de adquisición. Ajustes por defecto: hacer análisis = On-The-Fly, señal para el análisis de calibración = Dual, Dual Count = Datos. Reducción de ruido está activada. Cualquiera de estos puede cambiar si se desea. Introduzca el nombre del archivo. Todos los archivos deben ser guardados en el E :/ / unidad. </li><li> Ajuste de retardos de adquisición. Habrá un ligero retraso en el registro de eventos de células de aproximadamente 30 segundos debido a la longitud de la tubería entre el bucle de muestra y del nebulizador. Por lo tanto, la suma total de &quot;retardo de Adquisición&quot; y &quot;Detector stretardo de capacidad &quot;debe ser al menos 30 seg. retardo detector de estabilidad debe ser de al menos 20 seg. </li><li> Ajuste de la hora de recogida de datos. &quot;Tiempo de adquisición&quot; es el número de segundos que desea ejecutar su muestra. Llenar todo el bucle de muestra 450 l requeriría 600 segundos en completarse. Se sugiere que los 50-100 seg se añade al final del tiempo de ejecución para reducir al mínimo el arrastre de muestra. </li><li> La resuspensión de muestra. Para minimizar la acumulación de sales en la máquina, se sugiere que al menos dos lavados en agua MilliQ se realiza al final de la tinción de las células, seguido de una resuspensión final en agua MilliQ. El volumen de agua MilliQ para resuspender el sedimento de células pueden variar en función del número de células de partida y la recuperación de las células después del procedimiento de tinción entero. Un buen punto de partida es 10 6 (encender) células / ml. Después de la resuspensión, filtrar a través de un filtro de células para eliminar los agregados. </li><li> A partir de la muestra correr. Introduzca un nuevo nombre de archivo para la muestra actual.<html> Cambie la válvula de bucle muestra a &quot;LOAD&quot;, inyectar la muestra, vuelva a &quot;inyectar&quot;, después haga clic en &quot;Ejecutar&quot; en la ventana de adquisición. </li><li> Registro de acontecimientos celulares. Las células se representan en la ventana de instantáneas como las colecciones de las marcas horizontales en cada vertical isótopo marcador / canal (Figura 8). Mientras que el citómetro de masa puede registrar 1.000 células / sec, una mejor resolución entre los eventos celulares se obtiene normalmente a 300-500 células / sec. Esto corresponde a un promedio de ~ 1 célula / actualización de la pantalla. Puede tardar hasta 30 segundos antes de que el contador de eventos célula comienza a subir. Esto es debido a &quot;On-the-fly&quot; procesamiento de datos; no la información de eventos de células se pierde. </li></ol><img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig8.jpg" /> Figura 8. Ventana de adquisición durante ejemplo en ejecución, mostrando filas horizontales de manchas correspondientes a los elementos asociados con tres eventos celulares separadas.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ampliar la figura. <ol start="7"><li> Calidad de los eventos celulares. Observe cualquier fondo rayas en cada canal de isótopos, así como la velocidad de células de evento. El citómetro de masa reconoce un &quot;evento célula&quot; como un cierto aumento de señal por encima del fondo, por lo que la señal de fondo a partir de metal libre o no unido anticuerpo puede alterar el &quot;evento célula&quot; recuento. Además, ejecutando las células en una concentración demasiado alta puede causar un aumento en el número de eventos de doblete. Antecedentes puede ser disminuida por lavados adicionales o mayor dilución celular. Dobletes se puede minimizar mediante la dilución de células mayor, a costa de tiempo de ejecución mayor. </li><li> Acabado muestra adquisición de datos. Cuando el tiempo de adquisición se ha alcanzado, la recopilación de datos terminará. Habrá un poco de retraso antes de que una ventana pop-up con un &quot;OK&quot; aparece, de nuevo, esto se debe a &quot;On-the-Fly&quot; procesamiento de datos. Adquisición de las muestras también se puede parar Prematurely pulsando el botón &quot;Stop&quot;. En este caso, todos los eventos celulares ya inscritos serán contados y se transforma en archivos de salida. </li><li> La inyección de al menos 500 l de agua MilliQ entre cada muestra también ayuda a minimizar la contaminación de las muestras. </li></ol> 4. Limpieza de la máquina tras uso <ol><li> La solución de lavado. Después de que la muestra final se ejecuta y muestra el lazo de lavarse con agua, inyectar 450 l de solución de lavado en el circuito de la muestra. Controlar la liberación de metal libre en la ficha Calibración de masas de la ventana Configuración de adquisición de datos como en el paso 2,8 (Figura 9). Cuando la señal de metal libre comienza a disminuir, lavar con 3 ml de agua MilliQ y controlar los niveles de fondo hasta que se alcanzan. </li></ol><img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig9.jpg" /> Figura 9. Calibración de masas pestaña de la ventana, durante la limpieza post-carrera con solución de lavado DVS. Las rayas verticales en la región TOF 9800-11000 son etiqueta anticuerpo-isótopos que se están limpiando fuera de la máquina. Las rayas verticales alrededor TOF 11500 corresponden a los dos isótopos intercaladores IR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig9large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . 5. Cierre de la Máquina <ol><li> En la ficha Controlador RFG de la ventana de configuración del instrumento, seleccione &quot;Detener Plasma&quot;. Cuando el procedimiento se haya completado, habrá una ventana emergente que le solicitará que retire el nebulizador. Pulse el botón &quot;OK&quot;. En la ficha canastilla para tarjetas, apague el calentador. Cerrar la válvula en el suministro de argón. </li><li> La eliminación del nebulizador. Retire el nebulizador de la cámara de pulverización tirando cuidadosamente hacia atrás. Desenrosque el tubo de introducción de muestra de 1,6 pasos y coloque a un lado. Desenrosque el maquillaje conexión de introducción de gas para aflojar un poco y luego tirar el nebulizador. Dejando el racor atornillado se reducen las probabilidades de losing el negro junta tórica de goma y de plástico blanco pieza cónica. </li><li> Limpieza del nebulizador. Dejen ambos puertos del nebulizador con 5% Citranox usando la jeringa y el tubo como en el paso 1,3. Tienda, cubierta, en 5% Citranox hasta el próximo uso. </li></ol>

<ol><li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+Technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+Time-of-Flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).</li>
<li>Lou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer-based+elemental+tags+for+sensitive+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.%2C+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).</li>
<li>Majonis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curious+results+with+palladium-+and+platinum-carrying+polymers+in+mass+cytometry+bioassays+and+an+unexpected+application+as+a+dead+cell+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain.</a> Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).</li>
<li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+mass+cytometry+methods+for+bacterial+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination.</a> Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).</li>
<li>Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li>
<li>Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry+by+Time-of-Flight+shows+combinatorial+cytokine+expression+and+virus-specific+cell+niches+within+a+continuum+of+CD8%2B+T+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes.</a> Immunity. 36, 142-152 (2012).</li>
</ol>

Los autores del trabajo, tanto en el Centro de Monitoreo inmunológico humano, un centro de servicio en la Universidad de Stanford que cobra tarifas a los usuarios únicamente para recuperar el costo de los ensayos, incluyendo citometría de masas.

Para las últimas décadas, la citometría de flujo de fluorescencia ha sido un método caballo de trabajo para el análisis de células individuales, tanto en términos de expresión en la superficie y en ensayos funcionales. Sin embargo, los problemas de la superposición espectral de los colorantes fluorescentes se ha limitado el número de marcadores simultáneas. Mientras que los experimentos que utilizan más de 12 marcadores simultáneos se ha informado, el monto de la compensación necesaria que hace que este técnicamente dif...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> CyTOF TM masa citómetro </td><td> DVS Ciencias </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Solución de lavado </td><td> DVS Ciencias </td><td> 201071 </td><td> 0,05% de ácido fluorhídrico en agua </td></tr><tr><td> Ajuste solución </td><td> DVS Ciencias </td><td> 201072 </td><td> 0,5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, ácido nítrico rastro </td></tr><tr><td> Eu que contienen perlas de poliestireno </td><td> DVS Ciencias </td><td> 201073 </td><td> Contiene los isótopos naturales de abundancia de la UE; granos suministrados a aproximadamente 1 millón / mL </td></tr><tr><td> Múltiples que contienen lantánidos (La / Pr / Tb / Tm / Lu) - perlas de poliestireno </td><td> DVS Ciencias </td><td> Todavía no disponible en el mercado </td><td> Contiene abundancia natural de isótopos de lantánidos cotizadas </td></tr><tr><td> Ácido nítrico (concentrado) </td><td> Fisher Scientific </td><td> A467-500 </td><td> Optima rastro de metal puro ICP-MS grado </td></tr><tr><td> El poliestireno de fondo redondo de tubo con células colador cap-5mL </td><td> BD </td><td> 352235 </td><td> utiliza para filtrar las muestras de células antes de la inyección </td></tr><tr><td> Norma-Ject tuberkulin jeringa 1 ml </td><td> Henke Sass Lobo </td><td> 4010-200V0 </td><td> sin silicona, libre de látex </td></tr><tr><td> Norma-Ject-3 ml jeringa </td><td> Henke Sass Lobo </td><td> 4010.000V0 </td><td> sin silicona, libre de látex </td></tr><tr><td> MilliQ agua </td><td></td><td></td><td> 18 mW agua pura; no debe ser almacenado en botellas de vidrio o plástico que han sido lavadas con detergente comercial (debido a sus altos niveles de bario presente). </td></tr><tr><td> Citranox </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273236 </td><td> ácido detergente </td></tr><tr><td> Gas argón </td><td> Praxair </td><td> AR 5.0UH-T </td><td> 99,999% de pureza ultra alta </td></tr></tbody></table>

citometría de masas: protocolo para la afinación y servicio diario muestras de células en un citómetro de masas cytof

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

En los últimos años, el rápido análisis de células individuales que comúnmente se ha realizado usando citometría de flujo y anticuerpos marcadas con fluorescencia. Sin embargo, la cuestión de la superposición espectral de emisión de fluoróforo ha limitado el número de sondas simultáneamente. En contraste, el nuevo citómetro CyTOF masa por DVS pareja Ciencias un líquido único sistema de células de introducción a una ICP-MS. 1 En lugar de fluoróforos, polímeros quelantes que contienen altamente enriquecido isótopos metálicos están acopladas a anticuerpos u otras sondas específicas. 2-5 Debido a la pureza del metal y resolución de masa del citómetro de masa, no hay &quot;superposición espectral&quot; de isótopos vecinos, y por lo tanto no hay necesidad de matrices de compensación. Además, debido a la utilización de metales lantánidos, no hay fondo biológica y por lo tanto no equivalente de la autofluorescencia. Con una ventana de masa que abarca masa atómica 103-203, teóricamente hasta 100 etiquetas se podía distinguir simultáneamente. Actualmente, Más de 35 canales disponibles utilizando los reactivos quelantes disponible en Ciencias de la DVS, lo que permite una disección sin precedentes del perfil inmunológico de las muestras. 6-7 Las desventajas de la citometría de masa incluyen el requisito estricto de un isótopo de metal separado por sonda (no equivalente de dispersión frontal o lateral), y el hecho de que es una técnica destructiva (sin posibilidad de ordenar la recuperación). La configuración actual del citómetro de masa también tiene una velocidad de transmisión de células de sólo ~ 25%, por lo que requieren un número de entrada más alta de células. Óptimo rendimiento diario del citómetro de masas requiere varios pasos. El objetivo básico de la optimización es maximizar la intensidad de señal medida de los isótopos metálicos deseados (M) mientras se minimiza la formación de óxidos (M +16) que disminuirá la intensidad de la señal M e interferir con cualquier señal deseada a M +16. El primer paso es para calentar la máquina para un caliente, estable ICP plasma ha sido establecida. En segundo lugar, los ajustes para la velocidad de flujo de gas actual y el maquillaje debe ser optimizado en una base diaria. Durante la recogida de la muestra, la velocidad de células de evento máxima está limitada por la eficiencia del detector y la velocidad de procesamiento a 1000 células / segundo. Sin embargo, dependiendo de la calidad de la muestra, un tipo de célula caso, más lento (300-500 células / segundo) es por lo general deseable para permitir una mejor resolución entre los eventos de las células y por lo tanto maximizar singletes intactas sobre dobletes y escombros. Por último, la adecuada limpieza de la máquina al final del día ayuda a minimizar la señal de fondo debido a metal libre.

Siguiendo el protocolo anterior debe lograr cuatro cosas. En primer lugar, lo que permite suficiente tiempo de calentamiento para el citómetro de masas producirá un plasma caliente, estable necesaria para la formación óptima de la señal y óxido mínima. Segundo lavado adecuado del citómetro de masa con agua MilliQ y la solución de lavado DVS (Figura 9) ayudará a reducir los niveles de adsorción de metal a los tubos y otras partes de la máquina, lo que ayuda a reducir el fondo durante la adquisición de mu...

Las medidas necesarias para la sintonización diaria y la optimización del rendimiento de un citómetro de masa CyTOF se describen. Comentarios sobre la preparación de la muestra y el caudal óptimo se discuten

Citometría de masas: Protocolo para la afinación y servicio diario muestras de células en un citómetro de masas CyTOF

En los últimos años, el análisis rápido de células individuales se ha realizado habitualmente mediante citometría de flujo y anticuerpos marcados con fluorescencia. Sin embargo, el ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar el ajuste diario adecuado y el análisis de muestras en un instrumento CyTOF. Primero, se ensambla la máquina y se enciende. A continuación, se optimizan los parámetros del instrumento para el ajuste, a fin de obtener la señal máxima.Entonces, la máquina está lista para ejecutar las muestras. En el último paso, se limpia y apaga la máquina. En última instancia, se pueden obtener datos óptimos de las células según los requisitos de tiempo específicos.La demostración visual de esta técnica es fundamental. Los procedimientos diarios de configuración, calibración y limpieza son difíciles de aprender a partir del manual, ya que implican múltiples pasos de software simultáneos.Es necesario adquirir experiencia para desarrollar una sensación sobre los niveles de fondo adecuados y las intensidades de señal. Al menos 15 minutos antes de comenzar un experimento, abra el programa de software CyTOF y seleccione la configuración del instrumento. Luego, en la pestaña del bastidor, haga clic en el botón de encendido del calentador para permitir que la camisa de la cámara de pulverización alcance los 200 grados Celsius.Sustituya la jeringa en la bomba de jeringas por una jeringa nueva llena con agua milli cube. Luego, limpie el nebulizador realizando una retrofusión con Citron al 5 % dos veces a través de cada puerto. Para eliminar cualquier residuo de Citron, repita la retrofusión con agua Milli Q.A continuación, abra la válvula del tanque de gas argón, lo que hará que se encienda la luz de Argonne en la parte frontal de la máquina. Luego, conecte el nebulizador a la entrada del gas de compensación y conecte el nebulizador al tubo de introducción de líquido. Introduzca el extremo del nebulizador en la abertura blanca del manto calefactor en la pestaña del controlador RFG de la ventana de configuración del instrumento.Haga clic en iniciar plasma, luego haga clic en aceptar. Después de que haya finalizado el arranque, haga clic en aceptar nuevamente en la ventana emergente. Ahora encienda la bomba de jeringa.Al rellenar la jeringa, presione el botón de detención en lugar del botón de pausa para restablecer el contador de volumen. Antes de calibrar el citómetro de masas, asegúrese de que haya calentado durante 20 minutos. Una vez que la máquina se haya estabilizado, haga clic en el botón de configuración de adquisición para abrir la ventana de configuración de adquisición de datos. En la pestaña de analitos.Haga clic en la tabla periódica para abrir el panel de selección de isótopos. Luego seleccione los isótopos en la solución de ajuste de DVS Sciences que se enumeran en el manual y haga clic en guardar. A continuación, haga clic en el botón isótopos por lectura para abrir la ventana de masas por lectura.Seleccione el número de pulsos y reescala el eje y ingresando un nuevo número y luego presionando enter. Ahora llene una jeringa verde de un mililitro norm inject con la solución de ajuste. Gire el selector de puerto de muestra a cargar.Inyecte 450 microlitros de solución de calibración y luego gire el selector a la posición de inyección. Espere hasta que los isótopos de la solución de calibración comiencen a aparecer como trazas en esta pantalla. Las señales en el tiempo de vuelo, en la región de 9 400 a 9 800, se deben a isótopos de xenón en el gas argón.Ahora regrese a las masas por ventana de lectura y haga clic en el botón verde de reproducción. Cada línea de color representa isótopos seleccionados de la pestaña de analitos. Cuando los niveles de isótopos sean estables, ajuste la corriente seleccionando la corriente actual desde el menú desplegable en la pestaña de parámetros de la ventana de configuración de adquisición de datos.En la ventana de inicio, ingrese cero para finalizar, ingrese 10. Para el valor de paso, ingrese 0,5 y para el tiempo de estabilización, ingrese 200. Luego, haga clic en guardar.Luego, haga clic nuevamente en la ventana de masas por lectura y haga clic en reproducir. Después de anotar dónde alcanzan su máximo las señales de los isótopos, vaya a la pestaña de configuración del canal DAC en la ventana de configuración del instrumento. Desplácese hacia abajo hasta la corriente e ingrese el valor del pico del isótopo.Haga clic para establecer el valor de corriente actual y luego guarde. A continuación, cambie el menú desplegable para seleccionar el gas de relleno. Introduzca 0,55 en la ventana de inicio, 0,95 en la ventana final, 0,05 en la ventana de valor de paso y 200 en la ventana de tiempo de estabilización.Haga clic en guardar. Después de regresar a la ventana de masas por lectura y hacer clic en reproducir nuevamente, el eje x mostrará ahora el caudal del gas de arrastre. Tome nota de los valores en los que las señales de los isótopos alcanzan su pico y observe el aumento rápido de la señal GD 1 55 cerca del final.Luego regrese a la pestaña de configuración del canal DAC. Desplácese hacia abajo hasta el apartado de compensación de gas e ingrese el nuevo valor del pico del isótopo. Haga clic en establecer el valor de corriente actual.Luego, haga clic en guardar nuevamente para registrar la relación del isótopo deseado frente al óxido. Primero, realice una segunda inyección de 450 microlitros de solución de ajuste. A continuación, en la pestaña de parámetros, seleccione tiempo en el menú desplegable e ingrese cero en la ventana de inicio, 10 en la ventana de finalización, uno en la ventana de valor de paso y 200 en la ventana de estabilización.Después de hacer clic en reproducir en la ventana de masas por lectura, utilice el cursor para leer el valor más alto para TM 1 69 o TB 1 59, y también el valor GD 1 55. A continuación, inyecte tres mililitros de agua Milli Q a través del bucle de muestra, seguido de 500 microlitros de solución de lavado DVS. En la pestaña de calibración de masas, haga clic en ejecutar para monitorear el progreso del lavado de limpieza hasta que la intensidad de las bandas comience a disminuir.Luego, siga con tres mililitros de agua milicúbica y supervise hasta que las estelas disminuyan a niveles de fondo. Comience ingresando los isótopos de la muestra que se acaban de demostrar para los isótopos de la solución de calibración, y luego haga clic en guardar. A continuación, abra la ventana de adquisición y cambie la configuración de adquisición según sea necesario para el volumen de la muestra.Por ejemplo, una muestra de 450 microlitros llenará el bucle de muestra y tardará 600 segundos en ejecutarse para permitir retrasos en la adquisición de los datos celulares. Establezca el retraso de adquisición en al menos 30 segundos y el retraso de estabilidad del detector en al menos 20 segundos antes de iniciar. Lave las muestras celulares al menos dos veces con agua Milli-Q y luego resuspenda la muestra a un máximo de 10⁶ células por mililitro y filtre la solución celular resultante a través de un tamiz celular de 35 micrómetros.Para eliminar cualquier agregado. Ahora ingrese un nombre de archivo nuevo para la muestra actual. Tenga en cuenta que todos los archivos deben guardarse en la unidad E.Luego cambie la válvula del bucle de muestra a carga, inyecte la muestra, vuelva a cambiar la válvula del bucle de muestra a inyección y haga clic en ejecutar. En la ventana de adquisición. Las células se representarán en la ventana de instantánea como agrupaciones horizontales de marcas en cada canal isotópico vertical y exhibirán la mejor resolución alrededor de 300 a 500 células por segundo, como se muestra aquí.Cuando finalice la adquisición de datos de la muestra, aparecerá una ventana emergente. Haga clic en aceptar para confirmar la finalización del análisis de la muestra, y luego inyecte al menos 500 microlitros de agua MQ entre cada muestra para ayudar a minimizar cualquier arrastre de muestra y limpiar el equipo. Después de su uso, inyecte 450 microlitros de solución de lavado en el bucle de muestra. Supervise la liberación de metal libre y luego enjuague el bucle de muestra con tres mililitros de agua milli Q, monitoreando el lavado hasta alcanzar niveles de fondo de trazas.Luego, para apagar la máquina, seleccione la pestaña del controlador RFG en la ventana de configuración del instrumento y haga clic en detener el plasma. Cuando el procedimiento esté completo, haga clic en aceptar en la ventana emergente, que recomienda la eliminación del nebulizador bajo la pestaña del bastidor de tarjetas. Apague el calentador, cierre la válvula del suministro de argón y luego tire cuidadosamente hacia atrás del nebulizador para retirarlo de la cámara de pulverización.A continuación, desenrosque el tubo de introducción de la muestra y colóquelo aparte. Desenrosque la conexión de introducción del gas de arrastre hasta que se afloje ligeramente y luego retire el nebulizador. Finalmente, utilizando la misma jeringa y el mismo tubo que se mostraron anteriormente, limpie ambos orificios del nebulizador con Citron al 5 % y guarde el nebulizador cubierto con Citron al 5 % hasta su próximo uso.El lavado adecuado del citómetro de masas con agua UE y solución de lavado DVS reducirá los niveles de absorción de metales en los tubos y otras partes del equipo, lo que ayuda a disminuir cualquier fondo, como se observa en estas gráficas. La sintonización inadecuada, representada por la línea magenta, aumentó significativamente la formación de óxidos en m más 16 en comparación con la muestra sintonizada correctamente, mostrada por la línea azul oscuro. Esto tiene como efecto una ligera disminución de las señales deseadas en m y un aumento significativo de la interferencia de fondo no deseada en m más 16.El lavado adecuado y la dilución correcta de las muestras en agua Milli Q garantizarán un fondo mínimo y la mayor resolución de células, equilibrando al mismo tiempo la necesidad de rapidez. De forma similar a los datos de un experimento representativo mostrados aquí, en este experimento se analizaron en modo de adquisición celular microesferas de poliestireno que contenían lantano 139 ODIUM 140, terbio 159, DIUM 169 y lutecio 175 en abundancia natural. Los datos se analizaron utilizando FlowJo, y se excluyó mediante selección la basura procedente de microesferas rotas.Se determinó que la muestra correctamente ajustada estaba en una velocidad de flujo de 0,74 litros por minuto, representada con la línea azul oscuro. Se observaron intensidades de señal más altas a esta velocidad de flujo que a velocidades de flujo más bajas, y se observó que esta muestra correctamente ajustada tenía una señal más alta en las masas metálicas M y una señal menor en las masas de óxido m más 16 que las señales incorrectamente ajustadas. Aquí se muestra un acercamiento de la señal en la masa M LANTANIO 1 39 y TULIO 1 69.Tenga en cuenta que la velocidad de flujo del gas de compensación afecta más la intensidad de la señal del LANTANIO 1 39 que la intensidad de la señal del tulio 1 69. Estos gráficos muestran la señal en las masas óxido m + 16 de 1 55 y 180 5, correspondientes a los óxidos de LANTANIO 1 39 + OH 16 y tulio 1 69 + OH 16, respectivamente. Observe que la velocidad de flujo del gas de compensación aumenta mucho más la señal de la masa 1 55 que la señal de la masa 180 5, ya que el lantano 1 39 se oxida más fácilmente que el tulio 1 69.Las intensidades de señal de m y m más 16 en función del caudal de gas de compensación se muestran aquí. Los iconos rellenos representan la masa M, mientras que los iconos vacíos representan la masa M más 16. Los colores de las líneas corresponden a la masa M respectiva. Obsérvese que las intensidades de señal de LANTHANUM 1 39 y PRICEDIUM 1 41 se ven altamente afectadas por el caudal del gas de compensación, llegando incluso a un punto en el que hay más óxido de masa M más 16 presente que la masa M. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo encender correctamente el CyTOF, sintonizarlo adecuadamente, analizar sus muestras y, finalmente, limpiar y apagar correctamente el equipo al final de sus análisis diarios.

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Investigación

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Bioengineering

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