Citometría de masas: Protocolo para la afinación y servicio diario muestras de células en un citómetro de masas CyTOF

El objetivo de revisión de este procedimiento es demostrar el ajuste diario adecuado y el análisis de muestras en un instrumento CyTOF. Primero, se ensambla y se enciende la máquina. A continuación, se optimizan los ajustes del instrumento para afinar la señal máxima.

A continuación, la máquina está lista para procesar las muestras. En el paso final, la máquina se limpia y se apaga. En última instancia, se pueden adquirir datos de celda óptimos de acuerdo con requisitos de tiempo específicos.

La demostración visual de esta técnica es fundamental. Los procedimientos diarios de configuración, ajuste y limpieza son difíciles de aprender del manual. Ya que hay múltiples pasos simultáneos de software involucrados.

Es necesario adquirir experiencia para familiarizarse con los niveles de fondo y las intensidades de señal adecuados al menos 15 minutos antes de comenzar un experimento. Abra el programa de software CyTOF y seleccione la configuración del instrumento. Luego, en la pestaña de la jaula de tarjetas, haga clic en el botón de encendido del calentador para permitir que el manto de la cámara de pulverización alcance los 200 grados centígrados.

Reemplace la jeringa en la bomba de jeringa con una jeringa nueva llena de agua milicúbica. A continuación, limpie el nebulizador lavándolo a contracorriente con 5%Citron dos veces a través del puerto de alcance. Para eliminar cualquier resto de Cidra, repita el lavado a contracorriente con agua Milli Q.

A continuación, abra la válvula del tanque de gas argón, lo que hará que se encienda la luz de Argonne en la parte delantera de la máquina. A continuación, conecte el nebulizador a la entrada de gas de reposición y conecte el nebulizador al tubo de introducción de líquido. Inserte el extremo del nebulizador en la abertura blanca de la manta calefactora en la pestaña del controlador RFG de la ventana de configuración del instrumento.

Haga clic en iniciar plasma y, a continuación, haga clic en Aceptar. Una vez finalizado el inicio, vuelva a hacer clic en Aceptar en la ventana emergente. Ahora encienda la bomba de jeringa.

Al rellenar la jeringa, presione el botón de parada en lugar del botón de pausa para restablecer el contador de volumen Antes de calibrar el citómetro de masas, asegúrese de que se haya calentado durante 20 minutos. Una vez que la máquina se haya estabilizado, haga clic en el botón de configuración de adquisición para abrir la ventana de configuración de adquisición de datos. En la pestaña analitos.

Haga clic en la tabla periódica para abrir el panel de selección de isótopos. A continuación, seleccione los isótopos en la solución de ajuste de ciencias DVS enumerados en el manual y haga clic en guardar. A continuación, haga clic en el botón isótopos por lectura para abrir la ventana de masas por lectura.

Seleccione el conteo de pulsos y cambie la escala del eje y introduciendo un nuevo número y, a continuación, pulsando Intro. Ahora llene una jeringa verde de inyección estándar de un mililitro con solución de ajuste. Gire el selector de puertos de muestra para cargar.

Inyecte 450 microlitros de solución de afinación y luego gire el selector para inyectar. Espere hasta que los isótopos de la solución de ajuste comiencen a aparecer como rayas en esta pantalla. Las señales en el tiempo de vuelo, región 9, 400 a 9, 800 se deben a isótopos de xenón en el gas argón.

Ahora regrese a la ventana de masas por lectura y haga clic en el botón verde de reproducción. Cada línea de color representa los isótopos seleccionados de la pestaña de analitos. Cuando los niveles de isótopos estén estables, ajuste la corriente de selección actual en el menú desplegable en la pestaña de parámetros de la ventana de configuración de adquisición de datos.

En la ventana de inicio, escriba cero para finalizar, escriba 10. En Valor de paso, introduzca 0,5 y, en Tiempo de estabilización, escriba 200. A continuación, haga clic en Guardar.

A continuación, haga clic en la ventana de masas por lectura y haga clic en reproducir. Después de anotar dónde alcanzan su punto máximo las señales de los isótopos, vaya a la pestaña de configuración del canal DAC de la ventana de configuración del instrumento. Desplácese hacia abajo hasta actual e ingrese el valor máximo del isótopo.

Haga clic en establecer el valor actual real y, a continuación, en guardar. A continuación, cambie el menú desplegable para compensar gas. Introduzca 0,55 en la ventana de inicio, 0,95 en la ventana de finalización, 0,05 en la ventana de valores de paso y 200 en la ventana de tiempo de estabilización.

Haga clic en Guardar. Después de volver a la ventana de masas por lectura y hacer clic en reproducir nuevamente, el eje x ahora mostrará el caudal de gas de reposición. Tome nota de los valores en los que las señales de los isótopos alcanzan su punto máximo y observe el rápido aumento de la señal GD 1 55 cerca del final.

A continuación, regrese a la pestaña de configuración del canal DAC. Desplácese hacia abajo hasta maquillaje, gas e ingrese el nuevo valor máximo del isótopo. Haga clic en establecer el valor actual real.

A continuación, haga clic en guardar de nuevo para registrar la relación entre el isótopo deseado y el óxido. Primero, haga una segunda inyección de 450 microlitros de solución de afinación. A continuación, en la pestaña de parámetros, seleccione el tiempo en el menú desplegable e introduzca cero en la ventana de inicio, 10 en la ventana de finalización, uno en la ventana de valores de paso y 200 en la ventana de estabilización.

Después de hacer clic en reproducir en la ventana de masas por lectura, use el cursor para leer el valor más alto para TM 1 69 o TB 1 59, y también el valor GD 1 55. Ahora inyecte tres mililitros de agua Milli Q a través del circuito de muestra, seguidos de 500 microlitros de solución de lavado DVS. En la pestaña de calibración de masa, haga clic en ejecutar para monitorear el progreso del lavado de limpieza hasta que la intensidad de las rayas comience a disminuir.

Luego siga con tres mililitros de agua en cubos y controle hasta que las rayas bajen a niveles de fondo. Comience introduciendo los isótopos de muestra que se acaban de demostrar para los isótopos de la solución de ajuste y, a continuación, haga clic en guardar. A continuación, abra la ventana de adquisición y cambie la configuración de adquisición según sea necesario para el volumen de muestra.

Por ejemplo, una muestra de 450 microlitros llenará el bucle de muestra y tardará 600 segundos en ejecutarse para permitir retrasos en la adquisición de los datos de la celda. Establezca el retardo de adquisición en al menos 30 segundos y el retardo de estabilidad del detector en al menos 20 segundos antes de ejecutarse. Lave las muestras de células al menos dos veces con agua en milicubos y luego vuelva a suspender la muestra a un máximo de 10 a seis células por mililitro y filtre la solución celular resultante a través de un filtro de células de 35 micrómetros.

Para eliminar los agregados. Ahora introduzca un nuevo nombre de archivo para la muestra actual. Tenga en cuenta que todos los archivos deben guardarse en la unidad E.

A continuación, cambie la válvula de bucle de muestra a cargar, inyecte la muestra, vuelva a cambiar la válvula de bucle de muestra a inyectar y, a continuación, haga clic en ejecutar. En la ventana de adquisición. Las celdas se representarán en la ventana de instantáneas como colecciones horizontales de marcas en cada canal de isótopos verticales y exhibirán la mejor resolución, alrededor de 300 a 500 celdas por segundo, como se muestra aquí.

Una vez finalizada la adquisición de datos de la muestra, aparecerá una ventana emergente. Haga clic en Aceptar para confirmar la finalización de la ejecución de la muestra y, a continuación, inyecte al menos 500 microlitros de agua MQ entre cada muestra para ayudar a minimizar cualquier arrastre de muestras para limpiar la máquina Después de su uso, inyecte 450 microlitros de solución de lavado en el circuito de muestra. Controle la liberación de metal libre y luego enjuague el circuito de muestra con tres mililitros de agua mili Q, monitoreando el lavado hasta que se alcancen los niveles de rayas de fondo.

A continuación, para apagar la máquina, seleccione la pestaña del controlador RFG de la ventana de configuración del instrumento y haga clic en detener el plasma. Cuando se complete el procedimiento, haga clic en Aceptar en la ventana emergente, recomendando la extracción del nebulizador en la pestaña de la jaula de tarjetas. Apague el calentador, cierre la válvula del suministro de argón y luego tire con cuidado hacia atrás del nebulizador para sacarlo de la cámara de rociado.

A continuación, desenrosque el tubo de introducción de muestra y colóquelo a un lado. Desatornille la conexión de introducción de gas de reposición hasta que se afloje un poco y luego retire el nebulizador. Finalmente, usando la misma jeringa y tubo que se demostró anteriormente, limpie ambos puertos del nebulizador con 5% de Citron y guarde el nebulizador cubierto con 5% de Citron hasta el próximo uso.

El lavado adecuado del citómetro de masa con agua UE y solución de lavado DVS reducirá los niveles de absorción de metal en el tubo y en otras partes de la máquina, lo que ayudará a reducir cualquier fondo, como se ve en estos gráficos. La afinación incorrecta representada por la línea magenta aumentó significativamente la formación de óxido a m más 16 en comparación con la muestra correctamente afinada, como lo demuestra la línea azul oscuro. Esto tiene el efecto de disminuir ligeramente las señales deseadas a m y aumentar significativamente la interferencia de fondo no deseada a m más 16.

El lavado adecuado y la dilución adecuada de las muestras en agua Milli Q garantizarán un fondo mínimo y la mayor resolución de las células, al tiempo que equilibrarán la necesidad de velocidad. De manera similar a los datos de un experimento representativo que se muestra aquí en este experimento, las perlas de poliestireno que contenían abundancia natural: lantano 1 39, ODIUM 1 40, TERBIO 1 59, DIUM 1 69 y LUTECIO 1 75 en el modo de adquisición de células. Los datos se analizaron con FlowJo y se cerraron los residuos de las cuentas rotas.

Se determinó que la muestra correctamente ajustada tenía un caudal de 0,74 litros por minuto, representado con la línea azul oscuro. Se observaron intensidades de señal más altas a este caudal que a los caudales más bajos, y se observó que esta muestra correctamente ajustada tenía una señal más alta en las masas metálicas M y menos señal en las masas de óxido m más 16 que las señales mal ajustadas. Aquí se muestra un primer plano de la señal en M Mass LANTHANUM 1 39 y THULIUM 1 69.

Obsérvese que el caudal del gas de reposición afecta a la intensidad de la señal de LANTANO 1 39 más que a la intensidad de la señal de tulio 1 69. Estos gráficos muestran la señal a m más 16 masas de óxido 1 55 y 180 5 correspondientes a los óxidos de lantano 1 39 más oh 16 y tulio 1 69 más oh 16 respectivamente. Obsérvese que el caudal de gas de reposición aumenta la señal de masa 1 55 mucho más que la señal de masa 180 5, ya que el lantano 1 39 se oxida más fácilmente que el tulio 1 69.

Aquí se representan las intensidades de señal m y m más 16 en función del caudal de gas de reposición. Los iconos rellenos representan la masa M.Mientras que los iconos abiertos representan la masa M más 16, los colores de las líneas corresponden a la masa M respectiva.Tenga en cuenta que las intensidades de señal de LANTANO 1 39 y precio ODIUM 1 41 se ven muy afectadas por el caudal de gas de reposición. Incluso llegando a un punto en el que hay más masa m más 16 óxido que masa M. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo poner en marcha el CyTOF correctamente y ajustarlo, luego ejecutar sus muestras y, finalmente, limpiar y apagar adecuadamente la máquina al final de sus ejecuciones diarias.