Las investigaciones sobre alteraciones de la función del circuito del hipocampo después de una lesión cerebral traumática leve

El objetivo general del siguiente experimento consiste en analizar los cambios en la función de red de las áreas cerebrales afectadas por un modelo experimental de lesión cerebral traumática leve. Los experimentos comienzan administrando una lesión por percusión lateral con fluido a un ratón, lo cual imita tanto la patología como la sintomatología de la lesión cerebral traumática leve en humanos. Como segundo paso, se utiliza una conducta dependiente del hipocampo, la respuesta condicionada de miedo contextual, para evaluar el deterioro cognitivo inducido por la lesión cerebral. A continuación, se emplean grabaciones extracelulares e intracelulares junto con colorantes sensibles al voltaje para determinar los cambios específicos por región en el equilibrio sináptico entre la transmisión sináptica excitadora e inhibitoria. En la región de interés, el hipocampo, los resultados muestran cambios específicos por subregión en la eficacia sináptica neta en el hipocampo, basados en las diferencias entre los ratones control y los ratones con lesión cerebral a través de las tres técnicas de grabación descritas.

La principal ventaja de este enfoque es la capacidad de discernir los efectos tanto del estado patológico como de los posibles tratamientos terapéuticos en múltiples escalas fisiológicas, lo que permite obtener una imagen más coherente de los déficits de este circuito. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la lesión cerebral traumática, como qué neuronas son específicamente más susceptibles al daño y, por lo tanto, contribuyen más significativamente a la disfunción del hipocampo tras la lesión. Las implicaciones de nuestro enfoque se extienden hacia el tratamiento de la lesión cerebral traumática, ya que nos permite delinear primero los mecanismos subyacentes y luego desarrollar posibles terapias para restablecer una fisiología normal en las áreas dañadas por la lesión cerebral.

En este procedimiento, anestesie al ratón utilizando una mezcla de ketamina y xilacina administrada por vía intraperitoneal. A continuación, realice una craneotomía C sobre el área parietal derecha utilizando un fresa de tres milímetros de diámetro externo. Luego fije el conector de aguja tipo "lure lock" sobre la craneotomía C utilizando cianoacrilato y acrílico dental.

24 horas después, anestesiar al ratón mediante inhalación de isoflurano. Una vez que la respiración se normalice, pero antes de que el ratón haya recuperado la sensibilidad a la estimulación, aplicar un pulso de 20 milisegundos de solución salina al cráneo mediante el dispositivo de lesión por percusión líquida. Retirar inmediatamente el conector después de la lesión. Posteriormente, reanestesiar al ratón con isoflurano y suturar el cuero cabelludo.

Manipule el ratón durante dos días consecutivos antes del entrenamiento de la respuesta condicionada de miedo. El día del entrenamiento, coloque al ratón en la cámara de condicionamiento durante tres minutos antes de administrar una corriente eléctrica de 1,5 mA durante dos segundos. A continuación, deje al ratón en la cámara durante 30 segundos adicionales antes de retirarlo.

Después de un período de retraso de 24 horas, devuelva el ratón a la cámara de condicionamiento durante cinco minutos y luego evalúe la inmovilización a intervalos de cinco segundos siete días después de la lesión. Prepare un litro de líquido cefalorraquídeo artificial y 250 mililitros de solución de corte con sacarosa. Asegúrese de que todos los instrumentos y soluciones utilizados durante la preparación de cortes cerebrales estén helados con hielo.

Sedue el ratón utilizando isoflurano de forma rápida y suave. Extrae el cerebro del ratón y colócalo en sacarosa. A continuación, recorta el cerebro.

Coloque la superficie recién cortada del encéfalo sobre una gota de pegamento rápido en la plataforma del vibrátomo, frente a un bloque de agar. Corte secciones coronales de 350 micrones de grosor. Debería poder obtener cuatro o cinco secciones con el circuito hipocampal intacto.

A continuación, incubar las secciones durante al menos una hora a 37 grados Celsius. Ahora prepare algunos electrodos de vidrio bo silicatado de dos a cinco megaohmios. Utilizando el tirador vertical, transfiera una sección a la cámara, luego coloque un electrodo en el porta-electrodo para la grabación del potencial de campo extracelular.

Coloque el electrodo estimulante por encima del tracto axonal en el corte, como la vía perforante o los colaterales de Shafer. Luego, continúe bajando el electrodo de registro dentro del corte. A continuación, aplique un único pulso eléctrico para evocar el potencial postsináptico extracelular de campo.

Continúe con la estimulación variando la profundidad del electrodo de registro entre estímulos cuando se alcance la respuesta máxima. Esto indica que los electrodos se encuentran al mismo nivel. El análisis en el eje Z generalmente consiste en mediciones que comparan la amplitud del torrente de fibra tanto en ratones con lesión cerebral como en ratones operados simuladamente para evaluar la activación pre-sináptica, así como en la comparación de la pendiente del P-E-P-S-P para evaluar la activación post-sináptica; para el registro con parche en configuración de sello, transfiera nuevamente una sección al cámara y baje el electrodo de registro.

Acérquese a una célula con presión positiva en el electrodo para asegurar que el electrodo de registro no se obstruya mientras avanza a través del tejido. Cuando el electrodo toque suavemente la célula, aplique presión negativa con el fin de crear un sello gigaseal entre el electrodo y la membrana plasmática. A continuación, aplique ráfagas breves de presión negativa para romper la membrana plasmática y lograr la configuración de célula entera.

Elimine el transitorio de capacitancia utilizando el amplificador y compense la resistencia en serie para garantizar mediciones precisas. Luego, cuantifique y compare la velocidad y el tamaño de las corrientes sinápticas espontáneas en ratones con lesión cerebral y controles sometidos a cirugía simulada. En este paso, prepare el stock del colorante mezclando un miligramo de dye three onap DHQ en 50 microlitros de etanol.

Dispensar alícuotas de dos microlitros en tubos envueltos en papel de aluminio y almacenar a menos 20 grados Celsius. Preparar diariamente la solución de colorante de trabajo en una dilución de 1 a 200 en LCR A. A continuación, incubar una sección sobre papel filtro humedecido con LCR A y teñir con 90 microlitros de colorante durante 16 minutos.

A continuación, enjuáguelo y colóquelo en la cámara de grabación de interfaz. Coloque los electrodos estimulantes y de grabación como se describe en el registro de campo extracelular. Potencial de grabación.

Ajuste la intensidad de la estimulación luminosa hasta que la respuesta se centre en la mitad de la cámara. Normalmente, las imágenes de rango se adquieren a una velocidad de 500 a 1000 cuadros por segundo. Active el obturador para la estimulación luminosa 200 milisegundos antes de la estimulación eléctrica para permitir que el blanqueo fotónico inicial rápido se estabilice.

Pausar 10 segundos entre cada ensayo. Alternar los ensayos de adquisición entre estimulación eléctrica y sin estimulación eléctrica para permitir posteriormente la sustracción del fondo sin estimulación eléctrica. Luego, registrar la intensidad de luz en reposo antes de abrir el obturador.

Cada ensayo de VSD puede analizarse como una película de lecturas de fluorescencia. Es decir, cada ensayo es una matriz tridimensional de datos con valores en las dimensiones espaciales X e Y a lo largo del tiempo. Registre de 10 a 12 ensayos de VSD en cada condición de prueba y calcule el cambio de fluorescencia normalizado respecto al píxel intrapíxel previo a la iluminación según el manuscrito adjunto.

Esta figura muestra un ejemplo de una grabación F-E-P-S-P en el área CA1. La primera desviación descendente es el artefacto del estímulo seguido por la onda de fibra presináptica y luego por el F-E-P-S-P. A continuación se presentan las curvas entrada-salida que representan una disminución de la eficacia sináptica neta en CA1 tras una lesión por percusión líquida.

Y aquí se muestran las curvas entrada-salida que representan un aumento en la eficacia sináptica neta en el giro dentado tras la lesión por impacto de proyectil (FPI). Aquí se muestra un ejemplo de una corriente postsináptica excitatoria espontánea registrada en una célula paramedial del CA1. Aquí hay un ejemplo del tren de potenciales de acción proveniente de una célula paramedial del CA1 y de una interneurona del CA1 de disparo rápido.

Esta es una interneurona inhibidora del área CA1, rellena con amarillo de luciferina, sin espinas dendríticas, y aquí se muestra una neurona paramedial del área CA1, también rellena con amarillo de luciferina, que presenta espinas dendríticas. Estas imágenes muestran una sección coronal del hipocampo de ratón. Los píxeles de color amarillo a rojo representan la actividad excitatoria en el área CA1, 14 milisegundos después de la estimulación aferente de las colaterales de Shafer.

El rojo indica mayor despolarización, mientras que el amarillo indica una despolarización menor pero aún significativa. Los píxeles azules representan los sitios de actividad inhibitoria en el área CA1 a los 56 milisegundos posteriores a la misma estimulación colateral aferente de Schaffer, mientras que el azul más oscuro indica una mayor hiperpolarización. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo combinar múltiples técnicas de registro ex vivo para abordar una condición patológica clínicamente relevante que implique disfunción del circuito.