Alta eficiencia, específica del sitio La transfección de células adherentes con siRNA uso de arrays de microelectrodos (MEA)
13 de septiembre de 2012
El artículo detalla el protocolo específico de sitio de la transfección de revueltos secuencia de siRNA en un cultivo de células adherentes de mamíferos usando una matriz de microelectrodos (MEA).
El objetivo general del siguiente experimento consiste en lograr una transfección específica en un sitio determinado en células adherentes. Esto se consigue cultivando una monocapa de células sobre una matriz de microelectrodos. Como segundo paso, la aplicación de un impulso eléctrico a electrodos seleccionados provoca la electropermeabilización de las células diana adheridas encima de los electrodos.
Esto conduce a la formación de poros en la membrana celular que permiten la entrada de moléculas exógenas en la célula. Las células diana pueden luego analizarse para detectar el fenotipo resultante mediante un ensayo adecuado. La técnica de transfección a microescala que describimos aquí presenta varias ventajas clave frente a las técnicas convencionales de transfección, como la electrotransferencia masiva o la transfección química.
A, nos permite lograr un control espacial exquisito sobre el proceso de transfección y nos ayuda a transfectar células individuales o grupos de células con alta eficiencia, incluso en líneas celulares difíciles de transfectar. B, es un enfoque que se puede ampliar fácilmente y que nos permite realizar ensayos moleculares de alto rendimiento. Una de las ventajas clave del uso de un área de microelectrodo para la transfección sitio-específica es que permite la evaluación funcional simultánea de células diana, como la electrofisiología cuantitativa y los cambios morfológicos.
Para comenzar el procedimiento, esterilice el MEA en un autoclave, luego transfiera el MEA del autoclave a una cabina de flujo laminar y colóquelo en una placa de Petri estéril de poliestireno estándar antes de sembrar las células en el MEA. Esterilice la cabina de flujo laminar encendiendo la luz UV durante 20 minutos. Si el MEA es sensible a la luz UV, cubra la placa de Petri que contiene el MEA con papel de aluminio estéril mientras la cabina esté bajo iluminación UV. A continuación, trate la superficie del MEA con 10 microgramos por mililitro de fibronectina durante una a dos horas para las células helo.
Realice un lavado con agua desionizada y deje secar al aire el MEA en la cabina de flujo laminar. Después de eso, recolecte las células de una línea celular en crecimiento de células mamíferas adherentes utilizando tripsina ETTA y suspenda en una concentración de 100 a 200 células por microlitro en un mililitro de medio celular para siembra. A continuación, coloque una gota de 20 a 30 microlitros de medio con células sobre el MEA.
Asegúrese de que sea lo suficientemente grande como para cubrir todos los electrodos en la matriz de electrodos multicanal (MEA). Posteriormente, transfiera la placa de Petri con la MEA a una incubadora humectada a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. De dos a cuatro horas.
Después de sembrar las células, transfiera la placa de Petri con la MEA desde el incubador hasta la cabina de flujo laminar. A continuación, agregue suavemente de 400 a 500 microlitros de medio precalentado a 37 grados Celsius a la cavidad de la MEA; luego verifique bajo el microscopio para asegurarse de que las células aún estén adheridas y distribuidas uniformemente sobre la superficie de la MEA. Posteriormente, regrese la MEA al incubador. De ocho a doce horas después de sembrar las células, realice de uno a dos lavados con PBS para eliminar cualquier célula muerta.
En un experimento típico, las células generalmente están listas para la transfección entre 24 y 48 horas después del siembra. Para mantener la consistencia en las eficiencias de electrotransferencia, se recomienda esperar hasta que el cultivo esté cerca de la confluencia antes de la electrotransferencia. Con el fin de lograr una transfección de sarna altamente eficiente, es necesario determinar primero los parámetros óptimos de impulso de voltaje para electrotransferencia para una MEA determinada.
Aquí describimos una secuencia de pasos experimentales que incluye el uso de yoduro de propidio para determinar los parámetros óptimos de electrotransferencia antes de realizar la electrotransferencia. Prepare una solución de 300 a 500 microlitros de 30 microgramos por mililitro de PI en tampón de electrotransferencia frío con hielo, y 400 microlitros de una solución de calcio AM cuatro micromolar en PBS. Luego, transfiera la MEA del incubador a la cabina de flujo laminar.
Retire el medio celular de la MEA y realice un lavado con PBS. A continuación, agregue de 300 a 500 microlitros del tampón de electroforesis frío con pi. Luego, coloque un espaciador de un milímetro de altura en la MEA.
Bueno, es extremadamente importante asegurarse de que no toque las células en el centro de la MEA. Posteriormente, conecte la MEA con el interconector eléctrico y seleccione los electrodos deseados para la electropermeabilización. A continuación, aplique los pulsos eléctricos con la amplitud y duración deseadas a los electrodos seleccionados para la etapa de electropermeabilización.
Baje el cátodo de acero cubierto con papel de aluminio en el pocillo de la MEA hasta que haga contacto con el espaciador de un milímetro. Inmediatamente después, aplique pulsos eléctricos a los electrodos seleccionados. A continuación, repita el paso con un conjunto diferente de electrodos según el diseño experimental.
En nuestros experimentos con células helo, observamos que un solo pulso de voltaje con una amplitud de tres voltios a nueve voltios y una duración de un milisegundo a 10 milisegundos, con un electrodo del tamaño de 100 micrómetros, provocó una electropermeabilización exitosa con mínima muerte celular. Inmediatamente después de aplicar los pulsos de voltaje, transfiera la MEA al incubador durante cinco minutos.
Después de un período de incubación de cinco a 10 minutos, retire suavemente el espaciador de la MEA. Luego elimine el 75 % del tampón de electroforesis del pocillo de la MEA y reemplácelo por medio celular tibio. A continuación, transfiera la MEA de vuelta al incubador.
Después de un período de incubación de dos a cuatro horas, reemplace el medio celular en el pozo de la MEA con 300 a 500 microlitros de una solución de calcio AM de cuatro micromoles en PBS. Devuelva la MEA al incubador durante otros 30 minutos tras la incubación de las células con calcio AM. Reemplace el calcio AM en el pozo con PBS tras un paso de lavado, luego obtenga las imágenes fluorescentes de las células utilizando un microscopio óptico con filtros para pi.
La absorción de PI debido a la electropermeabilización provoca que las células fluoreszcan en rojo, y el calcio am provoca que las células que están vivas fluoreszcan en verde. La viabilidad celular para cada electrodo puede estimarse mediante esta ecuación, y la eficiencia de electropermeabilización para cada electrodo puede estimarse mediante esta ecuación. Una vez determinados los parámetros óptimos de electropermeabilización, pueden utilizarse para la administración específica en un sitio de una molécula a, y el procedimiento de electropermeabilización para moléculas de siRNA es el mismo que el procedimiento de electropermeabilización para pi.
Se muestra aquí la administración específica en el sitio de yoduro de propidio en células helo mediante un electrodo de 200 micrómetros. Se realizó el ensayo de viabilidad basado en calcio dos horas después de la electrotransferencia. Las células viables se indican mediante fluorescencia verde aquí, y la fluorescencia roja demuestra la absorción de PI por las células en el electrodo.
Aquí se muestra la imagen superpuesta. Estas células están electroporadas y vivas, mientras que estas células están muertas. Esta figura muestra la transfección de irna marcada con rumina en un electrodo de 200 micrómetros de diámetro, y esta figura muestra la transfección de células HeLa con irna marcada con Alexa 488 en un electrodo de 00 micrómetros de diámetro.
Las flechas blancas indican las células transfectadas con irna, mientras que las flechas negras indican las células muertas. La técnica que hemos demostrado aquí puede ampliarse a diferentes líneas celulares, incluidas las líneas celulares primarias de difícil transfección, y para transfectarlas con moléculas más grandes, como plásmidos y proteínas.
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Resumen
Este artículo presenta un protocolo para lograr una transfección específica en sitios determinados en células adherentes de mamíferos utilizando una matriz de microelectrodos (MEA). El método implica la electroforesis para facilitar la entrada de moléculas exógenas en células diana.
Componentes Principales del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Electrofisiología
Antecedentes
- La transfección específica de sitio es crucial para la entrega dirigida de genes.
- Las matrices de microelectrodos permiten un control preciso sobre la electroporación.
- Los métodos convencionales de transfección pueden carecer de especificidad.
- Esta técnica mejora la eficiencia de la introducción de siRNA en las células.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para la transfección específica de sitios.
- Mejorar la entrega de ARNip en células adherentes.
- Evaluar los cambios fenotípicos resultantes en las células diana.
Métodos Utilizados
- Cultivar una monocapa de células adherentes sobre una matriz de microelectrodos.
- Aplicar pulsos eléctricos a electrodos seleccionados para la electropermeabilización.
- Crear poros en la membrana celular para facilitar la entrada de moléculas.
- Analizar las células en busca de cambios fenotípicos mediante ensayos apropiados.
Resultados principales
- Transfección exitosa de células diana en sitios específicos.
- Mayor captación de siRNA en comparación con los métodos convencionales.
- Capacidad demostrada para analizar los fenotipos resultantes.
- Ventajas destacadas de las técnicas de transfección a microescala.
Conclusiones
- El método descrito ofrece un enfoque preciso para la entrega de genes.
- Proporciona ventajas significativas frente a las técnicas tradicionales de transfección.
- Esta técnica puede aplicarse a diversas áreas de investigación en biología celular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La transfección específica de sitio mediante matrices de microelectrodos aborda un cuello de botella crítico en la genómica funcional y la validación de objetivos al permitir un control espacial preciso sobre la entrega de siARN en poblaciones de células adherentes. Este enfoque aumenta la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al reducir los efectos fuera de diana y mejorar la reproducibilidad de los ensayos, apoyando directamente la eliminación de riesgos mecanicistas en las hipótesis terapéuticas. La compatibilidad del método con flujos de trabajo de alto rendimiento y líneas celulares diversas lo posiciona como una capacidad escalable para la identificación de compuestos líderes y la confirmación preclínica de dianas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la administración de siRNA restringida espacialmente, aclarando la función génica en contextos celulares específicos.
- Valor operativo: Reduce el ruido biológico al transfectar únicamente las células diana, mejorando la relación señal-ruido en ensayos fenotípicos de cribado.
- Valor predictivo: Facilita la reducción de riesgos del blanco al vincular el silenciamiento génico localizado con fenotipos celulares observables, fortaleciendo la inferencia causal en la validación de vías.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera datos cuantitativos de eficiencia de transfección específicos por electrodo, lo que permite comparaciones estandarizadas entre condiciones experimentales.
- Valor operativo: Facilita experimentos multiplexados en un solo cultivo, reduciendo la variabilidad entre pocillos y aumentando el rendimiento en cribados con bibliotecas de ARNip.
- Preparación del ensayo: Produce lecturas binarias de vida/muerte mediante yoduro de propidio y calcio AM, lo que permite puntuaciones automatizadas basadas en imágenes para evaluar viabilidad y eficiencia de transfección.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Permite la evaluación funcional de células transfectadas mediante electrofisiología o morfología integradas, vinculando la intervención molecular con el resultado fenotípico.
- Modelado Preclínico: Facilita sistemas relevantes para enfermedades al permitir la entrega específica de siRNA en células adherentes primarias o de difícil transfección, mejorando la fidelidad del modelo.
- Avance Ajustado al Riesgo: Proporciona métricas reproducibles de transfección que orientan las decisiones de avance o interrupción en cascadas de validación de dianas.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se encaja dentro del continuo de descubrimiento, desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la identificación de compuestos activos, donde se requiere una perturbación molecular precisa para reducir los riesgos de los mecanismos biológicos antes del cribado de compuestos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la validación de dianas basada en hipótesis mediante la entrega controlada de siRNA para investigar la función génica en modelos celulares adherentes.
- Selección: Realiza transfecciones listas para ensayos y reproducibles con eficiencia cuantificable, lo que permite cribados fiables de compuestos o perturbaciones genéticas.
- Análisis: Genera métricas específicas por electrodo sobre transfección y viabilidad celular, facilitando la comparación basada en datos de la eficacia del siRNA entre distintas condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta la perturbación molecular con lecturas funcionales (por ejemplo, electrofisiología), apoyando la anclaje fenotípico en modelos preclínicos.
- Reutilización Empresarial: Representa una plataforma estandarizada y reutilizable para la entrega específica de ácidos nucleicos en múltiples proyectos y líneas celulares.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en la validación del blanco mediante la entrega espacialmente controlada de siRNA con alta eficiencia y mínimos efectos fuera del blanco.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y escalabilidad mediante parámetros estandarizados de electrotransferencia y multiplexado con múltiples electrodos.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al reducir experimentos fallidos debido a una mala transfección o variabilidad biológica.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización de blancos ajustada al riesgo basada en respuestas fenotípicas reproducibles a la inhibición génica específica de sitio.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo celular, principios de electrotransferencia y ensayos de viabilidad basados en fluorescencia.
- Depende del acceso a matrices de microelectrodos, generadores de impulsos y microscopía de fluorescencia con conjuntos de filtros adecuados.
- Necesita la estandarización de la selección de electrodos, los parámetros del impulso y las condiciones del tampón entre diferentes usuarios y experimentos.
- Implica consideraciones de adaptación para las propiedades de adhesión de diferentes líneas celulares y las condiciones óptimas de recubrimiento con fibronectina.
- Está limitado por la necesidad de optimización empírica del voltaje y la duración del impulso para cada MEA y tipo celular, con el fin de equilibrar la eficiencia de transfección y la viabilidad.
