Dos registros electrofisiológicos de sinápticamente respuestas evocadas neuronal y astroglial en agudas rodajas de hipocampo

Clásicamente, la comunicación entre los elementos pre y postsinápticos implica un potencial de acción que llega a la terminal presináptica, que desencadena al aumentar el calcio, la liberación de glutamato activando los receptores postsinápticos. Sin embargo, la observación de que los astrocitos entran en contacto íntimo, sinopsis y expresan receptores de neurotransmisores ha cambiado su visión hacia el concepto de la sinaps tripartita. Por lo tanto, la transmisión glutamatérgica en curso también activará el astrocito y desencadenará un aumento de calcio intracelular.

La liberación de transmisores glio, que luego pueden conectarse a receptores extrasinápticos o sinápticos, modula las actividades pre y postsinápticas. Además, los astrocitos expresaron el principal sistema de captación de glutamato liberado sinápticamente. Además, eliminan el potasio, que se libera durante la acción, la posible activación y la posterior activación postsináptica desde el extremo presináptico y postsináptico a través de sus canales de potasio.

Luego, este potasio se transporta intracelularmente a sitios de niveles de potasio extracelular más bajos, donde se libera o se difunde a través de uniones gap a los astrocitos adyacentes. Por lo tanto, al controlar la concentración ex extracelular de sustancias neuroactivas, así como al liberar transmisores claros, los astrocitos desempeñan un papel importante en la definición de las fuerzas de la actividad sináptica. Mi laboratorio investiga el papel de las interacciones neurogliales en la fisiopatología cerebral.

Por lo tanto, hemos utilizado y perfeccionado ampliamente esta técnica para desentrañar la pared de los astrocitos en la transmisión sináptica momento a momento. De hecho, esta técnica es poderosa, ya que permite monitorear en línea y simultáneamente las respuestas electrofisiológicas dinámicas de las neuronas. Y como en la clínica Osteocytes Evap de hoy, Ash y Jeremy Siebel miembros del laboratorio os enseñarán cómo realizar esta técnica y os explicaremos cómo nos ayuda, el cing, a un diálogo íntimo entre neuronas y astrocitos.

He investigado el impacto de las redes de astroglide en las neuronas, la transmisión sináptica y la plasticidad mediante la realización de registros duales de la actividad neuronal y la ocurrencia del transporte de potasio y exceso de glucosa, y descubrí que las redes asline facilitan la eliminación extracelular de potasio y glutamato durante la actividad neuronal. He investigado la naturaleza, las propiedades y la plasticidad de la presencia de astroglía en relación con la neurofisiología. Durante el registro de la actividad de la astroglía y los evocadores neuronales, me permiten identificar la respuesta de los astrocitos a la activación neuronal, principalmente por las corrientes de potasio.

Esta corriente tiene su propia plasticidad electrofisiológica, que no regula la aceptabilidad y plasticidad neuronal. Es decir, la cuenta atrás de los astrocitos, la muy emocionada. Neuros. Presentaremos aquí un método importante para investigar simultáneamente la actividad urinaria y de la astroglía en cortes agudos del hipocampo mediante la realización de registros duales de las corrientes de membrana astrocítica y los potenciales de alimentación urinaria evocados por la estimulación de las fibras presinápticas.

Además, realizaremos grabaciones emparejadas de neuronas individuales y astrocitos adyacentes para investigar las respuestas de ASTO gly durante la actividad neuronal. Hemos elegido el hipocampo porque esta región exhibe una fuerte compartimentación anatómica y funcional y está bien caracterizada en términos de circuitos neurológicos, así como de actividad sináptica y plasticidad. Comience los experimentos preparando rodajas de cerebro de hipocampo para este primer hielo llamado oxigenado.

Líquido cefalorraquídeo artificial, anestesia profundamente a sus ratones y corte rápidamente la cabeza y transfiérala a un líquido cefalorraquídeo. Abre el cráneo con tres cortes, ahora separados por dos hemisferios. Finalmente, transfiéralos a un líquido cefalorraquídeo A oxigenado.

Déjalo trenzar por igual durante unos cinco minutos. Ahora comience con Un hemisferio. La disección del hipocampo comienza con la extirpación del mesencéfalo.

La disección detallada del hipocampo se ilustra ahora en esta figura. Primero, coloque el hemisferio separado en su sitio cortical para acceder al mesencéfalo. Con la ayuda de dos cucharas, retira el mesencéfalo.

Ahora el hipocampo será visible como lo indican las líneas discontinuas. Disecciona el hipocampo con una cuchara a partir de la fia, que es visible como una estructura ancha. Inserta una cuchara por debajo del hipocampo y con la ayuda de una segunda cuchara, corta la corteza adyacente al hipocampo.

Transfiera el hipocampo a una pequeña placa de cultivo con LCR A oxigenado y proceda con el segundo hemisferio Coloque ambos hipopótamos en un pequeño bloque AGA con el lado alveo hacia arriba. Ahora succiona DS A CSF. Pega el hipopótamo en el dispositivo de la cámara de corte.

Transfiera el hipocampo a la cámara de corte y corte rodajas de 300 o 400 micrómetros. Recoja las rodajas en una cámara de almacenamiento oxigenada y déjelas reposar al menos una hora pregrabando a temperatura ambiente para realizar registros al por mayor de astrocitos individuales. Transfiera su corte de hipocampo en un cubreobjetos recubierto de polilisina.

Seque el exceso de líquido cefalorraquídeo A para permitir la fijación de la rebanada del hipocampo al cubreobjetos recubierto de polietileno y luego vuelva a agregar el líquido cefalorraquídeo A encima de la rebanada. Transfiera el corte a su cámara de registro, que se perfunde constantemente con líquido cefalorraquídeo A oxigenado a una velocidad de perfusión de uno a dos mililitros por minuto. Para identificar astrocitos, los ratones que expresan EGFP bajo el promotor específico de GFAP de la astroglía se pueden utilizar para el registro de pinzas de parche.

Llene una tubería de vidrio con una resistencia de cuatro a seis mega ohmios con solución intracelular fría filtrada mediante el uso de una solución intracelular que contenga rodda dron, puede visualizar en rojo el astrocito parcheado en verde. Se ve a los astrocitos vecinos expresando EGFP. Bajo el promotor GFAP, los astrocitos se pueden identificar por su pequeño tamaño de soma de alrededor de 10 micrómetros y su ramificación del proceso principal, que generalmente incluye de tres a cuatro ramas.

Una jeringa conectada a través de un tubo a la pipeta permite la aplicación de presión positiva mientras desciende al tejido en la ventana de comando, desencadena un pulso de prueba de 10 milivoltios y reactiva la corriente de retención. A continuación, mueva la pipeta con la ayuda del micromanipulador en el tejido para acercarse a la célula. Cuando llegamos a la superficie de la célula, nos vamos alejando hasta que vemos un hoyuelo visible como una ligera desviación que indica que deformamos un poco la superficie de la célula.

Debido a la aplicación de presión positiva, la membrana de la célula astrocítica ahora se sellará herméticamente en la abertura de la punta del tubo de vidrio, lo que se puede observar por una resistencia creciente cuando se alcanza un sello giga. Realice la compensación de capacitancia en la configuración mayorista mediante la aplicación suave de presión negativa mientras observa las partes de prueba en la ventana de comandos. La ruptura en la célula será visible por la corriente que fluye a través de la membrana.

La aplicación de una serie de pasos de voltaje hiperpolarizante y despolarizante permite la caracterización de las propiedades de la membrana celular: los astrocitos normalmente exhiben solo respuestas de corriente pasiva. La inyección de corriente en el modo de pinza amperimétrica no da como resultado un potencial de acción. Disparando una confirmación adicional de que, de hecho, ha parcheado una adición de astrocito de un trazador como azufre o domina B a su parche, la pipeta permite la visualización del astrocito parcheado.

Además, la difusión pasiva del trazador durante 20 minutos en el modo de pinza de corriente permite visualizar los astrocitos vecinos conectados por la unión de brecha para realizar registros duales de la transmisión excitatoria neuronal y, posteriormente, las corrientes astrocíticas provocadas. Primero bloqueamos la transmisión inhibitoria con precor toína para prevenir la hiperexcitabilidad, que ocurre en ausencia de transmisión GABAérgica. Cortamos las uniones mediadas por las colaterales del shaer entre el CS tres y el C uno con un pequeño cuchillo de iris.

A continuación, colocamos un electrodo de estimulación de campo LCR A, un electrodo de registro de campo y el electrodo de pinza de parche astrocítico. En el corte del hipocampo, elegimos un astrocito y colocamos el electrodo de campo a 5.200 micrómetros de distancia de él para asegurarnos de que, efectivamente, el astrocito integre la actividad registrada con la estimulación del electrodo de campo de los colaterales de Shafer evocará un potencial de campo excitatorio. Este potencial de campo consiste en la pared de la fibra que refleja el número de axones estimulados y la posterior despolarización postsináptica para realizar registros duales de los potenciales de alimentación neuronal y las respuestas de corriente de la célula entera de la astroglía.

Primero, coloque su electrodo de registro de campo a unos 50 micrómetros de distancia del astrocito elegido. A continuación, mueva su electrodo de parche al soma astrocítico y a la pinza del parche, la célula elegida verificada por sus propiedades de membrana pasiva de que es realmente un astrocito. Ahora, al estimular Shaer Cs, podemos registrar simultáneamente la actividad neuronal y una corriente astrocítica posterior, que consiste en una respuesta duradera de hasta 50 p. oum debido a su conectividad de red y al hecho de que un astrocito está en contacto con sinapsis de hasta 100 neuronas.

Estas células integran la actividad de un gran número de sinapsis activadas simultáneamente para realizar registros duales de células completas de neuronas individuales y astrocitos adyacentes que descienden con dos electrodos de parche en el área del estrato del corte del hipocampo. Identifique en la región C una neurona de interés, y a la misma profundidad a unos 20 a 60 micrómetros de distancia y astrocitos, luego coloque ambas pipetas a unos 10 micrómetros por encima de cada célula mientras se aplica presión positiva. La pipeta de registro astrocítico debe colocarse lo más cerca posible del astrocito objetivo para evitar más movimientos mecánicos.

Primero, lograr el sello gga en la neurona. Ahora proceda con el parche del astrocito, que generalmente se sella más lentamente que las neuronas. Para resumir los pasos importantes para realizar grabaciones duales al por mayor, baje primero los dos tubos de grabación en el corte.

Acérquese al soma del astrocito, luego realice el sello gga en la neurona y finalice realizando el sello gga en las neuronas del astrocito generalmente tienen una resistencia de membrana mucho mayor que los astrocitos, que es para neuronas piramidales alrededor de 200 a 500 mega que tienen ambas células. Ahora, en modo de pinza de voltaje T e hiperpolarizante, la membrana activa las corrientes transitorias de sodio en la neurona y las respuestas pasivas de potasio en el astrocito. Aquí mostramos que la inducción de potenciales de campo postsináptico excitatorios rápidos mediante la estimulación de colaterales shaa evoca una respuesta de corriente posterior y duradera.

En los astrocitos adyacentes, la inhibición de los receptores ionotrópicos de glutamato con ácido remic revela que la mayor parte de la corriente astológica se debe a la activación postsináptica excitatoria. El resto de la respuesta B AIC consiste en la rápida ocurrencia transitoria de transporte de glutamato sensible a TBOA y la pequeña corriente de larga duración, muy probablemente debido a la liberación presináptica de potasio durante la acción. El disparo potencial de la corriente ascítica monitorea de manera muy confiable la actividad postsináptica, ya que tanto aumentó linealmente mientras aumentaba la actividad presináptica.

Además, las corrientes astrocíticas exhiben respuestas neuronales similares, facilitación de pulso emparejado. La estimulación única moderada de los colaterales del shaer induce una corriente de asto gly sináptica relativamente grande en comparación con la pequeña despolarización de evocación registrada en la misma celda en el modo de pinza de corriente. Esto se debe a la baja resistencia de la membrana de los astrocitos.

El registro de la dinámica del potencial de membrana TTO gly evocado sinápticamente es una medida directa de los niveles locales de potasio extracelular mediante la realización de registros emparejados de una neurona y un astrocito adyacente, no observamos ninguna respuesta de corriente astrocítica mientras la neurona disparaba potenciales de acción que indican que no estaban acoplados eléctricamente, el potencial postsináptico excitatorio evocado en la región CS tres también provoca respuestas de corriente astrocítica. Además, en primer lugar, su estimulación potenció fuertemente la respuesta neuronal en la región CS tres. Solo aumentó moderadamente la corriente astrocítica.

Después de ver este video, deberíamos tener una mejor comprensión de cómo configurar y realizar con éxito registros electrofisiológicos duales de neuronas y citos. Con esta técnica, puede estudiar la señalización dinámica en línea entre neuronas y astrocitos para su respuesta electrofisiológica de interés. En particular, puede investigar si las nuevas interacciones de GL que involucran funciones y modulaciones de canales de hierro contribuyen a definir situaciones fisiológicas o patológicas.

Gracias por mirar y buena suerte con tu experimento.