Dos registros electrofisiológicos de sinápticamente respuestas evocadas neuronal y astroglial en agudas rodajas de hipocampo

Clásicamente, la comunicación entre los elementos pre y postsinápticos implica un potencial de acción que llega al terminal presináptico, lo que desencadena, mediante el aumento de calcio, la liberación de glutamato que activa los receptores postsinápticos. Sin embargo, la observación de que los astrocitos contactan íntimamente con las sinapsis y expresan receptores de neurotransmisores ha cambiado esta visión hacia el concepto de la sinapsis tripartita. Por lo tanto, la transmisión glutamatérgica continua también activará al astrocito y desencadenará un aumento del calcio intracelular.

La liberación de gliotransmisores, que luego pueden unirse a receptores extrasinápticos o sinápticos, modula las actividades pre y postsinápticas. Además, los astrocitos expresan el sistema principal de captación del glutamato liberado sinápticamente. Asimismo, eliminan el potasio, que se libera durante la generación del potencial de acción y la subsiguiente activación postsináptica, desde los terminales pre y postsinápticos a través de sus canales de potasio.

Este potasio es luego transportado intracelularmente hacia sitios con niveles más bajos de potasio extracelular, donde se libera o difunde a través de uniones comunicantes hacia astrocitos adyacentes. De este modo, al controlar la concentración extracelular de sustancias neuroactivas y al liberar neurotransmisores, los astrocitos desempeñan funciones importantes en la definición de la intensidad de la actividad sináptica. Mi laboratorio investiga el papel de las interacciones neurogliales en la fisiopatología cerebral.

Por lo tanto, hemos utilizado ampliamente y perfeccionado esta técnica para desentrañar la barrera de los astrocitos en la transmisión sináptica momento a momento. De hecho, esta técnica es poderosa porque permite monitorear en línea y simultáneamente las respuestas electrofisiológicas dinámicas de las neuronas. Y como parte de Osteocytes Evap Clinic hoy, Ash y Jeremy Siebel, miembros del laboratorio, les demostrarán cómo realizar esta técnica y les explicarán cómo nos ayuda a nosotros, mediante un diálogo íntimo entre neuronas y astrocitos.

He investigado el impacto de las redes de astroglias en las neuronas, la transmisión sináptica y la plasticidad mediante grabaciones duales de la actividad neuronal y la ocurrencia del transporte de potasio y glutamato en astroglias, y descubrí que la redificación astrocitaria facilita la eliminación extracelular de potasio y glutamato durante la actividad neural. He investigado las propiedades y la plasticidad de la actividad astrocitaria en relación con la neurofisiología. Durante la grabación de la actividad evocada de astrocitos y neuronas, pude identificar que la respuesta de los astrocitos a la activación neuronal se produce principalmente mediante corrientes de potasio.

Esta corriente posee su propia plasticidad electrofisiológica, la cual no regula la aceptabilidad neuronal ni la plasticidad. En otras palabras, la cuenta regresiva de los astrocitos, el elemento más excitado. Neuros. Presentaremos aquí un método importante para investigar simultáneamente la actividad urinaria y la actividad astrocitaria en cortes hipocampales agudos mediante grabaciones duales de las corrientes de membrana astrocitarias y los potenciales de respuesta urinarios evocados por la estimulación de las fibras presinápticas.

Además, realizaremos grabaciones simultáneas de neuronas individuales y astrocitos adyacentes para investigar las respuestas glicinérgicas de los ASTO durante la actividad neuronal. Hemos elegido el hipocampo porque esta región presenta una marcada compartimentalización anatómica y funcional y está bien caracterizada en cuanto a circuitos neuronales, así como a actividad y plasticidad sináptica. Inicie los experimentos preparando cortes cerebrales del hipocampo; para ello, primero prepare hielo llamado oxigenado.

Fluido cefalorraquídeo artificial, anestesie profundamente a sus ratones y corte rápidamente la cabeza, luego transfiérala al LCR A. Abra el cráneo con tres cortes, separando ahora los dos hemisferios. Finalmente, transfiéralos al LCR A oxigenado.

Déjelo entrelazar por igual durante aproximadamente cinco minutos. Ahora comience con un hemisferio. La disección del hipocampo comienza eliminando el mesencéfalo.

La disección detallada del hipocampo se ilustra ahora en esta figura. Primero, coloque el hemisferio separado sobre su sitio cortical para acceder al mesencéfalo. Con la ayuda de dos cucharillas, retire el mesencéfalo.

Ahora el hipocampo será visible según indican las líneas discontinuas. Diseque el hipocampo con una cucharilla comenzando por el fiol, que es visible como una estructura ancha. Introduzca una cucharilla debajo del hipocampo y, con ayuda de una segunda cucharilla, corte la corteza adyacente al hipocampo.

Transfiera el hipocampo a una pequeña placa de cultivo con A CSF oxigenado y continúe con el segundo hemisferio. Coloque ambos hipocampos sobre un pequeño bloque de AGA con el lado alveolar hacia arriba. Ahora aspire el A CSF. Pegue el hipocampo al dispositivo de la cámara de corte.

Transfiera el hipocampo al cámara de corte y corte secciones de 300 o 400 micrómetros. Recoja las secciones en una cámara de almacenamiento oxigenada y déjelas reposar al menos una hora antes de la grabación a temperatura ambiente para realizar grabaciones masivas de astrocitos individuales. Transfiera su sección de hipocampo a un cubreobjetos recubierto con polilisina.

Seque el exceso de LCR A para permitir la fijación del trozo de hipocampo al cubreobjetos recubierto con poli y luego vuelva a añadir LCR A encima del trozo. Transfiera el trozo a su cámara de registro, que se perfunde constantemente con LCR A oxigenado a una velocidad de perfusión de uno a dos mililitros por minuto. Para identificar los astrocitos, se pueden utilizar ratones que expresan EGFP bajo el promotor específico de astrogliocitos GFAP para registros de parche en configuración de bloqueo.

Llene una pipeta de vidrio con una resistencia de cuatro a seis megaohmios con solución intracelular fría filtrada utilizando una solución intracelular que contiene rodamina; puede visualizar en rojo el astrocito parcheado en verde. Observará los astrocitos vecinos que expresan EGFP. Bajo el promotor GFAP, los astrocitos pueden identificarse por su pequeño tamaño del soma de aproximadamente 10 micrómetros y por la ramificación de sus procesos principales, que incluyen generalmente de tres a cuatro ramas.

Una jeringa conectada mediante un tubo al pipeta permite la aplicación de presión positiva mientras se desciende en el tejido en la ventana de comandos, activa un pulso de prueba de 10 milivoltios y restablece la corriente de sostenimiento. Luego, mueva el pipeta con la ayuda del micromanipulador hacia el interior del tejido para acercarse a la célula. Cuando alcancemos la superficie celular, avanzamos más hasta observar un hundimiento visible como una desviación de la luz, lo que indica que estamos deformando ligeramente la superficie celular.

Debido a la aplicación de presión positiva, la membrana celular de los astrocitos se sellará firmemente sobre la abertura de la punta de vidrio de la pipeta, lo cual puede observarse por un aumento en la resistencia cuando se alcanza un sello en gigaohmios. Realice la compensación de capacitancia e ingrese a la configuración de ruptura mediante la aplicación suave de presión negativa mientras observa las partes de prueba en la ventana de comandos. La entrada en la célula será visible por el flujo de corriente a través de la membrana.

La aplicación de una serie de pasos de voltaje hiperpolarizantes y despolarizantes permite la caracterización de las propiedades de la membrana celular que normalmente exhiben los astrocitos. Estos últimos presentan únicamente respuestas de corriente pasiva. La inyección de corriente en modo de bloqueo de corriente no genera potenciales de acción, lo que constituye una confirmación adicional de que efectivamente se ha realizado un parche sobre un astrocito. La adición de un trazador, como azufre o dextrano B, a su pipeta de parche permite la visualización del astrocito parcheado.

Además, la difusión pasiva del trazador durante 20 minutos en el modo de fijación de corriente permite visualizar los astrocitos vecinos conectados por uniones en hendidura para realizar grabaciones duales de la transmisión excitatoria neuronal y las corrientes astrocíticas posteriormente provocadas. Primero bloqueamos la transmisión inhibitoria con precor toin para prevenir la hiperexcitabilidad, que ocurre en ausencia de la transmisión GABAérgica. Cortamos las conexiones mediadas por colaterales divergentes entre CS tres y C uno con un pequeño bisturí de iris.

Luego posicionamos un electrodo de estimulación del campo CSF, un electrodo de registro de campo y el electrodo de parche para astrocitos. En el corte de hipocampo, seleccionamos un astrocito y colocamos el electrodo de campo a 5, 200 micrómetros de distancia para asegurarnos de que, efectivamente, el astrocito integre la actividad registrada; la estimulación de los colaterales de Schaffer con el electrodo de campo evocará un potencial de campo excitatorio. Este potencial de campo consiste en la onda de fibra, que refleja el número de axones estimulados, y la subsiguiente despolarización postsináptica, con el fin de realizar grabaciones simultáneas de potenciales neuronales de entrada y respuestas de corriente en toda la célula de la astroglía.

Primero, coloque su electrodo de registro de campo aproximadamente a 50 micrómetros de distancia del astrocito elegido. Luego, mueva su electrodo de parche hacia el soma astrocitario y realice un parche de fijación de voltaje, verificando la célula seleccionada mediante sus propiedades pasivas de membrana que confirman que efectivamente se trata de un astrocito. Ahora, al estimular Shaer Cs, podemos registrar simultáneamente la actividad neuronal y una corriente astrocitaria subsiguiente, que consiste en una respuesta de larga duración de hasta 50 picóamperios debido a la conectividad de su red y al hecho de que un solo astrocito contacta sinapsis de hasta 100 neuronas.

Estas células integran la actividad de un gran número de sinapsis activadas simultáneamente para realizar grabaciones duales de célula completa de neuronas individuales y astrocitos adyacentes que descienden con dos electrodos de parche hasta la capa del área del corte de hipocampo. Identifique en la región C una neurona de interés y, a la misma profundidad, a unos 20-60 micrómetros de distancia, un astrocito; luego coloque ambas pipetas aproximadamente a 10 micrómetros por encima de cada célula mientras aplica presión positiva. La pipeta de grabación astrocitaria debe colocarse lo más cerca posible del astrocito objetivo para evitar movimientos mecánicos adicionales.

Primero, logre el sello gga en la neurona. Ahora continúe con el parche del astrocito, que generalmente sella más lento que las neuronas. Para resumir los pasos importantes para realizar grabaciones duales en bloque, primero baje los dos tubos de grabación hacia el corte.

Acerque el soma del astrocito, luego realice el sello gga en la neurona y finalice realizando el sello gga en el astrocito. Las neuronas suelen tener una resistencia de membrana mucho más alta que los astrocitos, que en el caso de las neuronas piramidales es de alrededor de 200 a 500 megaohmios. Teniendo ambas células ahora en modo de fijación de voltaje T e hiperpolarizando la membrana, se activan corrientes transitorias de sodio en la neurona y respuestas pasivas de potasio en el astrocito. Aquí mostramos que la inducción de potenciales postsinápticos excitatorios rápidos mediante la estimulación de colaterales shaa evoca una respuesta de corriente subsiguiente de larga duración.

La inhibición adyacente de los receptores ionotrópicos de glutamato en astrocitos con ácido remico revela que la mayor parte de la corriente astrocítica de glicina se debe a la activación postsináptica excitatoria. La respuesta restante de B AIC consiste en la ocurrencia rápida y transitoria del transporte de glutamato sensible a TBOA y una pequeña corriente de larga duración, probablemente debida a la liberación presináptica de potasio durante el potencial de acción. La corriente ascítica monitorea de manera muy confiable la actividad postsináptica, ya que ambas aumentan linealmente al incrementar la actividad presináptica.

Además, las corrientes astrocíticas muestran, al igual que las respuestas neuronales, facilitación por pulso emparejado. Una estimulación moderada única de las colaterales compartidas induce una corriente astroglicítica evocada sinápticamente relativamente grande en comparación con la pequeña despolarización evocada registrada en la misma célula en modo de fijación de corriente. Esto se debe a la baja resistencia de la membrana de los astrocitos.

La grabación de la dinámica del potencial de membrana evocada sinápticamente en la glía TTO es una medida directa de los niveles locales de potasio extracelular. Al realizar grabaciones pareadas de una neurona y un astrocito adyacente, no observamos respuesta de corriente en el astrocito mientras la neurona generaba potenciales de acción, lo que indica que no estaban acopladas eléctricamente. Los potenciales postsinápticos excitatorios evocados en la región CS tres también provocan respuestas de corriente en los astrocitos. Además, una estimulación fuerte potenció marcadamente la respuesta neuronal en la región CS tres, mientras que solo aumentó moderadamente la corriente astrocitaria.

Después de ver este video, deberíamos tener una mejor comprensión de cómo configurar y realizar grabaciones electrofisiológicas duales exitosas de neuronas y citoes. Mediante esta técnica, puedes estudiar en línea la señalización dinámica entre neuronas y astrocitos para tu respuesta electrofisiológica de interés. En particular, puedes investigar si nuevas interacciones GL que implican funciones y modulaciones de canales de hierro contribuyen a definir situaciones fisiológicas o patológicas.

Gracias por ver y mucha suerte con su experimento.