Name: Péptido: MHC tetrámero basado en el enriquecimiento de células T específicos para el epítopo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 58 s
Description: Aprende a aislar células T específicas de epítopos raras usando tetrámeros de péptido:MHC y microesferas magnéticas en ratones. Este método permite estudiar poblaciones policlonales de células T endógenas mediante citometría de flujo.

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Los autores desean dar las gracias a Andre Han y Yen Lawrence para la asistencia técnica, y los miembros del laboratorio de Jenkins en busca de ayuda en el desarrollo de este protocolo.

1. Aislamiento de células del tejido linfoide <ol><li> Añadir 1 ml de hielo frío cEHAA (EHAA + 10% de FBS, penicilina / estreptomicina, gentamicina, 2 mM de L-glutamina, 55 mM de 2-mercaptoetanol) u otro medio equivalente de las células T, a una placa de cultivo de 60 mm que contiene un pequeño cuadrado de 100 micras de malla de nylon y colocar en hielo. </li><li> Eutanasiar ratón. </li><li> Retire el bazo y como muchos nodos linfáticos fácilmente accesibles como sea posible. Estos deben incluir al menos las inguinales, axilares, ganglios linfáticos cervicales, braquial, y mesentérica. Colocarlos en la parte superior de la malla de nylon en la placa de cultivo. </li><li> Usando la parte superior plana cerrada de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, suavemente mezcla el tejido linfoide sobre la malla de nylon para liberar a los linfocitos. Añadir otra ml de 1 cEHAA y pipetear hacia arriba y hacia abajo para trabajar las células en una suspensión. Transferir las células a través de otra pieza de malla de nylon coloca sobre la parte superior de un tubo de centrífuga de 15 ml de polipropileno. Enjuagar la cápsula y de malla con otro 1 ml de hielo frío cEHAA, poOling los volúmenes en el mismo tubo. Repetir para conseguir un volumen de suspensión celular final de 4 ml. </li><li> Añadir tampón clasificador de frío (PBS + 2% de FBS, 0,05% de azida) hasta un volumen final de 15 ml y centrifugar el tubo durante 5 min a 300 xg, 4 ° C. </li><li> Aspirar con cuidado el sobrenadante, asegurándose de que no haya gotas de líquido se quedan en los lados del tubo. Resuspender el sedimento celular en Fc bloque (clasificador de tampón + 2.4G2 anticuerpo) a un volumen final igual a aproximadamente el doble de la del propio gránulo. Por ejemplo, el bazo y nódulos linfáticos de un ratón naive por lo general produce un sedimento celular de aproximadamente 100 l. En este caso, añadir 100 ml de bloque Fc para llevar el volumen a 200 l. Si un alto grado de aglutinación de células se ha producido, retirar cuidadosamente el agregado celular en este punto con una punta de pipeta. </li></ol> 2. Tetramer tinción <ol><li> Añadir PE-o APC marcada con pMHC tetrámero a una concentración final de 10 nM (o concentración empíricamente optimizado). </li><li> Mix and incubaciónTE durante 1 hora a temperatura ambiente (o tiempo empíricamente optimizado y temperatura). </li><li> Añadir tampón clasificador de frío hasta un volumen de 15 ml y centrifugar el tubo durante 5 min a 300 xg, 4 ° C. Mantener las muestras en hielo oa 4 ° C a partir de ahora. </li><li> Aspirar con cuidado el sobrenadante, asegurándose de que no haya gotas de líquido se quedan en los lados del tubo. Resuspender el sedimento celular en tampón clasificador para un volumen final de 200 l. Para el enriquecimiento tetrámero doble, resuspender hasta un volumen final de 150 l. </li></ol> 3. Enriquecimiento magnética <ol><li> Añadir 50 l de microperlas Miltenyi anti-PE o anti-APC. Para el enriquecimiento tetrámero doble, se añaden 50 l de ambos. </li><li> Mezclar e incubar durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Añadir tampón clasificador de frío hasta un volumen de 15 ml y centrifugar el tubo durante 5 min a 300 xg, 4 ° C. </li><li> Mientras se espera, configure una columna Miltenyi LS magnético en un imán midiMACS o QuadroMACS. Posicionar un abierto 15 ml de polipropileno en un tubo de centrífugaacumular directamente debajo de la columna. </li><li> Añadir 3 ml de tampón clasificador a la parte superior de la columna, lo que permite que se drene en el tubo de 15 ml. </li><li> Colocar un nylon 100 micras de malla cuadrada en la parte superior de la columna. </li><li> Cuando las células han terminado de hilado, aspirar con cuidado el sobrenadante y resuspender el sedimento en 3 ml de tampón clasificador. </li><li> Transferir la suspensión celular a través de la malla de nylon en la parte superior de la columna. </li><li> Cuando la suspensión de células se haya vaciado completamente en la columna, enjuagar el tubo original con otro ml de tampón 3 clasificador y transferir el tampón a través de la malla de nylon en la columna, lavar la malla en el proceso. Deseche la malla de nylon. </li><li> Cuando la memoria intermedia se haya vaciado completamente en la columna, añadir otro 3 ml de tampón clasificador a la columna. </li><li> Repetir el paso 10 para un total de 3 x 3 lavados ml. </li><li> Retirar la columna del imán y colocada en un nuevo tubo de centrífuga de 15 ml de polipropileno. </li><li> Añadir 5 ml de tampón clasificador para tél columna. </li><li> Inmediatamente inserte el émbolo en la parte superior de la columna y en un movimiento continuo, empuje el émbolo hacia abajo, forzando el tampón de la columna en el tubo. </li><li> Centrifugar los tubos que contenían la fracción eluida unida y la fracción no unida de flujo a través durante 5 min a 300 xg, 4 ° C. </li><li> Aspirar con cuidado el sobrenadante de la fracción unida, asegurándose de que no haya gotas de líquido se quedan en los lados del tubo. Resuspender el sedimento celular en tampón clasificador para un volumen final de 95 l exactamente. Aspirar y volver a suspender la fracción no unida a un volumen final de 2 ml. </li></ol> 4. Citometría de Flujo <ol><li> Para cada fracción, quitar 5 l y añadir a 200 l de perlas de conteo (ajustado a una concentración de 200.000 / ml en tampón clasificador) en un tubo de 5 ml FACS. De lado a 4 ° C para su posterior análisis. Para ahorrar tiempo, los granos pueden ser pre-alícuotas a tubos etiquetados antes del comienzo del experimento. </li><li> Preparar amaster mezcla de anticuerpos para teñir los marcadores de superficie en las células (Tabla 1). Para ahorrar tiempo, esto se puede hacer antes del comienzo del experimento. </li><li> Para la fracción unida, añadir una dosis de cóctel de anticuerpos directamente al ~ 90 l de células en el tubo. Si el análisis de la fracción no unida se desea, transferir 90 l de células a un tubo de 5 ml FACS y añadir una dosis de cóctel de anticuerpos. </li><li> Crear un panel de controles de compensación de un solo color para el citómetro de flujo. Para cada fluorocromo a utilizar, mezclar 50 l de células sobrantes fracción no unida en un tubo de 5 ml FACS con 1 l de anticuerpo anti-CD4 conjugado con el fluorocromo correspondiente. Recuerde que debe establecer un control sin mancha también. </li><li> Agitar e incubar las muestras durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Añadir 5 ml de tampón clasificador a cada tubo y centrifugar durante 5 min a 300 xg, 4 ° C. </li><li> Para la fracción unida, aspirar con cuidado el sobrenadante y resuspender las células en 200 l de buf clasificadorfer. Transferir las células a un microtubo de 1,2 ml FACS. Enjuague el tubo con otro 200 l de tampón clasificador y la piscina en el mismo microtubo. Si los agregados celulares son evidentes, pasar las células a través de un filtro de 50 micras. </li><li> Para la fracción no unida y controles de compensación, decantar o aspirar el sobrenadante y se resuspende en 2 ml de tampón clasificador. </li><li> Configurar el citómetro de flujo utilizando los controles de compensación de un solo color. Seleccione el lado de dispersión de ancho (SSC-W) como un parámetro adicional que desee grabar. </li><li> Analizar las muestras teñidas utilizando una secuencia de puertas de inclusión sucesivas para identificar CD4 + o CD8 + células T como se ilustra en las Figuras 1 y 2. Para las fracciones consolidados, recoger las células tanto como sea posible hasta un máximo de 2.000.000 de eventos totales. Para las fracciones no unidas, recoger 1.000.000 eventos totales. Mantener la velocidad de adquisición en o debajo de 3.000 eventos por segundo. </li><li> Uso de los ajustes de la máquina misma, analizar las muestras de conteo de cuentas. Recoge un total de 10.000 eventos. &lt;/ Li&gt; <li> Guarde todos los datos como archivos de FCS. </li></ol> 5. Análisis de Datos <ol><li> Analizar FCS archivos de datos para las muestras de recuento de talón utilizando software FlowJo. Parcela dispersión frontal por FITC y configurar una puerta aroung las perlas de recuento (véanse las Figuras 1 y 2). Determinar el número total de recuento de granos detectados en cada muestra. Restar de la cantidad total de eventos recogidos para determinar el número de eventos celulares recogidas. </li><li> Calcule el número total de todas las células en cada muestra utilizando las ecuaciones descritas en el Cuadro 1. </li><li> Analizar FCS archivos de datos de las muestras teñidas fracción unida y no unida. Configurar una secuencia de puertas de inclusión sucesivas para identificar + linfoide, lo lado de ancho de dispersión, vertimiento, CD3 +, CD4 + o CD8 +, tetrámero + células T en cada muestra como se ilustra en las Figuras 1 y 2. </li><li> Multiplicar el número total de células en la muestra por las frecuencias de cada una de las puertas de inclusión utilizados para definir CD4 + tetrámero+ O CD8 + tetrámero + células para calcular el número total de epítopos de células T específicas (Cuadro 1). </li></ol>

<ol><li>Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+analysis+of+T-cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Laboratory analysis of T-cell immunity.</a> Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).</li>
<li>Kearney, E. R., Pape, K. A., Loh, D. Y., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+peptide-specific+T+cell+immunity+and+peripheral+tolerance+induction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Visualization of peptide-specific T cell immunity and peripheral tolerance induction in vivo.</a> Immunity. 1, 327-339 (1994).</li>
<li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+epitope-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Tracking epitope-specific T cells.</a> Nat Protoc. 4, 565-581 (2009).</li>
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<li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+CD4%28%2B%29+T+cell+frequency+varies+for+different+epitopes+and+predicts+repertoire+diversity+and+response+magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude.</a> Immunity. 27, 203-213 (2007).</li>
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<li>Daniels, M. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+CD8+in+T+cell+receptor+binding+and+activation+by+peptide%2Fmajor+histocompatibility+complex+multimers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers.</a> J Exp Med. 191, 335-346 (2000).</li>
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<li>Choi, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+avidity+antigen-specific+CTL+identified+by+CD8-independent+tetramer+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">High avidity antigen-specific CTL identified by CD8-independent tetramer staining.</a> Journal of Immunology. 171, 5116-5123 (2003).</li>
<li>Chu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+selection+optimizes+the+number+and+function+of+MHCII-restricted+CD4%2B+T+cell+clones+in+the+naive+polyclonal+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Positive selection optimizes the number and function of MHCII-restricted CD4+ T cell clones in the naive polyclonal repertoire.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11241-11245 (2009).</li>
<li>Chu, H. H., Moon, J. J., Kruse, A. C., Pepper, M., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+Selection+and+Peptide+Chemistry+Determine+the+Size+of+Naive+Foreign+Peptide-MHC+Class+II-Specific+CD4%2B+T+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Negative Selection and Peptide Chemistry Determine the Size of Naive Foreign Peptide-MHC Class II-Specific CD4+ T Cell Populations.</a> J Immunol. 185, 4705-4713 (2010).</li>
<li>Legoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+TCR+reactivity+and+HLA+phenotype+on+naive+CD8+T+cell+frequency+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Impact of TCR reactivity and HLA phenotype on naive CD8 T cell frequency in humans.</a> J Immunol. 184, 6731-6738 (2010).</li>
<li>Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K., Hasan, M., Albert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+human+antigen-specific+naive+CD8%2B+T+cells+reveals+conserved+precursor+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies.</a> Blood. 115, 3718-3725 (2010).</li>
<li>Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+of+Epitope-Specific+Naive+CD4%2B+T+Cells+Correlates+with+Immunodominance+in+the+Human+Memory+Repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Frequency of Epitope-Specific Naive CD4+ T Cells Correlates with Immunodominance in the Human Memory Repertoire.</a> Journal of Immunology. 188, 2537-2544 (2012).</li>
<li>Jenkins, M. K., Chu, H. H., McLachlan, J. B., Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+composition+of+the+preimmune+repertoire+of+T+cells+specific+for+Peptide-major+histocompatibility+complex+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">On the composition of the preimmune repertoire of T cells specific for Peptide-major histocompatibility complex ligands.</a> Annu Rev Immunol. 28, 275-294 (2010).</li>
<li>Matechak, E. O., Killeen, N., Hedrick, S. M., Fowlkes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-specific+T+cells+can+develop+in+the+CD8+lineage+when+CD4+is+absent%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">MHC class II-specific T cells can develop in the CD8 lineage when CD4 is absent.</a> Immunity. 4, 337-347 (1996).</li>
<li>Burchill, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linked+T+cell+receptor+and+cytokine+signaling+govern+the+development+of+the+regulatory+T+cell+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Linked T cell receptor and cytokine signaling govern the development of the regulatory T cell repertoire.</a> Immunity. 28, 112-121 (2008).</li>
<li>Pepper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+routes+of+bacterial+infection+induce+long-lived+TH1+memory+cells+and+short-lived+TH17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Different routes of bacterial infection induce long-lived TH1 memory cells and short-lived TH17 cells.</a> Nature Immunology. 11, 83-89 (2010).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El pMHC tetrámero basado en el método de enriquecimiento de células presentada por este protocolo es una poderosa herramienta para el estudio de epítopo de células T específicas de repertorios de células T endógenas. El uso de tetrámeros de pMHC permite la detección de células T específicos para el epítopo basado directamente en la capacidad de sus TCR para unir ligandos cognados pMHC. El enriquecimiento proporciona un nivel de sensibilidad de tal manera que las poblaciones extremadamente raros de antígenos específicos ...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reactivo</strong</td&gt;<td<strong&gt; Vendedor</strong</td&gt;<td<strong&gt; El número de catálogo</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PE o APC conjugado tetrámero pMHC (o multímero)</td&gt;<td&gt; Fabricado por investigador, obtenido a partir del núcleo NIH tetrámero, o adquiridos de fuentes comerciales</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-PE microbolas magnéticas conjugadas</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-048-801</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-APC microesferas magnéticas conjugadas</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-090-855</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Ls columnas magnéticas</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-401</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MidiMACS o imán QuadroMACS</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-302 o 130-090-976</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cuentas de recuento celular</td&gt;<td&gt; Life Technologies</td&gt;<td&gt; PCB-100</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

péptido: mhc tetrámero basado en el enriquecimiento de células t específicos para el epítopo

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

Una necesidad básica para los investigadores que estudian la inmunidad adaptativa con modelos experimentales in vivo es la capacidad de identificar las células T en función de su receptor de antígeno de células T (TCR) especificidad. Muchos métodos indirectos están disponibles en el que una población mayor de células T se estimularon in vitro con un antígeno específico y el epítopo de células T específicas se identifican a través de la medición de una respuesta funcional, tal como la proliferación, producción de citoquinas, o la expresión de marcadores de activación 1. Sin embargo, estos métodos sólo identificar epítopos de células T específicas que presentan una de las muchas posibles funciones, y que no son lo suficientemente sensibles como para detectar epítopos de células T específicas en las frecuencias precursoras ingenuas. Una alternativa popular es el modelo de transferencia adoptiva TCR transgénico, en la que las células T monoclonales de un ratón TCR transgénico se siembran en hosts histocompatibles para crear una población grande precursor de células T específicos para el epítopo que pueden ser easiLy seguido con el uso de un anticuerpo marcador congenic 2,3. Mientras potente, este método adolece de artefactos experimentales asociados con la frecuencia no fisiológica de las células T con especificidad para un epítope 4,5 sola. Además, este sistema no se puede utilizar para investigar la heterogeneidad funcional del epítopo específicos de clones de células T dentro de una población policlonal. La forma ideal para estudiar la inmunidad adaptativa debe implicar la detección directa de epítopo de células T específicas del repertorio de células T endógeno utilizando un método que distingue la especificidad TCR únicamente por su unión a péptido cognado: complejos de MHC (pMHC). El uso de tetrámeros y citometría de flujo pMHC logra esto 6, pero se limita a la detección de poblaciones de alta frecuencia de células T específicos para el epítopo que sólo se encuentran siguiente inducida por antígeno expansión clonal. En este protocolo, se describe un método que coordina el uso de tetrámeros pMHC y magnetic tecnología de enriquecimiento de células para permitir la detección de células de frecuencia extremadamente baja T específicos para el epítopo de los tejidos linfoides de ratón 3,7. Con esta técnica, se puede realizar un seguimiento integral enteros específicos de epítopo poblaciones endógenas de las células T en ratones en todas las etapas de la respuesta inmune.

La Figura 1 muestra representativas parcelas de citometría de flujo de pMHCII tetrámero bazo enriquecidos y muestras de ganglios linfáticos de ratones sin tratamiento previo, mientras que la Figura 2 muestra los datos representativos de ratones previamente inmunizados con el péptido relevante + CFA. Gating serie elimina eventos no deseados autofluorescentes y otro a partir del análisis de las células CD4 + T poblaciones celulares. El CD8 + población de células T sirve como un control ne...

Este protocolo describe el uso de péptido: MHC tetrámeros y microperlas magnéticas para aislar poblaciones de baja frecuencia de células T específicos para el epítopo y analizarlas por citometría de flujo. Este método permite el estudio directo de sus propias poblaciones de células T de interés de<em&gt; In vivo</em&gt; Los sistemas experimentales.

Péptido: MHC tetrámero basado en el enriquecimiento de células T específicos para el epítopo

Una necesidad básica para los investigadores que estudian la inmunidad adaptativa con modelos experimentales in vivo es la capacidad de identificar las células T basándose en su...

El objetivo general del siguiente experimento es identificar linfocitos T específicos de epítopos raros a partir del repertorio endógeno de linfocitos T de ratones. Esto se logra primero teñiendo células linfoides recolectadas con reactivos de tetrámeros peptídicos de MHC, que etiquetarán fluorescentemente los linfocitos T específicos del epítopo relevante. Luego, estas células marcadas con tetrámero se tiñen con microperlas magnéticas conjugadas con anticuerpos específicos para la etiqueta fluorescente del tetrámero.A continuación, las células marcadas magnéticamente se pasan a través de una columna magnetizada con el fin de enriquecer la muestra con linfocitos T específicos del epítopo unido al tetrámero. Finalmente, las células se tiñen con los marcadores celulares experimentales deseados y se realiza citometría de flujo multiparamétrica para detectar y cuantificar las poblaciones raras de linfocitos T específicos del epítopo enriquecidos con tetrámero. La principal ventaja de utilizar esta técnica frente a otros métodos existentes, como el sistema de transferencia adoptiva de linfocitos T transgénicos para el TCR, es que los estudios se realizan con poblaciones policlonales reales de linfocitos T específicos del epítopo que se desarrollan naturalmente dentro del sistema inmunitario.Además, la alta sensibilidad de detección que proporciona esta técnica permite estudiar estas poblaciones cuando están presentes en frecuencias extremadamente bajas. Este método puede ayudar a responder muchas preguntas clave en el campo de la inmunología, como cuántas células T naïve pueden reconocer un antígeno determinado proveniente de un microbio patógeno, y cómo cambia la composición clonal de una población de células T específicas para un epítopo a lo largo del curso de una respuesta inmunitaria. Antes de comenzar la disección, agregue un mililitro de medio EHAA completo a una placa de cultivo de 60 milímetros que contenga un pequeño cuadrado de malla de nailon de 100 micrones, y coloque la placa en hielo.Luego, retire el bazo de un ratón sacrificado y tantos ganglios linfáticos fácilmente accesibles como sea posible. Coloque los tejidos encima de la malla de nailon en la placa de cultivo. Utilice la parte superior plana de un tubo microcentrífugo cerrado de 1,5 milímetros para machacar suavemente los tejidos linfoides sobre la malla de nailon.Para liberar los linfocitos, agregue otro mililitro de medio al recipiente y luego aspire y expulse la solución varias veces con una pipeta para suspender las células. A continuación, coloque una nueva malla de nailon sobre un tubo cónico de polipropileno de 15 mililitros limpio y transfiera las células a través de la nueva malla. Enjuague el recipiente y la malla con otro mililitro de medio frío y haga pasar los volúmenes a través del nuevo trozo de malla hacia el tubo de 15 mililitros.Repita el lavado una vez más. Después de agregar tampón frío para clasificación hasta un volumen final de 15 mililitros, centrifugue el tubo durante cinco minutos a 300 ×g y 4 °C. Luego aspire cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda.Suspenda el sedimento celular en el bloqueador de FC hasta un volumen final equivalente aproximadamente al doble del volumen del sedimento mismo. Si se ha producido un alto grado de agregación celular, retire cuidadosamente el agregado celular con la punta de una pipeta para teñir las células T específicas del antígeno.Añada el tetrámero de péptido-MHC marcado con fluorescencia al precipitado celular resuspendido en la concentración optimizada. Luego mezcle la suspensión celular e incube durante el tiempo y a la temperatura optimizados para la unión del tetrámero. A continuación, añada tampón frío para clasificación para llevar el volumen hasta 15 mililitros y centrifugue manteniendo las células a cuatro grados Celsius.A partir de ahora, aspire cuidadosamente el sobrenadante. Luego, resuspenda el botón celular en tampón para el ordenador hasta un volumen final de 200 microlitros. Añada ahora 50 microlitros de microesferas conjugadas con anticuerpo mil tenny que se unirán específicamente a la etiqueta fluorescente de la mezcla de tetrámeros, e incube las células unidas a tetrámeros y las microesferas a cuatro grados Celsius.Después de 20 minutos, lave las células en tampón de clasificación mientras las células están en la centrífuga. Coloque una columna magnética Milani LS sobre un imán Quadro Max y posicione un nuevo tubo cónico de polipropileno de 15 mililitros directamente debajo de la columna. Añada tres mililitros de tampón de clasificación en la parte superior de la columna, permitiendo que drene hacia el tubo de 15 mililitros.Luego, coloque un cuadrado de malla de nailon de 100 micrones encima de la columna. Cuando las células hayan terminado de centrifugarse, aspire cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda el precipitado en tres mililitros de tampón de clasificación, transfiera la suspensión celular a través de la malla de nailon hasta la parte superior de la columna. Cuando la suspensión celular haya drenado completamente dentro de la columna, enjuague el tubo original con otros tres mililitros de tampón de clasificación y transfiera a través de la malla hacia la columna.Al reunir el lavado en el tubo de recolección, deseche la malla de nailon. Luego, cuando el tampón haya drenado completamente hacia el tubo, lave la columna dos veces más con tres mililitros de tampón para citómetro cada vez. A continuación, retire la columna del imán y coloque la columna sobre un nuevo tubo cónico de polipropileno de 15 mililitros.Ahora agregue otros cinco mililitros de tampón de clasificación a la columna. Inserte inmediatamente el émbolo en la parte superior de la columna y, en un solo movimiento continuo, empuje el émbolo completamente hacia abajo, forzando al tampón a salir de la columna hacia el tubo. Después de centrifugar tanto el tubo que contiene la fracción ligada eluida como el tubo que contiene la fracción no ligada del flujo atravesado, aspire cuidadosamente el sobrenadante de la fracción ligada y resuspenda el pellet celular en tampón de clasificación hasta un volumen final exacto de 95 microlitros; aspire y resuspenda la fracción no ligada hasta un volumen final de dos mililitros. Antes de teñir aún más las fracciones celulares, agregue 200 microlitros de esferas de conteo en un tubo FACS de cinco mililitros y transfiera cinco microlitros de células a este tubo.Deje estos tubos aparte a cuatro grados Celsius para su análisis. Posteriormente, combine una mezcla maestra de anticuerpos para teñir marcadores de superficie en las células según la tabla. Para la fracción ligada, agregue una dosis de cóctel de anticuerpos directamente a las células para la fracción no ligada.Transfiera 90 microlitros de las células a un tubo fax de cinco mililitros y agregue una dosis de cóctel de anticuerpos a la muestra transferida por cada fluorocromo que se vaya a utilizar. Mezcle 50 microlitros de la fracción de células no ligadas restante en un tubo fax de cinco mililitros con un microlitro de anticuerpo anti-CD4 conjugado al fluorocromo apropiado. Reserve también un control sin teñir junto al vórtex, y luego incube todas las muestras a cuatro grados Celsius durante 30 minutos.Luego de lavar cada tubo con cinco mililitros de tampón de clasificación, aspire cuidadosamente el sobrenadante de las muestras de la fracción unida y resuspenda las células en 200 microlitros de tampón de clasificación. Transfiera las células a tubos microfugas de 1,2 mililitros y luego enjuague sus tubos anteriores con otros 200 microlitros de tampón de clasificación, agregando los enjuagues a los tubos microfugas correspondientes. Si se observan grumos, pase las células a través de un filtro de 50 micrones para la fracción no unida y los controles de compensación, decante el sobrenadante y resuspenda los pellet en un mililitro de tampón de clasificación.Analice las muestras teñidas utilizando una secuencia de compuertas de inclusión sucesivas para identificar linfocitos T positivos para CD cuatro o positivos para CD ocho, como se ilustra aquí para las muestras de fracción ligada. Recolecte tantas células como sea posible, hasta un máximo de 2 millones de eventos totales para las muestras de fracción no ligada. Recolecte 1 millón de eventos totales.Finalmente, utilizando los mismos ajustes de la máquina, recolecte 10.000 eventos de las muestras de perlas de conteo. Esta primera figura MUESTRA gráficos representativos de citometría de flujo de muestras de bazo y ganglios linfáticos enriquecidas con tetrámeros de péptido CMH clase II de ratones no tratados, para las fracciones de células ligadas y no ligadas. Se estableció una sucesión de compuertas para seleccionar eventos positivos para dispersión lateral con dispersión hacia adelante positiva de linfocitos y negativos para el marcador de descarte (dump) y positivos para CD3; de estos, los eventos positivos para CD4 o positivos para CD8 se compuertaron para el análisis de linfocitos T específicos para el epítopo o de la tinción de fondo.Se mezclaron alícuotas de células no teñidas de las fracciones ligadas y no ligadas con cuentas fluorescentes de conteo y se analizaron por separado. Estos gráficos de densidad muestran datos representativos de ratones previamente inmunizados con el péptido relevante más adyuvante completo. Se utilizó la misma estrategia de selección en serie que en el experimento anterior para eliminar cualquier autofluorescencia y otros eventos no deseados.Del análisis de las poblaciones de linfocitos T CD4 positivos, la población de linfocitos T CD8 positivos sirvió como un control negativo interno útil para la tinción con tetrámeros peptídicos de MHC clase II en linfocitos T CD4 positivos. El número absoluto de linfocitos T específicos del epítopo en una muestra se calcula multiplicando el número total de todas las células en la fracción unida de la muestra enriquecida, determinado mediante el análisis del conteo de microesferas, por la proporción de estas células que son positivas para el tetrámero, determinada mediante el análisis de tinción celular. Para los datos representativos del ratón naïve mostrados en la primera serie de gráficos de densidad, el conteo total de células fue de 4.411 y el conteo de microesferas fue de 5.589. La concentración del stock de microesferas fue de 2 × 10⁵ por mililitro.El volumen de las perlas fue de 0,2 mililitros y el volumen celular fue de 0,005 mililitros. Por lo tanto, estos datos se utilizaron para calcular la concentración celular de 6,31 × 10⁶ por mililitro. Luego, la concentración celular se multiplicó por el volumen total de la muestra para obtener el número total de células.Estos datos, a su vez, se multiplicaron por el porcentaje de eventos positivos para el tetrámero provenientes del análisis celular para determinar que el número de linfocitos T CD4 positivos específicos del epítopo en este ratón naïve fue de 98. Para los datos representativos del ratón inmunizado en la segunda serie de gráficos de densidad, el número total de linfocitos T CD4 positivos específicos del epítopo fue de 1,53 veces 10 a la cuarta. La eficiencia del enriquecimiento disminuye a medida que aumenta el número de linfocitos T específicos del epítopo.Por lo tanto, las células positivas para el tetrámero pueden observarse en la fracción no unida de muestras que contienen frecuencias muy altas de linfocitos T específicos del epítopo. En tales casos, el número de linfocitos T específicos del epítopo presentes en la fracción no unida puede calcularse por separado y sumarse al número encontrado en la fracción unida. Por ejemplo, en la fracción de células no unidas de un ratón inmunizado representativo, el número total de linfocitos T CD4 positivos específicos del epítopo fue de 8,97 × 10³.Por lo tanto, al sumar los números en las fracciones ligadas y no ligadas, había 2,43 veces 10 a la cuarta células T CD4 positivas específicas del epítopo en total en la muestra completa del ratón inmunizado. De hecho, si la expansión de células específicas del epítopo es suficientemente robusta, puede omitirse el proceso de enriquecimiento. Tras el procedimiento de enriquecimiento, pueden realizarse pasos de fijación y permeabilización para permitir la tinción de proteínas intracelulares, como citocinas y factores de transcripción.Aunque este método fue diseñado originalmente para estudios de linfocitos T provenientes del bazo y los ganglios linfáticos, también puede aplicarse a otros tejidos como el timo y el intestino. La técnica también puede utilizarse para estudiar linfocitos T de epítopos específicos en muestras de sangre y tejidos humanos.

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Investigación

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