Name: Péptido: MHC tetrámero basado en el enriquecimiento de células T específicos para el epítopo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 58 s
Description: Aprende a aislar células T específicas de epítopos raras usando tetrámeros de péptido:MHC y microesferas magnéticas en ratones. Este método permite estudiar poblaciones policlonales de células T endógenas mediante citometría de flujo.

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Los autores desean dar las gracias a Andre Han y Yen Lawrence para la asistencia técnica, y los miembros del laboratorio de Jenkins en busca de ayuda en el desarrollo de este protocolo.

1. Aislamiento de células del tejido linfoide <ol><li> Añadir 1 ml de hielo frío cEHAA (EHAA + 10% de FBS, penicilina / estreptomicina, gentamicina, 2 mM de L-glutamina, 55 mM de 2-mercaptoetanol) u otro medio equivalente de las células T, a una placa de cultivo de 60 mm que contiene un pequeño cuadrado de 100 micras de malla de nylon y colocar en hielo. </li><li> Eutanasiar ratón. </li><li> Retire el bazo y como muchos nodos linfáticos fácilmente accesibles como sea posible. Estos deben incluir al menos las inguinales, axilares, ganglios linfáticos cervicales, braquial, y mesentérica. Colocarlos en la parte superior de la malla de nylon en la placa de cultivo. </li><li> Usando la parte superior plana cerrada de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, suavemente mezcla el tejido linfoide sobre la malla de nylon para liberar a los linfocitos. Añadir otra ml de 1 cEHAA y pipetear hacia arriba y hacia abajo para trabajar las células en una suspensión. Transferir las células a través de otra pieza de malla de nylon coloca sobre la parte superior de un tubo de centrífuga de 15 ml de polipropileno. Enjuagar la cápsula y de malla con otro 1 ml de hielo frío cEHAA, poOling los volúmenes en el mismo tubo. Repetir para conseguir un volumen de suspensión celular final de 4 ml. </li><li> Añadir tampón clasificador de frío (PBS + 2% de FBS, 0,05% de azida) hasta un volumen final de 15 ml y centrifugar el tubo durante 5 min a 300 xg, 4 ° C. </li><li> Aspirar con cuidado el sobrenadante, asegurándose de que no haya gotas de líquido se quedan en los lados del tubo. Resuspender el sedimento celular en Fc bloque (clasificador de tampón + 2.4G2 anticuerpo) a un volumen final igual a aproximadamente el doble de la del propio gránulo. Por ejemplo, el bazo y nódulos linfáticos de un ratón naive por lo general produce un sedimento celular de aproximadamente 100 l. En este caso, añadir 100 ml de bloque Fc para llevar el volumen a 200 l. Si un alto grado de aglutinación de células se ha producido, retirar cuidadosamente el agregado celular en este punto con una punta de pipeta. </li></ol> 2. Tetramer tinción <ol><li> Añadir PE-o APC marcada con pMHC tetrámero a una concentración final de 10 nM (o concentración empíricamente optimizado). </li><li> Mix and incubaciónTE durante 1 hora a temperatura ambiente (o tiempo empíricamente optimizado y temperatura). </li><li> Añadir tampón clasificador de frío hasta un volumen de 15 ml y centrifugar el tubo durante 5 min a 300 xg, 4 ° C. Mantener las muestras en hielo oa 4 ° C a partir de ahora. </li><li> Aspirar con cuidado el sobrenadante, asegurándose de que no haya gotas de líquido se quedan en los lados del tubo. Resuspender el sedimento celular en tampón clasificador para un volumen final de 200 l. Para el enriquecimiento tetrámero doble, resuspender hasta un volumen final de 150 l. </li></ol> 3. Enriquecimiento magnética <ol><li> Añadir 50 l de microperlas Miltenyi anti-PE o anti-APC. Para el enriquecimiento tetrámero doble, se añaden 50 l de ambos. </li><li> Mezclar e incubar durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Añadir tampón clasificador de frío hasta un volumen de 15 ml y centrifugar el tubo durante 5 min a 300 xg, 4 ° C. </li><li> Mientras se espera, configure una columna Miltenyi LS magnético en un imán midiMACS o QuadroMACS. Posicionar un abierto 15 ml de polipropileno en un tubo de centrífugaacumular directamente debajo de la columna. </li><li> Añadir 3 ml de tampón clasificador a la parte superior de la columna, lo que permite que se drene en el tubo de 15 ml. </li><li> Colocar un nylon 100 micras de malla cuadrada en la parte superior de la columna. </li><li> Cuando las células han terminado de hilado, aspirar con cuidado el sobrenadante y resuspender el sedimento en 3 ml de tampón clasificador. </li><li> Transferir la suspensión celular a través de la malla de nylon en la parte superior de la columna. </li><li> Cuando la suspensión de células se haya vaciado completamente en la columna, enjuagar el tubo original con otro ml de tampón 3 clasificador y transferir el tampón a través de la malla de nylon en la columna, lavar la malla en el proceso. Deseche la malla de nylon. </li><li> Cuando la memoria intermedia se haya vaciado completamente en la columna, añadir otro 3 ml de tampón clasificador a la columna. </li><li> Repetir el paso 10 para un total de 3 x 3 lavados ml. </li><li> Retirar la columna del imán y colocada en un nuevo tubo de centrífuga de 15 ml de polipropileno. </li><li> Añadir 5 ml de tampón clasificador para tél columna. </li><li> Inmediatamente inserte el émbolo en la parte superior de la columna y en un movimiento continuo, empuje el émbolo hacia abajo, forzando el tampón de la columna en el tubo. </li><li> Centrifugar los tubos que contenían la fracción eluida unida y la fracción no unida de flujo a través durante 5 min a 300 xg, 4 ° C. </li><li> Aspirar con cuidado el sobrenadante de la fracción unida, asegurándose de que no haya gotas de líquido se quedan en los lados del tubo. Resuspender el sedimento celular en tampón clasificador para un volumen final de 95 l exactamente. Aspirar y volver a suspender la fracción no unida a un volumen final de 2 ml. </li></ol> 4. Citometría de Flujo <ol><li> Para cada fracción, quitar 5 l y añadir a 200 l de perlas de conteo (ajustado a una concentración de 200.000 / ml en tampón clasificador) en un tubo de 5 ml FACS. De lado a 4 ° C para su posterior análisis. Para ahorrar tiempo, los granos pueden ser pre-alícuotas a tubos etiquetados antes del comienzo del experimento. </li><li> Preparar amaster mezcla de anticuerpos para teñir los marcadores de superficie en las células (Tabla 1). Para ahorrar tiempo, esto se puede hacer antes del comienzo del experimento. </li><li> Para la fracción unida, añadir una dosis de cóctel de anticuerpos directamente al ~ 90 l de células en el tubo. Si el análisis de la fracción no unida se desea, transferir 90 l de células a un tubo de 5 ml FACS y añadir una dosis de cóctel de anticuerpos. </li><li> Crear un panel de controles de compensación de un solo color para el citómetro de flujo. Para cada fluorocromo a utilizar, mezclar 50 l de células sobrantes fracción no unida en un tubo de 5 ml FACS con 1 l de anticuerpo anti-CD4 conjugado con el fluorocromo correspondiente. Recuerde que debe establecer un control sin mancha también. </li><li> Agitar e incubar las muestras durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Añadir 5 ml de tampón clasificador a cada tubo y centrifugar durante 5 min a 300 xg, 4 ° C. </li><li> Para la fracción unida, aspirar con cuidado el sobrenadante y resuspender las células en 200 l de buf clasificadorfer. Transferir las células a un microtubo de 1,2 ml FACS. Enjuague el tubo con otro 200 l de tampón clasificador y la piscina en el mismo microtubo. Si los agregados celulares son evidentes, pasar las células a través de un filtro de 50 micras. </li><li> Para la fracción no unida y controles de compensación, decantar o aspirar el sobrenadante y se resuspende en 2 ml de tampón clasificador. </li><li> Configurar el citómetro de flujo utilizando los controles de compensación de un solo color. Seleccione el lado de dispersión de ancho (SSC-W) como un parámetro adicional que desee grabar. </li><li> Analizar las muestras teñidas utilizando una secuencia de puertas de inclusión sucesivas para identificar CD4 + o CD8 + células T como se ilustra en las Figuras 1 y 2. Para las fracciones consolidados, recoger las células tanto como sea posible hasta un máximo de 2.000.000 de eventos totales. Para las fracciones no unidas, recoger 1.000.000 eventos totales. Mantener la velocidad de adquisición en o debajo de 3.000 eventos por segundo. </li><li> Uso de los ajustes de la máquina misma, analizar las muestras de conteo de cuentas. Recoge un total de 10.000 eventos. &lt;/ Li&gt; <li> Guarde todos los datos como archivos de FCS. </li></ol> 5. Análisis de Datos <ol><li> Analizar FCS archivos de datos para las muestras de recuento de talón utilizando software FlowJo. Parcela dispersión frontal por FITC y configurar una puerta aroung las perlas de recuento (véanse las Figuras 1 y 2). Determinar el número total de recuento de granos detectados en cada muestra. Restar de la cantidad total de eventos recogidos para determinar el número de eventos celulares recogidas. </li><li> Calcule el número total de todas las células en cada muestra utilizando las ecuaciones descritas en el Cuadro 1. </li><li> Analizar FCS archivos de datos de las muestras teñidas fracción unida y no unida. Configurar una secuencia de puertas de inclusión sucesivas para identificar + linfoide, lo lado de ancho de dispersión, vertimiento, CD3 +, CD4 + o CD8 +, tetrámero + células T en cada muestra como se ilustra en las Figuras 1 y 2. </li><li> Multiplicar el número total de células en la muestra por las frecuencias de cada una de las puertas de inclusión utilizados para definir CD4 + tetrámero+ O CD8 + tetrámero + células para calcular el número total de epítopos de células T específicas (Cuadro 1). </li></ol>

<ol><li>Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+analysis+of+T-cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Laboratory analysis of T-cell immunity.</a> Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).</li>
<li>Kearney, E. R., Pape, K. A., Loh, D. Y., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+peptide-specific+T+cell+immunity+and+peripheral+tolerance+induction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Visualization of peptide-specific T cell immunity and peripheral tolerance induction in vivo.</a> Immunity. 1, 327-339 (1994).</li>
<li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+epitope-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Tracking epitope-specific T cells.</a> Nat Protoc. 4, 565-581 (2009).</li>
<li>Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+memory+CD4%2B+T+cell+survival+controlled+by+clonal+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance.</a> Science. 312, 114-116 (2006).</li>
<li>Marzo, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+T+cell+frequency+dictates+memory+CD8%2B+T+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Initial T cell frequency dictates memory CD8+ T cell lineage commitment.</a> Nat Immunol. 6, 793-799 (2005).</li>
<li>Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+the+repertoire%3A+broadening+the+scope+of+peptide-MHC+multimer+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis.</a> Nature reviews. Immunology. 11, 551-558 (2011).</li>
<li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+CD4%28%2B%29+T+cell+frequency+varies+for+different+epitopes+and+predicts+repertoire+diversity+and+response+magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude.</a> Immunity. 27, 203-213 (2007).</li>
<li>Seah, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+linear+range+for+accurately+quantifying+antigen-specific+T-cell+frequencies+by+tetramer+staining+during+natural+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The linear range for accurately quantifying antigen-specific T-cell frequencies by tetramer staining during natural immune responses.</a> European Journal of Immunology. 41, 1499-1500 (2011).</li>
<li>Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+naive+CD8%2B+T+cell+precursor+frequency+regulates+primary+and+memory+responses+to+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection.</a> Immunity. 28, 859-869 (2008).</li>
<li>Daniels, M. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+CD8+in+T+cell+receptor+binding+and+activation+by+peptide%2Fmajor+histocompatibility+complex+multimers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers.</a> J Exp Med. 191, 335-346 (2000).</li>
<li>Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha+3+domain+mutants+of+peptide%2FMHC+class+I+multimers+allow+the+selective+isolation+of+high+avidity+tumor-reactive+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Alpha 3 domain mutants of peptide/MHC class I multimers allow the selective isolation of high avidity tumor-reactive CD8 T cells.</a> Journal of Immunology. 171, 1844-1849 (2003).</li>
<li>Choi, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+avidity+antigen-specific+CTL+identified+by+CD8-independent+tetramer+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">High avidity antigen-specific CTL identified by CD8-independent tetramer staining.</a> Journal of Immunology. 171, 5116-5123 (2003).</li>
<li>Chu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+selection+optimizes+the+number+and+function+of+MHCII-restricted+CD4%2B+T+cell+clones+in+the+naive+polyclonal+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Positive selection optimizes the number and function of MHCII-restricted CD4+ T cell clones in the naive polyclonal repertoire.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11241-11245 (2009).</li>
<li>Chu, H. H., Moon, J. J., Kruse, A. C., Pepper, M., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+Selection+and+Peptide+Chemistry+Determine+the+Size+of+Naive+Foreign+Peptide-MHC+Class+II-Specific+CD4%2B+T+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Negative Selection and Peptide Chemistry Determine the Size of Naive Foreign Peptide-MHC Class II-Specific CD4+ T Cell Populations.</a> J Immunol. 185, 4705-4713 (2010).</li>
<li>Legoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+TCR+reactivity+and+HLA+phenotype+on+naive+CD8+T+cell+frequency+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Impact of TCR reactivity and HLA phenotype on naive CD8 T cell frequency in humans.</a> J Immunol. 184, 6731-6738 (2010).</li>
<li>Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K., Hasan, M., Albert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+human+antigen-specific+naive+CD8%2B+T+cells+reveals+conserved+precursor+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies.</a> Blood. 115, 3718-3725 (2010).</li>
<li>Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+of+Epitope-Specific+Naive+CD4%2B+T+Cells+Correlates+with+Immunodominance+in+the+Human+Memory+Repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Frequency of Epitope-Specific Naive CD4+ T Cells Correlates with Immunodominance in the Human Memory Repertoire.</a> Journal of Immunology. 188, 2537-2544 (2012).</li>
<li>Jenkins, M. K., Chu, H. H., McLachlan, J. B., Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+composition+of+the+preimmune+repertoire+of+T+cells+specific+for+Peptide-major+histocompatibility+complex+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">On the composition of the preimmune repertoire of T cells specific for Peptide-major histocompatibility complex ligands.</a> Annu Rev Immunol. 28, 275-294 (2010).</li>
<li>Matechak, E. O., Killeen, N., Hedrick, S. M., Fowlkes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-specific+T+cells+can+develop+in+the+CD8+lineage+when+CD4+is+absent%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">MHC class II-specific T cells can develop in the CD8 lineage when CD4 is absent.</a> Immunity. 4, 337-347 (1996).</li>
<li>Burchill, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linked+T+cell+receptor+and+cytokine+signaling+govern+the+development+of+the+regulatory+T+cell+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Linked T cell receptor and cytokine signaling govern the development of the regulatory T cell repertoire.</a> Immunity. 28, 112-121 (2008).</li>
<li>Pepper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+routes+of+bacterial+infection+induce+long-lived+TH1+memory+cells+and+short-lived+TH17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Different routes of bacterial infection induce long-lived TH1 memory cells and short-lived TH17 cells.</a> Nature Immunology. 11, 83-89 (2010).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El pMHC tetrámero basado en el método de enriquecimiento de células presentada por este protocolo es una poderosa herramienta para el estudio de epítopo de células T específicas de repertorios de células T endógenas. El uso de tetrámeros de pMHC permite la detección de células T específicos para el epítopo basado directamente en la capacidad de sus TCR para unir ligandos cognados pMHC. El enriquecimiento proporciona un nivel de sensibilidad de tal manera que las poblaciones extremadamente raros de antígenos específicos ...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reactivo</strong</td&gt;<td<strong&gt; Vendedor</strong</td&gt;<td<strong&gt; El número de catálogo</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PE o APC conjugado tetrámero pMHC (o multímero)</td&gt;<td&gt; Fabricado por investigador, obtenido a partir del núcleo NIH tetrámero, o adquiridos de fuentes comerciales</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-PE microbolas magnéticas conjugadas</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-048-801</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-APC microesferas magnéticas conjugadas</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-090-855</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Ls columnas magnéticas</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-401</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MidiMACS o imán QuadroMACS</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-302 o 130-090-976</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cuentas de recuento celular</td&gt;<td&gt; Life Technologies</td&gt;<td&gt; PCB-100</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

péptido: mhc tetrámero basado en el enriquecimiento de células t específicos para el epítopo

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

Una necesidad básica para los investigadores que estudian la inmunidad adaptativa con modelos experimentales in vivo es la capacidad de identificar las células T en función de su receptor de antígeno de células T (TCR) especificidad. Muchos métodos indirectos están disponibles en el que una población mayor de células T se estimularon in vitro con un antígeno específico y el epítopo de células T específicas se identifican a través de la medición de una respuesta funcional, tal como la proliferación, producción de citoquinas, o la expresión de marcadores de activación 1. Sin embargo, estos métodos sólo identificar epítopos de células T específicas que presentan una de las muchas posibles funciones, y que no son lo suficientemente sensibles como para detectar epítopos de células T específicas en las frecuencias precursoras ingenuas. Una alternativa popular es el modelo de transferencia adoptiva TCR transgénico, en la que las células T monoclonales de un ratón TCR transgénico se siembran en hosts histocompatibles para crear una población grande precursor de células T específicos para el epítopo que pueden ser easiLy seguido con el uso de un anticuerpo marcador congenic 2,3. Mientras potente, este método adolece de artefactos experimentales asociados con la frecuencia no fisiológica de las células T con especificidad para un epítope 4,5 sola. Además, este sistema no se puede utilizar para investigar la heterogeneidad funcional del epítopo específicos de clones de células T dentro de una población policlonal. La forma ideal para estudiar la inmunidad adaptativa debe implicar la detección directa de epítopo de células T específicas del repertorio de células T endógeno utilizando un método que distingue la especificidad TCR únicamente por su unión a péptido cognado: complejos de MHC (pMHC). El uso de tetrámeros y citometría de flujo pMHC logra esto 6, pero se limita a la detección de poblaciones de alta frecuencia de células T específicos para el epítopo que sólo se encuentran siguiente inducida por antígeno expansión clonal. En este protocolo, se describe un método que coordina el uso de tetrámeros pMHC y magnetic tecnología de enriquecimiento de células para permitir la detección de células de frecuencia extremadamente baja T específicos para el epítopo de los tejidos linfoides de ratón 3,7. Con esta técnica, se puede realizar un seguimiento integral enteros específicos de epítopo poblaciones endógenas de las células T en ratones en todas las etapas de la respuesta inmune.

La Figura 1 muestra representativas parcelas de citometría de flujo de pMHCII tetrámero bazo enriquecidos y muestras de ganglios linfáticos de ratones sin tratamiento previo, mientras que la Figura 2 muestra los datos representativos de ratones previamente inmunizados con el péptido relevante + CFA. Gating serie elimina eventos no deseados autofluorescentes y otro a partir del análisis de las células CD4 + T poblaciones celulares. El CD8 + población de células T sirve como un control ne...

Este protocolo describe el uso de péptido: MHC tetrámeros y microperlas magnéticas para aislar poblaciones de baja frecuencia de células T específicos para el epítopo y analizarlas por citometría de flujo. Este método permite el estudio directo de sus propias poblaciones de células T de interés de<em&gt; In vivo</em&gt; Los sistemas experimentales.

Péptido: MHC tetrámero basado en el enriquecimiento de células T específicos para el epítopo

Una necesidad básica para los investigadores que estudian la inmunidad adaptativa con modelos experimentales in vivo es la capacidad de identificar las células T basándose en su...

El objetivo general del siguiente experimento es identificar linfocitos T específicos de epítopos raros a partir del repertorio endógeno de linfocitos T de ratones. Esto se logra primero teñiendo células linfoides recolectadas con reactivos de tetrámeros peptídicos de MHC, que etiquetarán fluorescentemente los linfocitos T específicos del epítopo relevante. Luego, estas células marcadas con tetrámero se tiñen con microperlas magnéticas conjugadas con anticuerpos específicos para la etiqueta fluorescente del tetrámero.A continuación, las células marcadas magnéticamente se pasan a través de una columna magnetizada con el fin de enriquecer la muestra con linfocitos T específicos del epítopo unido al tetrámero. Finalmente, las células se tiñen con los marcadores celulares experimentales deseados y se realiza citometría de flujo multiparamétrica para detectar y cuantificar las poblaciones raras de linfocitos T específicos del epítopo enriquecidos con tetrámero. La principal ventaja de utilizar esta técnica frente a otros métodos existentes, como el sistema de transferencia adoptiva de linfocitos T transgénicos para el TCR, es que los estudios se realizan con poblaciones policlonales rea

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este procedimiento muestra la purificación y la expansión in vitro de las células CD4 + antígeno específico de células T de sangre periférica y su visualización utilizando tetrámeros de MHC de clase II. Tetrámeros permitir la visualización directa de las células T con una especificidad de antígeno único y definido restricción MHC de clase II.

Visualización de antígeno específico de células T CD4 + con MHC de clase II tetrámeros

Este video describe un protocolo para aislar células T CD8+ específicas de antígenos raros utilizando células presentadoras de antígenos artificiales (aAPCs) basadas en nanopartículas magnéticas funcionalizadas con MHC-Igs cargadas de péptidos antigénicos y anticuerpos anti-CD28. La interacción de las aAPC con los linfocitos T CD8+ que expresan específicamente los receptores de linfocitos T dirigidos a péptidos antigénicos, seguida de su expansión in vitro, da como resultado el enriquecimiento...

Enriquecimiento y expansión basados en nanopartículas de linfocitos T CD8+ específicos de antígenos

Este video muestra un método para caracterizar las células T de memoria CD8+ específicas para el virus de inmunodeficiencia de simio (VIS) utilizando tetrámeros del complejo de histocompatibilidad peptídico mayor de clase I (PMHC-I). Un tetrámero pMHC-I es un complejo de cuatro moléculas MHC-I unidas a péptidos específicos de SIV y conjugadas a un fluoróforo. Estos tetrámeros se unen selectivamente a los receptores de células T (TCR) en las células T CD8+ específicas del VIS, lo que facilita la...

Una técnica de tinción de tetrámero de péptido-MHC-I para analizar células T de memoria CD8+ específicas de SIV

Ensayos bioquímicos con moléculas recombinantes humanas MHC II pueden proporcionar rápidas, ideas cuantitativos en la identificación epítopo inmunogénico, eliminación o diseño. Aquí, se describe un ensayo de unión péptido-MHC II a escala para placas de 384 pocillos. Este formato rentable puede ser muy útil en los campos de desinmunización proteínas y diseño y desarrollo de vacunas.

Un ensayo de unión de alto rendimiento MHC II para el análisis cuantitativo del péptido epítopos

Este manuscrito describe cómo realizar ensayos basados en la Transferencia de Energía por Resonancia de Förster (FRET) (molécula única) para medir la dinámica de unión entre el receptor de antígeno de células T (TCR) y las moléculas MHC cargadas de péptidos antigénicos a medida que ocurren dentro de la sinapsis inmunológica de una célula T en contacto con una bicapa lipídica plana funcionalizada con soporte.

Medición de TCR-pMHC Encuadernación<em&gt; In Situ</em&gt; Usando un ensayo de microscopía basada en FRET

A continuación, presentamos un protocolo optimizado para enumerar y caracterizar las células T CD8 + macaco rhesus contra el virus del SIDA. Este artículo es útil no sólo para el campo de la inmunología del VIH, sino que también a otras áreas de la investigación biomédica donde se sabe que las respuestas de células T CD8 + para afectar el resultado de la enfermedad.

Análisis de Inmunodeficiencia CD8 Simian Virus-específica + Células T en macacos rhesus por el péptido-MHC-I de tetrámeros La tinción

Aquí, describimos un método que combina en situ MHC tetramer tinción con inmunohistoquímica para determinar localización, fenotipo y cantidad de antígenos específicos de células T en los tejidos. Este protocolo se utiliza para determinar las características espaciales y fenotípicas de las células de T CD8 específica de antígeno con respecto a otro tipo de célula y las estructuras de los tejidos.

In Situ La tinción de tetrámero de MHC y análisis cuantitativo para determinar la localización, abundancia y fenotipo de células de T CD8 específica de antígeno en los tejidos

Linfocitos T antígeno específicos son difíciles de caracterizar o utilizar en terapias debido a su extremadamente baja frecuencia. Aquí proporcionamos un protocolo para desarrollar una partícula magnética que puede atar a las células T antígeno específicas para enriquecer estas células y luego ampliarlas varias centenas para caracterización y tratamiento.

Enriquecer y ampliar las células T específicas de antígeno raro con nanopartículas magnéticas

Aquí, presentamos un protocolo para el ex vivo cualitativamente específica de antígeno CD8+ T las células. Análisis es posible con suspensiones de la célula de órganos o de pequeñas cantidades de sangre. Una amplia gama de estudios requieren el análisis de las respuestas de la célula de T citotóxica (vacunación y estudios de inmunoterapia del cáncer).

Cuantificación simultánea de CD8 anti-vector y Anti-transgénicos-específico+ T células vía MHC Tetramer tinción después de la vacunación con un Vector Viral

Aquí, presentamos un protocolo para la purificación de complejos peptídicos MHC clase I y clase II a partir de líneas celulares de ratón y humanos que proporcionan datos inmunopeptidómicos de alta calidad. El protocolo se centra en la preparación de muestras utilizando anticuerpos disponibles comercialmente.

Inmunopeptidomics: Aislamiento de péptidos asociados a MHC de clase I y II de ratón y humano para el análisis de espectrometría de masas

Proporcionamos un protocolo detallado para aislar e identificar poblaciones de células T específicas de antígenos raros en pulmones de ratón a través del enriquecimiento de células T basado en perlas magnéticas y tetrámeros del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) de péptidos.

Identificación de células T raras específicas de antígeno de pulmones de ratón con tetrámeros del complejo de histocompatibilidad peptídico:principal

Aprende a aislar células T específicas de epítopos raras usando tetrámeros de péptido:MHC y microesferas magnéticas en ratones. Este método permite estudiar poblaciones policlonales de células T endógenas mediante citometría de flujo.

Péptido: MHC tetrámero basado en el enriquecimiento de células T específicos para el epítopo

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