Trampas ópticas de las nanopartículas

El objetivo general de este procedimiento es crear un sistema de atrapamiento óptico por apertura para atrapar partículas de aproximadamente 20 nanómetros de tamaño. Para ello, se añade un detector a un sistema óptico de atrapamiento láser existente para permitir la medición. Luego, se dispensa la solución de nanopartículas que se va a medir en una cámara microfluídica con la trampa de doble orificio nanométrico, y la cámara se coloca en el sistema de atrapamiento óptico.

Cuando una partícula entra en la abertura iluminada, la transmisión de luz aumenta considerablemente debido a la carga dieléctrica. Si la partícula intenta salir de la abertura, la disminución de la transmisión provoca un cambio en el momento hacia fuera del orificio, y según la tercera ley de Newton, esto genera una fuerza que atrae a la partícula de vuelta hacia el interior del orificio, atrapándola. La partícula provoca un desplazamiento hacia el rojo de la curva de transmisión, lo cual puede ser monitoreado.

Por lo tanto, la trampa puede convertirse en un sensor. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren eventos de atrapamiento de nanopartículas, incluyendo la desnaturalización de proteínas atrapadas, indicada por cambios en la intensidad del láser a través del doble orificio nano. La ventaja principal de esta técnica frente a métodos existentes como el atrapamiento óptico por fuerza de gradiente es que puede atrapar nanopartículas más pequeñas con intensidades de láser más bajas.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en bioquímica, como ¿cómo se pliegan e interactúan las proteínas individuales?, y ¿cómo infectan las partículas virales las células vivas? En general, las personas que empleen este método tendrán dificultades porque es complicado integrar el doble orificio nana en un sistema de trampa láser existente. La configuración de la trampa óptica se basa en un kit de pinzas ópticas de Thor Lab, equipado con un módulo de medición de fuerza.

Un fotodiodo de avalancha se utiliza para reemplazar el detector cuadrante en el módulo de medición de fuerza. Al configurar el sistema de trampa óptica, se debe usar protección ocular siempre que el láser esté encendido. Asegúrese de que el haz permanezca dentro de un área segura operando en una habitación cerrada y confinando el haz dentro del montaje de la trampa tanto como sea posible; debe evitarse el uso de joyas reflectantes.

Se usan guantes de látex. Para garantizar la limpieza de la óptica, prepare el kit de pinzas ópticas y el módulo de medición de fuerza. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, el kit de pinzas ópticas ensamblado tiene un diseño de microscopio invertido y consta de los siguientes componentes: un láser de trampa, un objetivo de inmersión en aceite de 100 x, una plataforma de posicionamiento de muestra con tres ejes y una cámara CCD.

Tenga en cuenta que es recomendable la protección contra descargas electrostáticas al manipular los diodos láser. El módulo de medición de fuerza permite la calibración de las pinzas ópticas mediante la detección de la posición del plano focal posterior del condensador. Se utiliza un foto DDE de avalancha basado en silicio o un PD en lugar de los módulos de medición de fuerza.

El detector de posición cuadrante también inserta un filtro resistor-condensador o filtro RC utilizando una resistencia de 200 kiloohmios y un condensador de 100 picofaradios. Esto se utiliza para reducir el ruido de alta frecuencia y facilitar la visualización de eventos de atrapamiento en el osciloscopio. Utilice un cable coaxial para conectar el filtro RC después del APD. Luego, use cables coaxiales y un adaptador en T para conectar el osciloscopio y el módulo de adquisición de datos al filtro RC.

El sistema ya está listo para la carga de muestras. La abertura de doble nanoagujero está compuesta por dos nanoagujeros tallados en una película de oro mediante un haz de iones enfocado. La película tiene un espesor de 100 nanómetros y está soportada por un sustrato de vidrio.

Los nanoagujeros se superponen para producir dos puntas afiladas. Las nanopartículas quedarán atrapadas en el espacio entre estas puntas por la luz láser que incide sobre el doble nanoagujero.

Deben fresarse también grandes características de registro en la película metálica para ayudar a identificar la ubicación del doble nanoagujero en el microscopio óptico. Estas características deben colocarse a aproximadamente 100 micrones del doble nanoagujero. Vierta 10 gramos de poli(dimetilsiloxano) o base de PDMS y un gramo de agente de curado en un vaso desechable y mezcle durante unos minutos.

Luego, evacúe la mezcla en una cámara de vacío hasta que desaparezcan todas las burbujas. A continuación, vierta 1.5 gramos de PDMS en una placa de Petri de nueve centímetros de diámetro. Aplique recubrimiento por centrifugado del PDMS sobre el fondo de la placa de Petri a 950 RPM durante 65 segundos siguiendo el proceso de centrifugado.

El espesor no es crítico siempre que sea inferior a 80 micrones. Coloque suavemente de tres a cinco cubreobjetos número 1.5 sobre el PDMS de manera que no se superpongan y evacúe durante 30 minutos.

Si durante la evacuación los cubreobjetos se movieron y quedaron apilados uno encima del otro, sepárelos suavemente. Asegúrese de mantener la capa de PDMS debajo de los cubreobjetos delgada y uniforme. Luego, evacúe nuevamente la placa de Petri durante 30 minutos.

Retire la placa de Petri de la cámara de vacío y caliéntela en una placa calefactora durante 20 minutos a 85 grados Celsius para curar el PDMS. Una vez que el PDMS esté solidificado, utilice una cuchilla para cortar a lo largo de los bordes de uno de los cubreobjetos. Luego, con pinzas de punta fina o una cuchilla, levante suavemente el cubreobjeto; una capa delgada de PDMS adherirá al cubreobjeto.

Coloque la cubeta de vidrio con PDMS en una nueva placa de Petri. Luego, utilizando una cuchilla de afeitar, corte una ventana de tres milímetros por tres milímetros en el PDMS. Esta ventana formará la cámara donde se mantendrá la solución de nanopartículas.

Utilice un cortador láser para fabricar un soporte de portaobjetos de acrílico con un orificio de tres cuartos de pulgada de diámetro en el centro. Aplique cinta de doble cara alrededor del perímetro del orificio. Utilice una cuchilla para eliminar cualquier exceso de cinta.

Coloque el portaobjetos fabricado sobre uno de los cubreobjetos recubiertos con PDMS preparados, de modo que el PDMS quede atrapado entre el vidrio y el acrílico. Utilizando una pipeta micrométrica, agregue unas gotas de solución de nanoesferas de poliestireno al 0,05 % peso por volumen en la ventana de PDMS.

Agregue una gota sobre la película de oro donde se encuentran los orificios nano. Coloque la muestra de oro encima de las cubreobjetos con los orificios nano dentro de la ventana de PDMS. Asegúrese de que no haya burbujas presentes en la cámara.

Luego presione la muestra dorada contra la cubierta. Retire y seque cualquier solución excesiva, ya que se utilizará un objetivo de inmersión en aceite. Añada una gota de aceite en el otro lado de la cubierta, encima de la ventana de PDMS.

Tenga en cuenta la ubicación de los nanoagujeros. Inserte el microscopio. Deslice la preparación en el portaobjetos con el aceite hacia abajo, y luego baje el portaobjetos hasta que el aceite de inmersión haga contacto con el microscopio.

Como objetivo, alinee aproximadamente la platina del portaobjetos de manera que las marcas de registro mecanizadas en la película de oro queden debajo del objetivo. Utilizando un software de adquisición de imágenes como Thor site, que se incluye como parte del kit de atrapamiento, localice las marcas de registro en la película de oro y siga las líneas indicadoras hacia arriba hasta los nanorricos.

Coloque el portaobjetos de manera que las marcas indicadoras y otras áreas abiertas queden fuera del centro de la pantalla. La transmisión excesiva de luz puede dañar un PD al activar el láser. Dado que el espejo dicróico no es perfecto, debería aparecer un punto cerca del centro de la pantalla proveniente del haz láser.

Utilizando el software de control del estadio pizo. Afinar aún más el alineamiento en los tres ejes. Cuando el alineamiento sea correcto, se observará un voltaje máximo en el PD, lo que indica la máxima transmisión a través de la nanoabertura.

Ahora que el sistema está configurado y la muestra cargada, se pueden adquirir datos de atrapamiento óptico. Con la ayuda de las marcas indicadoras, coloque el punto cerca de una ubicación conocida de un nanoagujero. Los dobles nanoagujeros serán demasiado pequeños para resolverse con claridad y aparecerán como pequeños puntos en la pantalla.

La transmisión de luz a través de la muestra se indica mediante el nivel de la señal en el osciloscopio. Alinee aún más la muestra para maximizar la transmisión de luz. Tenga cuidado con las marcas indicadoras y con rayones visibles e invisibles, ya que la transmisión de luz será alta en estas áreas; los nanoagujeros mostrarán saltos bruscos en la transmisión de luz, a diferencia de los rayones.

Exhiba cambios más graduales utilizando la placa de onda. Ajuste la polarización de la luz para lograr la máxima transmisión de luz cuando la estructura de doble nanoagujero esté polarizada. Para adquirir datos, muestree el voltaje de los APD utilizando el módulo de adquisición de datos durante el tiempo deseado.

Los tiempos de adquisición suelen estar en el orden de cientos de segundos. En este caso, se utiliza un software personalizado para la adquisición de datos y el voltaje se muestrea 2000 veces por segundo. Mediante MATLAB, filtre los datos adquiridos utilizando un filtro KY Gole y represéntelos gráficamente en función del tiempo para mostrar el atrapamiento de nanopartículas de poliestireno de 20 nanómetros; la transmisión a través del doble orificio nano fue medida como función del tiempo.

Utilizando la transmisión óptica de un PD, se trazó entonces. Con el tiempo, el evento de atrapamiento es característicamente repentino, con un borde definido que muestra un cambio claro entre dos niveles de potencia de transmisión, como se observa en este ejemplo; frecuentemente hay un aumento en el ruido de la señal en el estado atrapado. Este incremento de ruido proviene del movimiento browniano de la partícula atrapada.

Téngase en cuenta que sin la partícula atrapada, esta fuente de ruido no está presente. Pueden aparecer algunos artefactos en los resultados que no indican eventos de atrapamiento. Deben descartarse los resultados que muestran deriva, observada como cambios lentos en la transmisión durante un período de minutos, como se muestra aquí. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la espectroscopía Raman y la espectroscopía de fluorescencia, para responder preguntas adicionales sobre la naturaleza de la nanopartícula atrapada tras su desarrollo.

Esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores estudien nanopartículas biológicamente relevantes a nivel de molécula individual. Por ejemplo, para detectar la unión de proteínas y para estudiar la infección viral, ambos a nivel de molécula individual. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo integrar una trampa óptica doble nho en un sistema láser de microscopio invertido para atrapar nanopartículas individuales.