Name: Cuantitativo FRET (transferencia de energía de resonancia de Förster) Análisis para SENP1 Proteasa Determinación Kinetics (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 2 s
Description: Aprende a analizar la cinética de la proteasa SENP1 mediante un ensayo FRET cuantitativo de un solo paso. Este método permite determinar parámetros cinéticos como KM y kcat en tiempo real con alta precisión.

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Estamos muy agradecidos a Victor GJ Rodgers por sus valiosos consejos. Agradecemos a todos los miembros del grupo Liao para el trabajo en colaboración muy estrecha y ayuda con este estudio. Este estudio fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (Grant AI076504 a JL).

1. Construcciones de plásmidos <ol><li> Amplificar los marcos de lectura abiertos de los genes por PCR, y clonar los productos de PCR en pCRII-TOPO vector. </li><li> Confirmar los productos mediante secuenciación, y clonar el ADNc que codifica CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet SUMO1-, YPet y dominios catalíticos de SENP1 en la pET28 (b) vector con una etiqueta de hexahistidina N-terminal. </li></ol> 2. Expresión y purificación de proteínas <ol><li> Transformar células de Escherichia coli de la cepa BL21 (DE3) con pET28 (b) vectores que codifican CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet SUMO1-, YPet y los dominios catalíticos de SENP1. </li><li> Crecido las bacterias transformadas en medio 2xYT durante 3 horas a 37 ° C (con agitación a 250 rpm) hasta alcanzar una densidad óptica de 0,5 a 600 nm. </li><li> Añadir 100 mM isopropil-β-D-tiogalactósido (IPTG) (concentración final) para inducir la expresión de la proteína y agitar durante 16 horas a 25 ° C a 200 rpm. </li><li> Coseche las bacterias por centrifugación a 10.000 rpm a 4 ° C durante 5 min y se resuspenden en un tampón de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 50 mM, y 5 mM de imidazol. </li><li> Sonicar las células durante 10 min en 5-sec intervalos a una potencia de 25 W utilizando MiSonics 4.000 sonicador y recogerlas por centrifugación a 35.000 xg a 4 ° C durante 30 min. </li><li> Configurar la columna con 500 ml de Ni-NTA perlas para el cultivo de L 1 y transferir el sobrenadante a la columna. </li><li> La resina se lava con tampón de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 500 mM, y 10 mM imidazol dos veces. </li><li> Proteína se eluye con tampón de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 500 mM, y 500 mM de imidazol y la diálisis en un tampón de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 50 mM y 1 mM de ditiotreitol (DTT) a 4 ° C durante la noche. </li><li> Determinar las concentraciones de las proteínas purificadas mediante el ensayo de Bradford. Método alternativo para las mediciones de concentración de proteínas será SDS-PAGE electroforesis en gel y después se tiñeron con azul de Coomassie seguido con imágenescuantitativo. </li></ol> 3. Cuantitativo FRET análisis de espectro <ol><li> La estrategia general para el ensayo FRET se basa en la señalización (Figura 1). El par de FRET, CyPet y YPet, fue etiquetada para la N-y C-terminales, respectivamente, de pre-SUMO1. SENP1 escinde la proteína de fusión CyPet-(pre-SUMO1)-YPet en el lugar de Gly-Gly en SUMO1 del C-terminal y, por lo tanto, libera la cola con SUMO YPet. La señal de FRET se interrumpe, lo que resulta en un aumento de la emisión de CyPet y una dramática disminución de la emisión de YPet en la longitud de onda de excitación CyPet. </li><li> Cuando es excitado por la luz de longitud de onda de 414 nm, la emisión total de fluorescencia de CyPet-(pre-SUMO1)-YPet a 530 nm se puede derivar de tres fuentes: la emisión del absoluto FRET inducida YPet, el CyPet directa de emisiones y YPet directa de emisiones (Figura 2). </li></ol><img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq1.jpg" /> donde FL 530/414 &lt;/ Sub&gt; es el total de las emisiones de fluorescencia a 530 nm cuando se excita a 414 nm, FL FRET es el absoluto señal de FRET, FL CyPet (cont) es la emisión CyPet directa cuando se excita a 414 nm, y FL YPet (cont) es la YPet directas de las emisiones cuando se excita a 414 nm. El subíndice de (cont) representa la contribución. <ol start="3"><li> La emisión directa de CyPet a 530 nm era proporcional a su emisión a 475 nm cuando se excita a 414 nm con una relación constante de α. CyPet-SUMO1 se preparó a concentraciones de 50, 100, 200, 500, y 750 nM y 1 mM y las emisiones a 475 y 530 nm se midió después de excitación a 414 nm para determinar α (Figura 3-1). </li><li> La emisión directa de YPet a 530 nm con excitación a 414 nm era proporcional a su emisión a 530 nm cuando se excita a 475 nm con una relación constante de β. YPet se preparó a concentraciones de 50, 100, 200, 500, 750 and 1.000 nm, y la emisión a 530 nm se midió cuando las muestras fueron excitados por longitudes de onda de 414 y 475 nm para determinar β (Figura 3-2). </li><li> Cuando CyPet-(pre-SUMO1)-YPet fue digerido por SENP1, la escisión libera CyPet-SUMO1 y la cola SUMO1 con YPet. Cuando el compuesto se excita a 414 nm, la emisión de fluorescencia a 530 nm (FL &#39;530/414) se redujo, pero aún se pueden dividir en tres partes como: </li></ol><img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq2.jpg" /> donde FL &#39;530/414 es la emisión total de fluorescencia a 530 nm después de la digestión cuando se excita a 414 nm, FL&#39; FRET es el restante absoluto señal de FRET, CyPet FL &#39;(475/414) es la emisión CyPet a 475 nm después de la digestión cuando excita a 414 nm (en este caso la emisión CyPet es de dos partes: sin digerir CyPet-(pre-SUMO1)-YPet y digerido CyPet-SUMO1), y YPet FL(530/475) es la emisión YPet cuando se excita a 475 nm, que es constante si CyPet-(pre-SUMO1)-YPet se digiere o no. <ol start="6"><li> Después de la digestión por SENP1, el restante FRET emisión (FL-FRET) es: </li></ol><img alt="Ecuación 3" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq3.jpg" /> donde C es la concentración total de CyPet-(pre-SUMO1)-YPet y x es la concentración de digerido CyPet-(pre-SUMO1)-YPet. <ol start="7"><li> Mediante la combinación de todos los elementos, la emisión de fluorescencia detectada a 530 nm bajo excitación de 414 nm (530 FL &#39;/ 414) es: </li></ol><img alt="Ecuación 4" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq4.jpg" /> 4. FRET basada en el Ensayo de la Proteasa Estudio de cinética enzimática <ol><li> CyPet-(pre-SUMO1)-YPet se incubó con el dominio catalítico de SENP1 a 37 ° C en un tampón de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 0,1% (v /v) de Tween-20 y 1 mM de DTT a un volumen total de 80 ml y se transfirió a 384-así placa. </li><li> Carreras se llevaron a cabo mediante la medición de la emisión de fluorescencia a 475 y 530 nm después de una excitación a 414 nm en un lector de placas de fluorescencia de múltiples pocillos durante 5 min con 15-sec intervalos. </li><li> La velocidad de reacción (v) se correlacionó con el cambio en la cantidad de sustrato (S) como: </li></ol><img alt="Ecuación 5" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq5.jpg" /><ol start="4"><li> La concentración de producto aumentado exponencialmente desde 0 como [S] 0 (concentración de sustrato original) cuando t = 0: </li></ol><img alt="Ecuación 6" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq6.jpg" /><ol start="5"><li> Cuando t = 0, la velocidad inicial (V 0) es: </li></ol><img alt="Ecuación 7" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq7.jpg" /><ol start="6"><li> La concentration de SENP1 se fijó, y la concentración de CyPet-(pre-SUMO1)-YPet se aumentó de 100 veces más que la concentración de la enzima, que es requerido por la ecuación de Michaelis-Menten. </li><li> Todas las lecturas fluorescentes fueron analizadas por el método de análisis cuantitativo FRET y se representan en GraphPad Prism Software V para adaptarse a la ecuación de Michaelis-Menten. La regresión no lineal también se puede realizar con la ayuda de paquetes de software más comunes, como los programas de hojas de cálculo (por ejemplo, Microsoft Excel). </li></ol> 5. Los resultados representativos La maduración de pre-SUMO1 por SENP1 puede determinarse controlando los cambios en la señal de fluorescencia a 475 y 530 nm durante el proceso. El resultado mostró que la velocidad de la pre-SUMO1 digestión por SENP1 en una manera dependiente de la dosis-sustrato (Figura 4). Esto sugiere que el dominio catalítico de SENP1 exhibe una excelente actividad para la maduración de los pre-SUMO1. La reacción inicialvelocidades ción se calcularon por el análisis anterior con diferentes concentraciones de sustrato (Tabla 1). El k cat / K M se utiliza generalmente para comparar las eficiencias de los diferentes enzimas con un sustrato o una enzima en particular con diferentes sustratos. K M y V max se puede obtener de la ecuación de Michaelis-Menten por el trazado de las diversas velocidades iniciales, correspondientes a las diferentes concentraciones de CyPet-(pre-SUMO1)-YPet (Figura 5) k gato se obtuvo en forma.: <img alt="Ecuación 8" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq8.jpg" /> De acuerdo con el análisis anterior, se calculó un K M fue de 0,21 ± 0,04 mM, el gato k fue 6,90 ± 0,28 s -1, y la k cat / K M proporción fue de (3,2 ± 0,55) x 10 7 M -1 </sup<html> &gt; S -1. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig1.jpg" /> Figura 1. Gráfico de ensayo de la proteasa FRET basado en un pre-sumos SENP de maduración. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig2.jpg" /> Figura 2. Análisis cuantitativo de la señal fluorescente como contribuciones por el donante, aceptor y FRET. La disección de los espectros de emisión de CyPet-(pre-SUMO1)-YPet bajo excitación a 414 nm. CyPet FL (530/414) Se emisión CyPet de a 530 nm bajo excitación de 414 nm, FL FRET es la emisión FRET inducida YPet a 530 nm bajo excitación de 414 nm, y FL YPet (530/414) es la emisión YPet de a 530 nm bajo excitación de 414 nm. load/4430/4430fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Cálculo del factor de α y β dirección de emisión. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig4.jpg" /> Figura 4. Análisis cuantitativo de CyPet-(pre-SUMO1)-YPet digerido por diferentes proporciones de al dominio catalítico de SENP1. Las reacciones se controlaron dentro de los primeros 5 min. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig5.jpg" /> Figura 5. Michaelis-Menten análisis gráfico de digestión CyPet-(pre-SUMO1)-YPet de por SENP1. Los datos se representaron gráficamente y se analizaron por GraphPad Prism V y regresión no lineal. <table border="1"><tbody><tr><td> [S] (mM) </td><td> V 0 (mM / s) </td></tr><tr><td> 0,115 </td><td> 0,0023 ± 0,00005 </td></tr&gt; <tr><td> 0,214 </td><td> 0,0028 ± 0,00004 </td></tr><tr><td> 0,407 </td><td> 0,0033 ± 0,00007 </td></tr><tr><td> 0,594 </td><td> 0,0037 ± 0,00013 </td></tr><tr><td> 0,725 </td><td> 0,0043 ± 0,00012 </td></tr><tr><td> 1,471 </td><td> 0,0051 ± 0,00036 </td></tr><tr><td> 1,899 </td><td> 0,0050 ± 0,00031 </td></tr><tr><td> 2,300 </td><td> 0,0050 ± 0,00062 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Determinación de las velocidades iniciales de la maduración de los pre-SUMO1 por SENP1. En cada concentración de sustrato, cuatro muestras se utilizaron para medir la digestión. La desviación estándar de vino de las variaciones de estas cuatro muestras. <table border="1"><tbody><tr><td> K M (M) </td><td> k cat (s-1) </td><td> k cat / K M (M -1 s •-1) </td></tr><tr><td> 0,21 ± 0,04 </td><td> 6,90 ± 0,28 </td><td> 3,2 ± 0,55 × 10 7 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Parámetros cinéticos de la maduración del pre-SUMO1 por SENP1 cuantitativos de análisis FRET. La desviación estándar de vino de las cuatro muestras en cada concentración de sustrato.

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<li>Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+and+ubiquitin+in+the+nucleus%3A+different+functions%2C+similar+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms.</a> Genes & Development. 18, 2046-2059 (2004).</li>
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<li>Mikolajczyk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+Ubiquitin-related+Modifier+%28SUMO%29-specific+Proteases%3A+PROFILING+THE+SPECIFICITIES+AND+ACTIVITIES+OF+HUMAN+SENPs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-specific Proteases: PROFILING THE SPECIFICITIES AND ACTIVITIES OF HUMAN SENPs.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 26217-26224 (2007).</li>
<li>Kolli, N., Mikolajczyk, J., Drag, M., Mukhopadhyay, D., Moffatt, N., Dasso, M., Salvesen, G., Wilkinson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distrubition+and+paralogue+specificity+of+mammalian+deSUMOylating+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Distrubition and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes.</a> Biochem. J. , 335-344 (2010).</li>
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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Tecnología FRET ha sido utilizada para estudiar la maduración pre-SUMO1 de por SENP1 9. CFP-YFP se utilizó como el par de FRET y el análisis radiométrico, que es la relación de aceptor a las emisiones de los donantes, se utilizó para caracterizar las propiedades cinéticas. Sin embargo, no existe ninguna consideración de donante y aceptor de auto-fluorescencia en la ratiométrica tradicional análisis FRET. La relación no se correlacionan directamente con la cantidad de sustrato digerido. <p class="jove_cont...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> PCR II TOPO Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K466040 </td></tr><tr><td> 2xYT </td><td> Investigación de Productos Internationa.l Corp. </td><td> X15600 </td></tr><tr><td> Ni-NTA agarosa </td><td> Thermo Scientific </td><td> 88222 </td></tr><tr><td> Más Coomassie (Bradford) Regent Ensayo </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23238 </td></tr><tr><td> 384-así placa (con fondo de cristal) </td><td> Greiner </td><td> 781892 </td></tr><tr><td> FlexStation II 384 lector de placas </td><td> Dispositivo Molecular </td><td></td></tr></tbody></table>

cuantitativo fret (transferencia de energía de resonancia de förster) análisis para senp1 proteasa determinación kinetics

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Reversibles modificaciones postraduccionales de proteínas con proteínas de ubiquitina o ubiquitina como-(Ubls) son ampliamente utilizados para regular dinámicamente actividad de la proteína y tiene diversas funciones en muchos procesos biológicos. Por ejemplo, SUMO modifica covalentemente un gran número o proteínas con papeles importantes en muchos procesos celulares, incluyendo la regulación del ciclo celular, la supervivencia celular y la muerte, la respuesta de daño del ADN, y la respuesta de estrés 1-5. SENP, como SUMO-proteasa específica, funciona como una endopeptidasa en la maduración de los precursores SUMO o como un isopeptidase para eliminar SUMO de sus proteínas diana y refrescar el ciclo SUMOylation 1,3,6,7. La eficiencia catalítica o la especificidad de una enzima se caracteriza mejor por la relación de las constantes cinéticas, k cat / K M. En varios estudios, los parámetros cinéticos de SUMO-SENP pares han sido determinados por varios métodos, incluyendo en gel de poliacrilamida basado en western-blot, radIOActive sustrato marcado, compuesto fluorescente o proteína sustrato marcado 8-13. Sin embargo, las técnicas de poliacrilamida-gel a base, que utilizaron los &quot;nativos&quot; de proteínas, pero son laboriosos y técnicamente exigente, que no se prestan a un análisis cuantitativo detallado. La obtenido k cat / K M de estudios usando tetrapéptidos o proteínas con un ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) o AMC (7-amino-4-metilcumarina) fluoróforo eran o bien hasta dos órdenes de magnitud menor que los sustratos naturales o no puede diferenciar claramente las iso-y las actividades de endopeptidasa SENPs. Ensayos de la proteasa Recientemente, basados ​​en FRET se utilizan para estudiar las enzimas deubiquitinating (DUBs) o SENPs con el par de FRET cian proteína fluorescente (PPC) y la proteína amarilla fluorescente (YFP) 9,10,14,15. La relación de emisión de aceptor de emisión del donante se utiliza como el parámetro cuantitativo para FRET monitor de señal de proteasa acdad determinación. Sin embargo, este método ignora la señal contaminaciones cruzadas en el aceptor y longitudes de onda de emisión por donantes aceptor y donante de auto-fluorescencia y por lo tanto no era correcta. Hemos desarrollado un novedoso altamente sensible y cuantitativo FRET basada en el ensayo de la proteasa para la determinación de los parámetros cinéticos de pre-SUMO1 maduración por SENP1. Un par de ingeniería FRET CyPet y YPet con mejorado significativamente la eficiencia de FRET y rendimiento cuántico de fluorescencia, se usaron para generar el CyPet-(pre-SUMO1)-YPet sustrato 16. Hemos diferenciado y cuantificados absolutos señales de fluorescencia aportados por el donante y el aceptor y FRET en las longitudes de onda de emisión de aceptor y, respectivamente. El valor de k cat / K M se obtuvo como (3,2 ± 0,55) x 10 7 M -1 s -1 de SENP1 hacia pre-SUMO1, que está de acuerdo con los parámetros generales de cinéticas enzimáticas. Por lo tanto, esta metodología es válida y se puede utilizar unsa Enfoque general para caracterizar otras proteasas también.

Un nuevo método que implica el análisis cuantitativo de FRET (transferencia de energía por resonancia de Förster) señales se describe para el estudio de la cinética de enzimas.<em&gt; K<sub&gt; M</sub</em&gt; Y<em&gt; K<sub&gt; Cat</sub</em&gt; Fueron obtenidos para la hidrólisis del dominio catalítico de SENP1 (SUMO / sentrin proteasa específica 1) para pre-SUMO1 (Small ubiquitina-como modificador). Los principios generales de este estudio cuantitativo proteasa-FRET basada cinética se puede aplicar a otras proteasas.

Cuantitativo FRET (transferencia de energía de resonancia de Förster) Análisis para SENP1 Proteasa Determinación Kinetics

Las modificaciones postraduccionales reversibles de las proteínas con ubiquitina o proteínas similares a la ubiquitina (Ubl) se utilizan ampliamente para regular dinámicamente la proteína...

Este video demuestra un novedoso ensayo de transferencia de energía por resonancia de tipo fret en un solo paso para el análisis cuantitativo de la cinética de proteasas. La estrategia general para el siguiente ensayo se basa en el análisis de la señal de fret. Aquí, el par de fret, cype y ype, se une a los extremos N y C del pre sumo uno en el sustrato intacto, y cype y ype se encuentran en proximidad cercana.Cuando esta molécula se excita a 414 nanómetros, la mayor parte de la señal de emisión se encuentra a 530 nanómetros. Sin embargo, cuando se añade la proteasa SENP1, el sustrato se escinde en el residuo Gly-Gly del extremo C-terminal de SUMO1, separando así CIPA y WPA. Ahora, al excitar a 414 nanómetros, la mayor parte de la señal de emisión observada se encuentra a 475 nanómetros.Para evaluar la cinética de esta reacción, las emisiones de fluorescencia se determinan cada 15 segundos durante un período de cinco minutos. El análisis de los datos de fluorescencia resultantes revela la velocidad a la que el sustrato cype pre sumo one ype es digerido por la proteasa SENP one. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como un ensayo de masa con un sustrato peptídico fluorescente, un análisis radiométrico o una transferencia western, es que esta técnica puede determinar el parámetro cinético en tiempo real en un único ensayo en tiempo real.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia y el diagnóstico de enfermedades relacionadas con proteínas, como los cánceres y las enfermedades metabólicas. Dado que esta técnica puede proporcionar ensayos precisos y de alto rendimiento para diversas proteínas, así como para el descubrimiento de sus inhibidores y caracterizaciones, el procedimiento demostrativo lo realizará un estudiante de doctorado de ENUA de mi laboratorio, quien fue la primera persona en desarrollar este método y procedimiento. Comience este procedimiento amplificando mediante PCR los marcos de lectura abierta de Cype ype pre sumo uno, sumo uno madura y el dominio catalítico de SENP uno.Clonee los productos resultantes en un vector topo de PCR dos. A continuación, confirme que las secuencias de los genes son correctas mediante secuenciación. Luego, clone el ADNc que codifica CYPE pre sumo uno ype CYPE SUMO, uno ype y el dominio catalítico de SENP uno en el vector PET 28 B con una etiqueta polihistidina en el extremo N.Después de que los genes hayan sido clonados en el vector, transfiéralos a Esia coli, BBL 21 DE tres mediante electrotransformación. Después de sembrar las bacterias transformadas en medio sólido, seleccione colonias aisladas y cúltívelas durante la noche. A continuación, inocule matraces de dos litros de medio dos XYT con las bacterias transformadas en una proporción de uno a 100.Incube los cultivos durante tres horas a 37 grados Celsius, agitando a 250 RPM para alcanzar una densidad óptica de 0,5 a 600 nanómetros. Para inducir la expresión de proteínas, agregue IPTG hasta una concentración final de 100 micromolar y agite durante 16 horas a 25 grados Celsius a 200 RPM. A continuación, transfiera las bacterias a botellas de centrífuga de 250 mililitros.Luego, recoger las bacterias mediante centrifugación a 8.000 G a cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Tras la centrifugación, deseche el sobrenadante y re suspenda las células bacterianas en un tampón de lisis de tris HCl, cloruro de sodio y ole, y transfiera los cultivos a tubos cónicos de 50 mililitros. A continuación, someta las células a sonicación con una amplitud del 70 % durante 10 minutos a intervalos de cinco segundos para romper las células bacterianas.Luego, para separar las proteínas de fusión de los restos celulares, centrifugue los tubos a 35.000 RCF a cuatro grados Celsius durante 30 minutos. Durante la centrifugación, prepare una columna BioRad de 10 mililitros con 500 microlitros de perlas de níquel NTI por cada litro de células cultivadas. Deje que la solución gotee desde la columna tras la centrifugación.Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. Vierta la solución de sobrenadante en la columna. Una vez que todo el sobrenadante haya entrado en la resina, lave la columna dos veces con 10 mililitros de un tampón de clorhidrato de tris cloruro de sodio.Para eluir, agregue 500 microlitros del mismo tampón, esta vez conteniendo 500 milimolar de ole. Recolecte el flujo en un tubo de microcentrífuga.A continuación, transfiera la solución a una membrana de diálisis con un corte molecular de 10 kilodaltons y diализar la muestra durante la noche en un litro de tampón que contiene 20 milimolar tris, 50 milimolar cloruro de sodio y 1 milimolar DTT a cuatro grados Celsius. Tras la diálisis, transfiera las proteínas purificadas a un tubo de microcentrífuga y determine las concentraciones de las proteínas purificadas mediante el ensayo de Bradford. A continuación, se utilizan las proteínas purificadas para evaluar la velocidad a la que pre sumo uno es escindida por SENP uno usando un ensayo fret cuantitativo.En tubos de microcentrífuga, prepare 60 mililitros de Spet Sumo uno y YA a concentraciones de 5100, 200 500, 750 y 1000 nanomolar. Estas muestras control se utilizarán para caracterizar la relación constante de emisión directa de cype y YA en el mismo tampón. Prepare cype pre sumo uno y PET en 12 concentraciones que varían desde 0,03 micromolar hasta 0,9 micromolar y una dilución de 0,3 nanomolar del dominio catalítico de SENP uno.Configure el lector de placas multipozo con fluorescencia para medir la emisión fluorescente a 475 y 530 nanómetros tras una excitación a 414 nanómetros y la emisión a 530 nanómetros tras una excitación a 475 nanómetros, con intervalos de 32 segundos durante dos minutos a 37 grados Celsius. Para obtener la autofluorescencia de la placa, coloque una placa de 384 pozos vacía en el fluorímetro y realice las mediciones. Una vez determinada la autofluorescencia de la placa, ajuste los parámetros del fluorímetro de modo que, para Cype Sumo, una excitación sea a 414 nanómetros y las mediciones se tomen a 475 y 530 nanómetros, y para ype, la excitación sea a 414 y 475 nanómetros y las mediciones se realicen a 530 nanómetros.A continuación, agregue 75 microlitros de cype Sumo uno ype o cype sumo uno ype a los pozos correspondientes de la placa de 384 pozos en triplicado, como se muestra en este diagrama. Luego, agregue cinco microlitros de SENP uno preparado a cada pozo, llevando el volumen final a 80 microlitros; coloque inmediatamente la placa en el fluorímetro y comience las mediciones de fluorescencia siguiendo el ensayo. Analice las lecturas de fluorescencia utilizando el método cuantitativo de análisis FRET demostrado en la siguiente sección.La idea general de esta tecnología consiste en correlacionar la señal de transferencia absoluta con la digestión. ¿Desea obtener la señal de transferencia absoluta? Debemos excluir las contribuciones directas del donador y del aceptor a partir de la emisión fluorescente total a las longitudes de onda de emisión del aceptor.Las contribuciones directas del donador y del aceptor se calculan a partir de los factores del coeficiente de correlación alfa y beta del donador y de los aceptores, respectivamente. En esta sección del video se detallará cómo se realizan los cálculos. Para analizar la cinética de la digestión del sustrato por SENP1, utilice el software GraphPad Prism 5; comience abriendo el archivo txt exportado en Excel después de restar la fluorescencia de fondo de la placa.La concentración del sustrato digerido en diferentes puntos de tiempo se calcula mediante formulaciones PrepU cuando se excitan con luz de longitud de onda de 414 nanómetros; la emisión de fluorescencia total de spet pre sumo one ype a 530 nanómetros puede derivarse de tres fuentes: la emisión absoluta de Y pets inducida por FRET, la emisión directa de cype y la emisión directa de wpe. En esta ecuación, FL cinco 30 barra diagonal cuatro 14 es la emisión de fluorescencia total a 530 nanómetros cuando se excita a 414 nanómetros, y FL fret es la señal absoluta de FRET.FL Spet Con es la emisión directa de Spet. Cuando se excita a 414 nanómetros y FL Ype Con es la emisión directa de Ype. Cuando se excita a 414 nanómetros, la emisión directa de spet a 530 nanómetros es proporcional a su emisión a 475 nanómetros.Cuando se excita a 414 nanómetros con una relación constante de alfa, la emisión directa de YA a 530 nanómetros bajo excitación a 414 nanómetros es proporcional a su emisión a 530 nanómetros. Cuando se excita a 475 nanómetros con una relación constante de beta, cuando spet pre sumo uno ype es digerido por SENP uno y se excita a 414 nanómetros. La emisión fluorescente a 530 nanómetros disminuye, pero aún puede dividirse en tres partes como se indica aquí.FL Prime cinco 30 entre cuatro 14 es la emisión total de fluorescencia a 530 nanómetros tras la digestión. Cuando se excita a 414, FL Prime fret es la señal absoluta restante de FRET y FL prime SPET 4 75 entre cuatro 14 es la emisión SPET a 475 nanómetros tras la digestión cuando se excita a 414 nanómetros. La emisión proviene de dos partes: cype no digerida, pre sumo, una ype, y cype Sumo una digerida.Un FL Y PET cinco 30 barra 4 75 es la emisión de tipo ype cuando se excita a 475 nanómetros, la cual es constante independientemente de si cype pre sumo uno ype es digerido o no tras la digestión por SENP uno. La emisión restante de FRET se muestra en esta ecuación, donde C es la concentración total de cype pre sumo uno ype, y X es la concentración de cype pre sumo uno YA digerido. Al combinar todos los elementos, la emisión de fluorescencia detectada a 530 nanómetros bajo excitación a 414 nanómetros se describe mediante esta ecuación para el ensayo de proteasa basado en FRET destinado al estudio cinético enzimático, en el cual la velocidad de reacción se correlaciona con el cambio en la cantidad de sustrato a medida que la concentración de producto aumenta exponencialmente desde cero.Cuando T es igual a cero, como se observa aquí, S subcero indica la concentración original de sustrato cuando T es igual a cero. La velocidad original es la maduración del pre-sumo uno por SENP.Se puede determinar mediante el seguimiento de los cambios en la señal fluorescente a 475 y 530 nanómetros durante el proceso. Como se muestra aquí, la velocidad de maduración de pre sumo uno fue dependiente de la concentración del sustrato, lo que sugiere que el dominio catalítico de SENP uno presenta una excelente actividad para la maduración de pre sumo uno. Las velocidades iniciales de reacción se calcularon utilizando el mismo análisis con diferentes concentraciones de sustrato.La relación entre KCAT y KM se utiliza generalmente para comparar las eficiencias de diferentes enzimas con un sustrato o de una enzima particular con distintos sustratos. KM y Vmax pueden obtenerse a partir de la ecuación de McKayla Cementin mediante la representación gráfica de las distintas velocidades iniciales correspondientes a las diferentes concentraciones de cype. Se obtuvo la kcat de YA utilizando esta ecuación.Según el análisis anterior, la KM calculada fue de 0,21 ± 0,4 micromolar. La kcat fue de 6,90 ± 0,28 por segundo, y la relación kcat/KM fue de 3,2 ± 0,55 × 10⁷ por molar. En segundo lugar, después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar el parámetro de actividad proteasa mediante un ensayo cuantitativo novedoso basado en grasas, en una sola medición en tiempo real siguiendo este procedimiento.Otro método, como la inhibición por producto o la caracterización de inhibidores, puede realizarse para responder preguntas adicionales, como la KM aparente real o la K del inhibidor. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las proteínas exploraran la genética precisa, el entendimiento de las proteínas involucradas en procesos fisiológicos y patológicos en sensores ópticos, así como el diagnóstico inmediato y el descubrimiento de fármacos.

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Bioingeniería

Este video describe el ensayo de transferencia de energía de resonancia de Förster o TR-FRET resuelto en el tiempo para determinar la fosforilación de proteínas endógenas con la ayuda de fluoróforos donantes y aceptores marcados en anticuerpos específicos para una proteína de prueba. Esta técnica está diseñada para medir la fosforilación de las proteínas de prueba en los lisados celulares.

Transferencia de energía de resonancia de Forster resuelta en el tiempo para monitorear la fosforilación de proteínas en células

Se describe aquí un método mejorado de transferencia de energía de resonancia de luminiscencia (LRET) donde se introduce un sitio de escisión de la proteasa entre los sitios de fluoróforo donante y receptor. Esta modificación nos permite obtener señales LRET específicas derivadas de proteínas de la membrana de interés, lo que permite el estudio de las proteínas de membrana sin la purificación de proteínas.

La luminiscencia de energía de resonancia de transferencia para estudiar cambios conformacionales en proteínas de membrana expresado en células de mamífero

Recientemente se han desarrollado varios biosensores de fuerza basados en FRET, que permiten la resolución de la fuerza intracelular específica de la proteína. En este protocolo, demostramos cómo uno de estos sensores, diseñado para el enlazador de la proteína del complejo nucleoesqueleto-citoesqueleto (LINC) Nesprin-2G, se puede utilizar para medir las fuerzas de actomiosina en el complejo nuclear LINC.

Un protocolo para el uso de Transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) y forzar Biosensores para medir fuerzas mecánicas en todo el complejo nuclear de LINC

Aquí se presenta un protocolo para experimentos FRET de alta precisión en el nivel de una sola molécula. Además, esta metodología puede usarse para identificar tres estados conformacionales en el dominio de unión al ligando del receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA). Determinar las distancias exactas es el primer paso hacia la construcción de modelos estructurales basados ​​en experimentos FRET.

FRET de alta precisión a nivel de molécula única para la determinación de estructuras de biomoléculas

Las interacciones proteína-proteína son críticas para los sistemas biológicos, y estudios de la cinética de Unión proporcionan penetraciones en la dinámica y función de complejos de la proteína. Se describe un método que cuantifica los parámetros cinéticos de una proteína compleja mediante la transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia y la técnica de flujo detenido.

Uso en transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia de Vitro para el estudio de la dinámica de los complejos de la proteína en una escala de tiempo de milisegundos

Los protocolos aquí descritos proporcionan una guía para visualizar y cuantificar la actividad de las proteasas de neutrófilos en el esputo humano. Las aplicaciones de este tipo de análisis abarcan desde la evaluación de tratamientos antiinflamatorios hasta la validación de biomarcadores, el cribado de fármacos y los estudios clínicos de cohortes grandes.

Monitoreo De La ElastasA NeutrófiloS Y La Actividad De La Catepsina G En Muestras De Esputo Humano

La transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) entre dos moléculas fluoróforas se puede utilizar para estudiar las interacciones de proteínas en la célula viva. Aquí, se proporciona un protocolo sobre cómo medir FRET en células vivas mediante la detección de la emisión sensibilizada del aceptor y el enfriamiento de la molécula donante utilizando microscopía de barrido láser confocal.

Evaluación de las interacciones de proteínas en células vivas con emisión sensibilizada por FRET

El estudio detalla la metodología del mapeo FRET, incluida la selección de sitios de etiquetado, la elección de tintes, la adquisición y el análisis de datos. Esta metodología es efectiva para determinar los sitios de unión, los cambios conformacionales y los movimientos dinámicos en los sistemas de proteínas y es más útil si se realiza junto con la información estructural 3D existente.

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features

La espectroscopia de retrodispersión de neutrones ofrece un acceso no destructivo y sin etiquetas a la dinámica ps-ns de las proteínas y su agua de hidratación. El flujo de trabajo se presenta con dos estudios sobre proteínas amiloides: sobre la dinámica resuelta en el tiempo de la lisozima durante la agregación y sobre la dinámica del agua de hidratación de tau en la formación de fibra.

Espectroscopía de neutrones de alta resolución para estudiar la dinámica de picosegundos-nanosegundos de proteínas y agua de hidratación

Este estudio presenta un ensayo FRET radiométrico simple y fácil de usar para la detección y evaluación cuantitativa de la actividad de la ADNasa, y demuestra su aplicación en el análisis de una nucleasa débil.

Evaluación de la actividad de la ADNasa mediante transferencia de energía de resonancia de fluorescencia radiométrica

Aprende a analizar la cinética de la proteasa SENP1 mediante un ensayo FRET cuantitativo de un solo paso. Este método permite determinar parámetros cinéticos como KM y kcat en tiempo real con alta precisión.

Cuantitativo FRET (transferencia de energía de resonancia de Förster) Análisis para SENP1 Proteasa Determinación Kinetics

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