Name: Microgavage de larvas de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Aprende microgavage en larvas de pez cebra para administrar sustancias al lumen intestinal con control preciso de dosis y tiempo. Este método seguro mejora la investigación en biología del desarrollo y neurociencia.

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Agradecemos a los miembros del laboratorio de Rawls por sus valiosas sugerencias sobre el contenido y al Dr. Alan Fanning por las discusiones útiles sobre la permeabilidad según el tamaño de las uniones estrechas y los métodos de interrupción. También agradecemos al Dr. Michael Chua y al Dr. Neal Kramarcy de la Instalación de Microscopía Michael Hooker por el apoyo con el microscopio confocal. Este trabajo fue apoyado por subsidios de los National Institutes of Health T32 DK007737-15 (becario J.L.C.), F32 DK094592 (para J.L.C.) y R01 DK081426 (para J.F.R.).

<ol><li>Kuhlman, J., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screen+for+mutations+affecting+development+and+function+of+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Genetic screen for mutations affecting development and function of the enteric nervous system.</a> Dev. Dyn. 236, 118-127 (2007).</li>
<li>Pack, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+development+of+zebrafish+digestive+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting development of zebrafish digestive organs.</a> Development. 123, 321-328 (1996).</li>
<li>Wallace, K. N., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+and+conserved+aspects+of+gut+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish.</a> Dev. Biol. 255, 12-29 (2003).</li>
<li>Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+growth+and+differentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Intestinal growth and differentiation in zebrafish.</a> Mech. Dev. 122, 157-173 (2005).</li>
<li>Ng, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+digestive+system+in+zebrafish%3A+III.+Intestinal+epithelium+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis.</a> Dev. Biol. 286, 114-135 (2005).</li>
<li>Hama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+zebrafish+digestive+organ+function+using+multiple+quenched+fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of zebrafish digestive organ function using multiple quenched fluorescent reporters.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 445-453 (2009).</li>
<li>Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+digestive+organ+morphology+and+function+using+differential+fatty+acid+metabolism+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish.</a> Dev. Biol. 360, 276-285 (2011).</li>
<li>Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+high-content+model+system+for+studies+of+gastrointestinal+transit%3A+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">A new high-content model system for studies of gastrointestinal transit: the zebrafish.</a> Neurogastroenterol Motil. 21, 225-228 (2009).</li>
<li>Bagnat, M., Cheung, I. D., Mostov, K. E., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+single+lumen+formation+in+the+zebrafish+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic control of single lumen formation in the zebrafish gut.</a> Nat. Cell Biol. 9, 954-960 (2007).</li>
<li>Bagnat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cse1l+is+a+negative+regulator+of+CFTR-dependent+fluid+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cse1l is a negative regulator of CFTR-dependent fluid secretion.</a> Curr. Biol. 20, 1840-1845 (2010).</li>
<li>Shepherd, I., Eisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+zebrafish+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the zebrafish enteric nervous system.</a> Methods Cell Biol. 101, 143-160 (2011).</li>
<li>Brugman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxazolone-induced+enterocolitis+in+zebrafish+depends+on+the+composition+of+the+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Oxazolone-induced enterocolitis in zebrafish depends on the composition of the intestinal microbiota.</a> Gastroenterology. 137, 1757-1767 (2009).</li>
<li>Oehlers, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+bowel+disease+%28IBD%29+susceptibility+genes+NOD1+and+NOD2+have+conserved+anti-bacterial+roles+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">The inflammatory bowel disease (IBD) susceptibility genes NOD1 and NOD2 have conserved anti-bacterial roles in zebrafish.</a> Dis. Model Mech. 4, 832-841 (2011).</li>
<li>Oehlers, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+enterocolitis+model+in+zebrafish+larvae+that+is+dependent+on+microbiota+and+responsive+to+pharmacological+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A chemical enterocolitis model in zebrafish larvae that is dependent on microbiota and responsive to pharmacological agents.</a> Dev Dyn. 240, 288-298 (2011).</li>
<li>Faro, A., Boj, S. F., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fishing+for+intestinal+cancer+models%3A+unraveling+gastrointestinal+homeostasis+and+tumorigenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Fishing for intestinal cancer models: unraveling gastrointestinal homeostasis and tumorigenesis in zebrafish.</a> Zebrafish. 6, 361-376 (2009).</li>
<li>Fleming, A., Jankowski, J., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+gut+function+and+disease+changes+in+a+zebrafish+larvae+model+of+inflammatory+bowel+disease%3A+a+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of gut function and disease changes in a zebrafish larvae model of inflammatory bowel disease: a feasibility study.</a> Inflamm. Bowel Dis. 16, 1162-1172 (2010).</li>
<li>Kanther, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+colonization+induces+dynamic+temporal+and+spatial+patterns+of+NF-kappaB+activation+in+the+zebrafish+digestive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Microbial colonization induces dynamic temporal and spatial patterns of NF-kappaB activation in the zebrafish digestive tract.</a> Gastroenterology. , (2011).</li>
<li>Rawls, J. F., Samuel, B. S., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gnotobiotic+zebrafish+reveal+evolutionarily+conserved+responses+to+the+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Gnotobiotic zebrafish reveal evolutionarily conserved responses to the gut microbiota.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4596-4601 (2004).</li>
<li>Rawls, J. F., Mahowald, M. A., Goodman, A. L., Trent, C. M., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+and+genetic+analysis+link+bacterial+motility+and+symbiosis+in+the+zebrafish+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging and genetic analysis link bacterial motility and symbiosis in the zebrafish gut.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7622-7627 (2007).</li>
<li>Kanther, M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbe+interactions+in+the+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Host-microbe interactions in the developing zebrafish.</a> Curr. Opin. Immunol. 22, 10-19 (2010).</li>
<li>Bates, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+signals+from+the+microbiota+promote+different+aspects+of+zebrafish+gut+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct signals from the microbiota promote different aspects of zebrafish gut differentiation.</a> Dev. Biol. 297, 374-386 (2006).</li>
<li>Cheesman, S. E., Guillemin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((We+know+you+are+in+there%3A+conversing+with+the+indigenous+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">We know you are in there: conversing with the indigenous gut microbiota.</a> Res Microbiol. 158, 2-9 (2007).</li>
<li>Bates, J. M., Akerlund, J., Mittge, E., Guillemin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+alkaline+phosphatase+detoxifies+lipopolysaccharide+and+prevents+inflammation+in+zebrafish+in+response+to+the+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Intestinal alkaline phosphatase detoxifies lipopolysaccharide and prevents inflammation in zebrafish in response to the gut microbiota.</a> Cell Host Microbe. 2, 371-382 (2007).</li>
<li>Camp, J. G., Jazwa, A. L., Trent, C. M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intronic+cis-regulatory+modules+mediate+tissue-specific+and+microbial+control+of+angptl4%2Ffiaf+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Intronic cis-regulatory modules mediate tissue-specific and microbial control of angptl4/fiaf transcription.</a> PLoS Genetics. , In Press (2012).</li>
<li>Cheesman, S. E., Neal, J. T., Mittge, E., Seredick, B. M., Guillemin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+proliferation+in+the+developing+zebrafish+intestine+is+regulated+by+the+Wnt+pathway+and+microbial+signaling+via+Myd88%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell proliferation in the developing zebrafish intestine is regulated by the Wnt pathway and microbial signaling via Myd88.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4570-4577 (2011).</li>
<li>Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gastrointestinal+physiology+using+a+novel+intestinal+transit+assay+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol.+Motil%22%5BJournal%5D)">Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish.</a> Neurogastroenterol. Motil. 21, 304-312 (2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , 4 edn, University of Oregon Press. (2000).</li>
<li>Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+generating+and+colonizing+gnotobiotic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish.</a> Nat. Protoc. 3, 1862-1875 (2008).</li>
<li>Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+pore+and+leak+pathways%3A+a+dynamic+duo%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tight junction pore and leak pathways: a dynamic duo.</a> Annu. Rev. Physiol. 73, 283-309 (2011).</li>
<li>Van Itallie, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+density+of+small+tight+junction+pores+varies+among+cell+types+and+is+increased+by+expression+of+claudin-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">The density of small tight junction pores varies among cell types and is increased by expression of claudin-2.</a> J. Cell. Sci. 121, 298-305 (2008).</li>
<li>Van Itallie, C. M., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+size-dependent+permeability+of+the+tight+junction+using+PEG+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring size-dependent permeability of the tight junction using PEG profiling.</a> Methods Mol. Biol. 762, 1-11 (2011).</li>
<li>Watson, C. J., Rowland, M., Warhurst, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+modeling+of+tight+junctions+in+intestinal+cell+monolayers+using+polyethylene+glycol+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional modeling of tight junctions in intestinal cell monolayers using polyethylene glycol oligomers.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281, 388-397 (2001).</li>
<li>Rodgers, L. S., Fanning, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+epithelial+permeability+by+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Regulation of epithelial permeability by the actin cytoskeleton.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 68, 653-660 (2011).</li>
<li>Gonzalez-Mariscal, L., Chavez de Ramirez, B., Cereijido, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+formation+in+cultured+epithelial+cells+%28MDCK%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tight junction formation in cultured epithelial cells (MDCK).</a> J. Membr. Biol. 86, 113-125 (1985).</li>
<li>Palant, C. E., Duffey, M. E., Mookerjee, B. K., Ho, S., Bentzel, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+regulation+of+tight-junction+permeability+and+structure+in+Necturus+gallbladder%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ regulation of tight-junction permeability and structure in Necturus gallbladder.</a> Am. J. Physiol. 245, C203-C212 (1983).</li>
<li>Holmberg, A., Schwerte, T., Pelster, B., Holmgren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+the+gut+motility+control+system+in+zebrafish+Danio+rerio+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of the gut motility control system in zebrafish Danio rerio embryos and larvae.</a> J. Exp. Biol. 207, 4085-4094 (2004).</li>
<li>Rich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kit-like+immunoreactivity+in+the+zebrafish+gastrointestinal+tract+reveals+putative%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Kit-like immunoreactivity in the zebrafish gastrointestinal tract reveals putative.</a> 236, 903-911 (2007).</li>
<li>Holmberg, A., Olsson, C., Hennig, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TTX-sensitive+and+TTX-insensitive+control+of+spontaneous+gut+motility+in+the+developing+zebrafish+%28Danio+rerio%29+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">TTX-sensitive and TTX-insensitive control of spontaneous gut motility in the developing zebrafish (Danio rerio) larvae.</a> J. Exp. Biol. 210, 1084-1091 (2007).</li>
<li>Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+peristalsis+in+the+guinea-pig+small+intestine+using+spatio-temporal+maps%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps.</a> J. Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).</li>
<li>Flynn, E. J. 3rd, Trent, C. M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+nutritional+control+of+adipogenesis+in+zebrafish+%28Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio.</a> J. Lipid Res. 50, 1641-1652 (2009).</li>
<li>Clifton, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+inhibitors+of+dietary+lipid+absorption+using+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of novel inhibitors of dietary lipid absorption using zebrafish.</a> PLoS One. 5, e12386(2010).</li>
<li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li>
<li>Berghmans, S., Hunt, J., Roach, A., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+offer+the+potential+for+a+primary+screen+to+identify+a+wide+variety+of+potential+anticonvulsants%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish offer the potential for a primary screen to identify a wide variety of potential anticonvulsants.</a> Epilepsy Res. 75, 18-28 (2007).</li>
</ol>

No se declararon conflictos de intereses.

En este trabajo, describimos un protocolo novedoso para la administración directa de materiales al intestino de larvas de pez cebra mediante microsondaje. Existen varios pasos críticos a lo largo del procedimiento que deben tenerse en cuenta. Primero, las larvas de pez cebra deben encontrarse en buen estado de salud antes del experimento de sondaje para prevenir la muerte no relacionada con el tratamiento. Otro factor importante es la calidad de la aguja de sondaje. Una de las partes más difíciles del protocolo consiste ...

<table><tbody><tr><td>Finquel (metanosulfonato de tricaina)</td><td>Argent Chemical Laboratories</td><td>MS-222</td><td>Anestesia de larvas</td></tr><tr><td>Solución de rojo de fenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290-100 ml</td><td>Al 0,5 % en DPBS, probado para cultivo celular</td></tr><tr><td>Aceite mineral, ligero, blanco (alta pureza)</td><td>Amresco</td><td>J217-500 ml</td><td>Para rellenado posterior de agujas y pruebas de volumen</td></tr><tr><td>Dextrano TxRed, peso molecular 10.000, fijable con lisina</td><td>Invitrogen/ Molecular Probes</td><td>D-1863</td><td>Suspensión al 1 % en PBS 1x/rojo de fenol</td></tr><tr><td>FM4-64FX</td><td>Invitrogen/ Molecular Probes</td><td>F34653</td><td>Solución stock 5 mM en agua</td></tr><tr><td>Metilcelulosa</td><td>MP Biochemicals</td><td>0215549590</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidrio borosilicatado</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td>Diámetro externo 1,14 mm, diámetro interno 0,53 mm, longitud 3,5 pulgadas</td></tr><tr><td>Forma plástica para fabricación de moldes</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de microinyección Nanoject II</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas Flaming Brown, filamento ancho de 3,0 mm</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97, FT330B</td><td>Fabricación de agujas</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5 para estudiantes</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>0,1 x 0,06 mm, corte de agujas</td></tr><tr><td>Retículo ocular, 5 mm - 100 divisiones</td><td>Leica</td><td>10394771</td><td>Corte de agujas</td></tr><tr><td>Microforja</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Corte de agujas y pulido con llama</td></tr><tr><td>Aguja para jeringa Tuberculin SlipTip</td><td>Becton Dickinson</td><td>309626</td><td>1 ml, aguja 25G 5/8</td></tr><tr><td>Microesferas Fluoresbrite YG (2,0 &amp;mu;m)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18338</td><td>Análisis de motilidad intestinal</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico de disección</td><td>Leica</td><td>S6E</td><td>Procedimiento de gavaje</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico de fluorescencia</td><td>Leica</td><td>M205C</td><td>Ensayo de barrera con dextrano</td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td>Imagen del dextrano en circulación</td></tr></tbody></table>

microgavage de larvas de pez cebra

Microgavage of Zebrafish Larvae

El pez cebra ha surgido como un organismo modelo poderoso para estudiar el desarrollo intestinal1-5, la fisiología6-11, las enfermedades12-16 y las interacciones huésped-microbio17-25. Los enfoques experimentales para estudiar la biología intestinal a menudo requieren la introducción in vivo de materiales seleccionados en la luz del intestino. En el modelo de pez cebra larvario, esto se logra típicamente sumergiendo los peces en una solución del material seleccionado o mediante inyección a través de la pared abdominal. Con el método de inmersión, es difícil monitorear o controlar con precisión la ruta o el momento de la administración del material al intestino. Por esta razón, la exposición por inmersión puede causar toxicidad no intencionada y otros efectos sobre tejidos extraintestinales, limitando el rango potencial de cantidades de material que pueden administrarse en el intestino. Además, la cantidad de material ingerido durante la exposición por inmersión puede variar significativamente entre larvas individuales26. Aunque estos problemas no se presentan durante la inyección directa a través de la pared abdominal, realizar una inyección adecuada es difícil y causa daño tisular que podría influir en los resultados experimentales. Presentamos un método de microsondaje en larvas de pez cebra. El objetivo de este método es proporcionar una forma segura, eficaz y consistente de administrar material directamente a la luz del intestino anterior en larvas de pez cebra con un control preciso del momento. El microsondaje utiliza equipos estándar de microinyección de embriones y microscopía estereoscópica comunes en la mayoría de los laboratorios que realizan investigaciones con pez cebra. Una vez que los peces están correctamente posicionados en metilcelulosa, el sondaje puede realizarse rápidamente a un ritmo de aproximadamente 7-10 peces/min, y la supervivencia tras el sondaje se acerca al 100%, dependiendo del material administrado. También mostramos que el microsondaje permite cargar la luz intestinal con altas concentraciones de materiales que son letales para los peces cuando se exponen por inmersión. Para demostrar la utilidad de este método, presentamos un ensayo de microsondaje con dextrano fluorescente que puede utilizarse para cuantificar el tránsito desde la luz intestinal hacia espacios extraintestinales. Esta prueba puede emplearse para verificar la correcta ejecución del procedimiento de microsondaje y también proporciona un ensayo novedoso en pez cebra para examinar la integridad de la barrera epitelial intestinal bajo diferentes condiciones experimentales (p. ej., manipulación genética, tratamiento con fármacos o exposición a factores ambientales). Además, mostramos cómo el sondaje puede utilizarse para evaluar la motilidad intestinal mediante la administración de microesferas fluorescentes y el seguimiento de su tránsito posterior. El microsondaje puede aplicarse para administrar diversos materiales, como microorganismos vivos, factores microbianos secretados/toxinas, agentes farmacológicos y sondas fisiológicas. Con estas capacidades, el método de microsondaje en larvas de pez cebra tiene el potencial de potenciar una amplia gama de campos de investigación que utilizan el sistema modelo de pez cebra.

Cuando la gavaje se realiza correctamente, el material administrado debe quedar completamente contenido dentro del intestino anterior, con poco o ningún residuo en el esófago (Figura 3). Se debe elegir un volumen de administración que pueda alojarse dentro de la ampolla anterior y que no se filtre a través de la cloaca o del esófago. Si el volumen del material o la presión de administración es demasiado elevado, la fuerza física de la gavaje podría provocar daños o fugas a través del epitelio. También po...

Presentamos un método novedoso para la microsondaje de peces cebra larvales que utiliza equipos estándar de microinyección de embriones y estereomicroscopía. Demostramos que el microsondaje es una técnica segura y eficiente, útil para administrar cantidades controladas de diversos materiales directamente en la luz intestinal de larvas de pez cebra.

Microgavage de larvas de pez cebra

El pez cebra ha surgido como un organismo modelo potente para estudiar el desarrollo intestinal1-5, la fisiología6-11, las enfermedades12-16 y la interacción hospedador-microbio...

El objetivo general de este procedimiento es administrar por vía oral materiales al lumen intestinal de larvas de pez cebra. Primero, las larvas son anestesiadas y colocadas sobre un molde de inyección revestido con metilcelulosa. A continuación, las larvas se sumergen suavemente en el molde y se alinean con el ángulo de la aguja de sonda y del micromanipulador.A continuación, se inserta la aguja en la boca de la larva y se dirige hacia la ampolla intestinal. Una vez en posición, se libera el material en la luz. El último paso consiste en extraer la larva del metilcelulosa y colocarla en medio fresco para que se recupere de la anestesia.En última instancia, este método puede utilizarse para entregar materiales específicamente a la luz intestinal de larvas de pez cebra, donde se puede estudiar el transporte dentro del intestino o en tejidos extraintestinales. La ventaja principal de esta técnica frente a los métodos existentes, como la inmersión en agua que contiene el material de interés, es que la cantidad de material administrado al animal, así como el momento y la dosis, pueden controlarse rigurosamente. Esto disminuye la variabilidad experimental y, en algunos casos, la toxicidad asociada con ciertos materiales.La idea de este método surgió cuando tuvimos dificultades para aplicar ciertas sondas fluorescentes a niveles suficientemente altos como para ser detectables en el epitelio intestinal mediante microscopía. Altas concentraciones a veces matan a los peces y aún así no producen una señal fluorescente lo suficientemente intensa para la obtención de imágenes. Para comenzar, prepare varias agujas de sonda utilizando un tirador de micropipetas y use capilares de vidrio de sílice.Pase a un microscopio estereoscópico para cortar las agujas. Primero, alinee la punta de la aguja con el extremo de una regla transparente o gráfica. Una vez alineada, use pinzas de relojero de punta fina para cortar la aguja aproximadamente a un milímetro de la punta.Examine la punta de la aguja a 100 aumentos. La aguja debe tener un diámetro de entre 27 y 30 micrones y ser roma. Se deben evitar las agujas afiladas o irregulares para obtener resultados más consistentes.Se puede utilizar un microhorno para controlar mejor el punto de corte de la aguja y para pulir la punta mediante calor. Consejos para eliminar bordes afilados. A continuación, prepare la solución de gavaje.Para la mayoría de las aplicaciones, se añade rojo de fenol para ayudar en la visualización del microinyector y en la colocación de la solución de gavaje. Después de llenar con aceite mineral, coloque la aguja de gavaje en la unidad de microinyección NanoJet Two. Envuelva un plato de Petri de plástico de 10 centímetros con película adhesiva para proporcionar una superficie plana e impermeable y reparta alrededor de dos microlitros de la solución de gavaje sobre la película de parafina.El siguiente paso consiste en rellenar manualmente la aguja de sondaje. Tenga cuidado de no introducir burbujas de aire en el aceite mineral. Para calibrar el volumen de expulsión, inyecte pequeñas gotas en una placa de Petri pequeña llena de aceite mineral hasta que sean consistentes en tamaño, mida el diámetro de las gotas utilizando la herramienta gráfica y calcule el volumen de la gota.La consistencia entre las agujas se representa aquí. Antes de usar la aguja para la gavaje, elimine cualquier aceite mineral residual enjuagándola con medio limpio para peces cebra. Después de calentar el molde de aros, cubra tres surcos con metilcelulosa al 3%. El surco debe cubrirse lo suficiente para sostener el pez, pero no tan poco que la metilcelulosa se seque rápidamente.A continuación, alícuote alrededor de cuatro mililitros de medio para pez cebra en los pocillos de una placa de seis pocillos y transfiera larvas de pez cebra de cada grupo experimental a pocillos separados. Para anestesiar a los peces, prepare una solución de trica tres veces más concentrada en el medio adecuado para pez cebra. Un pocillo por vez.Anestesie el pez mezclando un volumen igual de solución trica en el medio y agitando suavemente. Tan pronto como los peces dejen de moverse, utilice una pipeta Pasteur de vidrio borg ancho para colocarlos uno por uno sobre la metilcelulosa, con sus cabezas en el ángulo de 45 grados de la ranura y sus colas orientadas hacia el ángulo de 90 grados de la ranura. Use una sonda de disección roma para presionar suavemente cada larva en la metilcelulosa, estabilizando su posición.A continuación, ajuste el equipo de microinyección nano jet dos de modo que la aguja esté inclinada en un ángulo poco pronunciado. Asegúrese de que el rango de extensión sea suficiente para alcanzar más allá del fondo del pocillo. Para minimizar la necesidad de ajustes futuros, configure la unidad de microinyección para liberar 4,6 nanolitros utilizando la posición de inyección lenta; coloque una mano para realizar ajustes menores en la placa que contiene las larvas inmovilizadas y la otra para controlar el micromanipulador de la unidad de microinyección.Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque los peces cebra son muy pequeños y se dañan fácilmente. Se requiere práctica para identificar la estructura esofágica bajo el microscopio estereoscópico y para determinar la cantidad adecuada de presión que debe aplicarse a la aguja de gavaje para alcanzar la luz intestinal. Primero, introduzca suavemente la aguja de gavaje en la boca de un pez anestesiado.Pase a través del esófago y deprese ligeramente el esfínter esofágico para introducir la punta justo dentro de la pared intestinal anterior. Una vez dentro del bulbo anterior, administre suavemente el material con estos ajustes. El volumen administrado debe llenar apenas el bulbo anterior del intestino sin salir por el esófago ni por la cloaca.Retire la aguja de manera rápida y suave. Tenga cuidado de no liberar cantidades significativas de material en el esófago. Después de retirar la aguja de gavaje, transfiera el pez a un recipiente que contenga medio fresco.Reviva las larvas del estado de anestesia y elimine la metilcelulosa lavándolas varias veces con medio fresco. Transfiera las larvas a una placa de Petri o a una placa de seis pocillos hasta su uso. Para análisis posteriores, se puede utilizar la microgavaje para administrar diversos materiales en la prueba con pez cebra.Para comenzar, prepare las soluciones necesarias para la gavaje para demostrar este método. Se utiliza dextrano de 10 KD conjugado con Texas Red para analizar la integridad de la barrera del epitelio intestinal.Después de seguir los pasos demostrados anteriormente, administre por gavaje grupos de 10 a 20 larvas de pez cebra para cada condición experimental. Repita este procedimiento con grupos duplicados o triplicados si es posible. Tras la administración por gavaje, recupere las larvas de la anestesia y permita que naden libremente en medio fresco.Después de aproximadamente 20 minutos, vuelva a anestesiar las larvas como se mostró anteriormente. Una vez anestesiadas, coloque las larvas en metilcelulosa al 3 % sobre un bloque de agar al 3 % e imagine las larvas con un microscopio estereoscópico fluorescente y un filtro Texas red; seleccione una magnificación que muestre las larvas desde el hocico hasta inmediatamente posterior al final del cloacra. La fluorescencia debe ser intensa en la luz intestinal.Sin embargo, la función de barrera se evalúa por el nivel de dextrano que aparece en los tejidos extraintestinales; ajuste la exposición para permitir la visualización de la fluorescencia del tronco. Aunque esto sobreexponga la fluorescencia luminal cuando se administra solo, el dextrano se retiene dentro de la luz del intestino. Sin embargo, en larvas tratadas conjuntamente con EDTA, que altera las uniones estrechas epiteliales, se observa dextrano en la circulación y en los vasos y espacios antisémicos.En estos ejemplos, se utilizó Image J para cuantificar la fluorescencia media relativa en una región de interés en el tronco del pez cebra y se normalizó respecto a una ROI fuera del pez como control interno. Aquí, se comparan los resultados obtenidos con una aguja convencional frente a los obtenidos con una aguja de microhorno. Menos larvas en el grupo solo con dextrina mostraron fluorescencia extraintestinal, lo que sugiere que las agujas de microhorno tienen menos probabilidades de dañar a las larvas.Al examinar una región más de cerca, se observa nuevamente que la dextrana se encuentra restringida al lumen intestinal sin filtrarse hacia la vasculatura ni hacia los espacios extraintestinales. En ausencia de EDTA, cuando se compara con dextrana en presencia de EDTA, se observa la dextrana en los espacios extraintestinales y dentro del lumen de la aorta dorsal y de la vena cardinales posterior; la señal de sangre aquí se debe al flujo sanguíneo. Al realizar este procedimiento, asegúrese de que la aguja no tenga bordes irregulares, de que los peces estén bien posicionados y sujetos en la metilcelulosa, y tenga cuidado y paciencia al aprender a manejar la aguja a través del esófago de la larva.Esta técnica puede utilizarse en una amplia gama de aplicaciones en el pez cebra que requieran la introducción controlada o la visualización de materiales dentro del intestino. Permite un control riguroso sobre el momento, la vía y la dosis de administración en el animal, y reduce considerablemente la variación dentro de un experimento y entre experimentos.

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este vídeo muestra cómo morfolino o ARNm puede ser inyectado en embriones de pez cebra en el estadio de una célula para aumentar o disminuir el nivel de productos específicos de genes durante el desarrollo posterior.

Microinyección de embriones de pez cebra para analizar la función génica

Fuente: Li, J., et al. Desarrollo de un modelo larvario de infección por peces cebra para Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo muestra el procedimiento de microgavage, en el que una larva de pez cebra anestesiada es inmovilizada en agarosa e inyectada oralmente con una bacteria patógena usando una aguja guiada por trazadores. El parto no invasivo imita la infección natural, permitiendo analizar la replicación bacteriana, la liberación de toxinas y el daño epitelial...

Desarrollo de un modelo de infección larvaria de pez cebra usando microgavage

El creciente uso de pez cebra como modelo animal requiere el desarrollo de métodos eficaces para la entrega de cantidades conocidas de compuestos y soluciones. El procedimiento de alimentación forzada se describe a continuación permite la administración oral de volúmenes precisos de la solución de forma fiable, segura y eficiente para adultos de pez cebra.

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Microinyecciones ventriculares cerebrales de lipopolisacárido en larvas de pez cebra para evaluar la neuroinflamación y la neurotoxicidad

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Cribado de moléculas pequeñas y pruebas de toxicidad en larvas de pez cebra en fase inicial

Aprende microgavage en larvas de pez cebra para administrar sustancias al lumen intestinal con control preciso de dosis y tiempo. Este método seguro mejora la investigación en biología del desarrollo y neurociencia.

Microgavage de larvas de pez cebra

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