Microgavage de larvas de pez cebra

El objetivo general de este procedimiento es administrar por vía oral materiales al lumen intestinal de larvas de pez cebra. Primero, las larvas son anestesiadas y colocadas sobre un molde de inyección revestido con metilcelulosa. A continuación, las larvas se sumergen suavemente en el molde y se alinean con el ángulo de la aguja de sonda y del micromanipulador.

A continuación, se inserta la aguja en la boca de la larva y se dirige hacia la ampolla intestinal. Una vez en posición, se libera el material en la luz. El último paso consiste en extraer la larva del metilcelulosa y colocarla en medio fresco para que se recupere de la anestesia.

En última instancia, este método puede utilizarse para entregar materiales específicamente a la luz intestinal de larvas de pez cebra, donde se puede estudiar el transporte dentro del intestino o en tejidos extraintestinales. La ventaja principal de esta técnica frente a los métodos existentes, como la inmersión en agua que contiene el material de interés, es que la cantidad de material administrado al animal, así como el momento y la dosis, pueden controlarse rigurosamente. Esto disminuye la variabilidad experimental y, en algunos casos, la toxicidad asociada con ciertos materiales.

La idea de este método surgió cuando tuvimos dificultades para aplicar ciertas sondas fluorescentes a niveles suficientemente altos como para ser detectables en el epitelio intestinal mediante microscopía. Altas concentraciones a veces matan a los peces y aún así no producen una señal fluorescente lo suficientemente intensa para la obtención de imágenes. Para comenzar, prepare varias agujas de sonda utilizando un tirador de micropipetas y use capilares de vidrio de sílice.

Pase a un microscopio estereoscópico para cortar las agujas. Primero, alinee la punta de la aguja con el extremo de una regla transparente o gráfica. Una vez alineada, use pinzas de relojero de punta fina para cortar la aguja aproximadamente a un milímetro de la punta.

Examine la punta de la aguja a 100 aumentos. La aguja debe tener un diámetro de entre 27 y 30 micrones y ser roma. Se deben evitar las agujas afiladas o irregulares para obtener resultados más consistentes.

Se puede utilizar un microhorno para controlar mejor el punto de corte de la aguja y para pulir la punta mediante calor. Consejos para eliminar bordes afilados. A continuación, prepare la solución de gavaje.

Para la mayoría de las aplicaciones, se añade rojo de fenol para ayudar en la visualización del microinyector y en la colocación de la solución de gavaje. Después de llenar con aceite mineral, coloque la aguja de gavaje en la unidad de microinyección NanoJet Two. Envuelva un plato de Petri de plástico de 10 centímetros con película adhesiva para proporcionar una superficie plana e impermeable y reparta alrededor de dos microlitros de la solución de gavaje sobre la película de parafina.

El siguiente paso consiste en rellenar manualmente la aguja de sondaje. Tenga cuidado de no introducir burbujas de aire en el aceite mineral. Para calibrar el volumen de expulsión, inyecte pequeñas gotas en una placa de Petri pequeña llena de aceite mineral hasta que sean consistentes en tamaño, mida el diámetro de las gotas utilizando la herramienta gráfica y calcule el volumen de la gota.

La consistencia entre las agujas se representa aquí. Antes de usar la aguja para la gavaje, elimine cualquier aceite mineral residual enjuagándola con medio limpio para peces cebra. Después de calentar el molde de aros, cubra tres surcos con metilcelulosa al 3%. El surco debe cubrirse lo suficiente para sostener el pez, pero no tan poco que la metilcelulosa se seque rápidamente.

A continuación, alícuote alrededor de cuatro mililitros de medio para pez cebra en los pocillos de una placa de seis pocillos y transfiera larvas de pez cebra de cada grupo experimental a pocillos separados. Para anestesiar a los peces, prepare una solución de trica tres veces más concentrada en el medio adecuado para pez cebra. Un pocillo por vez.

Anestesie el pez mezclando un volumen igual de solución trica en el medio y agitando suavemente. Tan pronto como los peces dejen de moverse, utilice una pipeta Pasteur de vidrio borg ancho para colocarlos uno por uno sobre la metilcelulosa, con sus cabezas en el ángulo de 45 grados de la ranura y sus colas orientadas hacia el ángulo de 90 grados de la ranura. Use una sonda de disección roma para presionar suavemente cada larva en la metilcelulosa, estabilizando su posición.

A continuación, ajuste el equipo de microinyección nano jet dos de modo que la aguja esté inclinada en un ángulo poco pronunciado. Asegúrese de que el rango de extensión sea suficiente para alcanzar más allá del fondo del pocillo. Para minimizar la necesidad de ajustes futuros, configure la unidad de microinyección para liberar 4,6 nanolitros utilizando la posición de inyección lenta; coloque una mano para realizar ajustes menores en la placa que contiene las larvas inmovilizadas y la otra para controlar el micromanipulador de la unidad de microinyección.

Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque los peces cebra son muy pequeños y se dañan fácilmente. Se requiere práctica para identificar la estructura esofágica bajo el microscopio estereoscópico y para determinar la cantidad adecuada de presión que debe aplicarse a la aguja de gavaje para alcanzar la luz intestinal. Primero, introduzca suavemente la aguja de gavaje en la boca de un pez anestesiado.

Pase a través del esófago y deprese ligeramente el esfínter esofágico para introducir la punta justo dentro de la pared intestinal anterior. Una vez dentro del bulbo anterior, administre suavemente el material con estos ajustes. El volumen administrado debe llenar apenas el bulbo anterior del intestino sin salir por el esófago ni por la cloaca.

Retire la aguja de manera rápida y suave. Tenga cuidado de no liberar cantidades significativas de material en el esófago. Después de retirar la aguja de gavaje, transfiera el pez a un recipiente que contenga medio fresco.

Reviva las larvas del estado de anestesia y elimine la metilcelulosa lavándolas varias veces con medio fresco. Transfiera las larvas a una placa de Petri o a una placa de seis pocillos hasta su uso. Para análisis posteriores, se puede utilizar la microgavaje para administrar diversos materiales en la prueba con pez cebra.

Para comenzar, prepare las soluciones necesarias para la gavaje para demostrar este método. Se utiliza dextrano de 10 KD conjugado con Texas Red para analizar la integridad de la barrera del epitelio intestinal.

Después de seguir los pasos demostrados anteriormente, administre por gavaje grupos de 10 a 20 larvas de pez cebra para cada condición experimental. Repita este procedimiento con grupos duplicados o triplicados si es posible. Tras la administración por gavaje, recupere las larvas de la anestesia y permita que naden libremente en medio fresco.

Después de aproximadamente 20 minutos, vuelva a anestesiar las larvas como se mostró anteriormente. Una vez anestesiadas, coloque las larvas en metilcelulosa al 3 % sobre un bloque de agar al 3 % e imagine las larvas con un microscopio estereoscópico fluorescente y un filtro Texas red; seleccione una magnificación que muestre las larvas desde el hocico hasta inmediatamente posterior al final del cloacra. La fluorescencia debe ser intensa en la luz intestinal.

Sin embargo, la función de barrera se evalúa por el nivel de dextrano que aparece en los tejidos extraintestinales; ajuste la exposición para permitir la visualización de la fluorescencia del tronco. Aunque esto sobreexponga la fluorescencia luminal cuando se administra solo, el dextrano se retiene dentro de la luz del intestino. Sin embargo, en larvas tratadas conjuntamente con EDTA, que altera las uniones estrechas epiteliales, se observa dextrano en la circulación y en los vasos y espacios antisémicos.

En estos ejemplos, se utilizó Image J para cuantificar la fluorescencia media relativa en una región de interés en el tronco del pez cebra y se normalizó respecto a una ROI fuera del pez como control interno. Aquí, se comparan los resultados obtenidos con una aguja convencional frente a los obtenidos con una aguja de microhorno. Menos larvas en el grupo solo con dextrina mostraron fluorescencia extraintestinal, lo que sugiere que las agujas de microhorno tienen menos probabilidades de dañar a las larvas.

Al examinar una región más de cerca, se observa nuevamente que la dextrana se encuentra restringida al lumen intestinal sin filtrarse hacia la vasculatura ni hacia los espacios extraintestinales. En ausencia de EDTA, cuando se compara con dextrana en presencia de EDTA, se observa la dextrana en los espacios extraintestinales y dentro del lumen de la aorta dorsal y de la vena cardinales posterior; la señal de sangre aquí se debe al flujo sanguíneo. Al realizar este procedimiento, asegúrese de que la aguja no tenga bordes irregulares, de que los peces estén bien posicionados y sujetos en la metilcelulosa, y tenga cuidado y paciencia al aprender a manejar la aguja a través del esófago de la larva.

Esta técnica puede utilizarse en una amplia gama de aplicaciones en el pez cebra que requieran la introducción controlada o la visualización de materiales dentro del intestino. Permite un control riguroso sobre el momento, la vía y la dosis de administración en el animal, y reduce considerablemente la variación dentro de un experimento y entre experimentos.