Los explantes blastómeras para la Prueba de Compromiso destino celular durante el desarrollo embrionario

El método que se muestra en este video utiliza mapas de destino de la etapa de escisión del embrión opus para identificar el cultivo de un solo blaser de forma aislada para evaluar si el sulfato embrionario está determinado por instrucciones intrínsecas o extrínsecas, se recolectan los primeros dos embriones celulares en los que el primer surco de escisión divide en dos el área ligeramente pigmentada del hemisferio animal. Estos embriones se cultivan cuando los embriones alcanzan de 16 a 32 células, luego se retira la membrana vitel y las células vecinas se diseccionan lejos de la célula elegida. Por ejemplo, el blaster diseccionado se transfiere a una depresión en un cultivo recubierto de barrena, bien y cultivado.

Una vez que el explan alcanza la etapa deseada, se recolecta para evaluar la expresión de genes o proteínas mediante hibridación in situ QPCR o inmunohistoquímica. La mayor ventaja de esta técnica sobre otras como el cultivo, grandes grupos de células embrionarias u órganos en el inicio de sesión, es que los blasfemos de un solo embrión cuyo destino de desarrollo se conoce a partir de estudios de rastreo de linaje pueden cultivarse sin factores de crecimiento añadidos ni la presencia de células vecinas. Por lo tanto, se puede probar directamente si los factores intrínsecos a la célula instruyen a ese blasfemo para que se convierta en el precursor de un tejido específico o si requiere señales de las células circundantes.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que la disección de los Blair y su transferencia a los pozos de cultivo requiere delicadas manipulaciones bajo el microscopio estereoscópico. En este video, usaré este método para demostrar si los ARNm derivados de la madre sesgan a las células hacia un destino neuronal Trabajando bajo un microscopio de disección. Afile cuatro juegos de pinzas con una película abrasiva Illumina.

Un par de pinzas sirve como respaldo en caso de que una punta se dañe durante el procedimiento, autoclave las cuatro pinzas y guárdelas en un recipiente estéril para hacer 500 mililitros cada uno de 0.1 x y 1.0x de solución salina barth modificada o MBS y filtre y etile. Almacene estas soluciones a 14 a 18 grados centígrados durante meses en una botella de vidrio con tapón de rosca, prepare aros de grado de electroforesis al 2% en 100 mililitros de un cultivo X. Autoclave medio para disolver el microondas aros, para licuar el aros la próxima vez que sea necesario mientras el aros es líquido.

Vierta aproximadamente 0,5 mililitros en el fondo de cada pocillo de una placa de cultivo estéril de 24 pocillos. Esto evitará que los implantes se peguen al plástico. A continuación, vierta unos dos o tres mililitros en el fondo de placas de Petri de dos a 360 milímetros y revuelva suavemente para distribuir.

Estos servirán como placas de disección y el aros evita que los embriones se peguen al plástico. Una vez que se retiran sus membranas, cuando el aros se haya enfriado y endurecido, se enciende la punta de una pipeta de pasto de seis pulgadas hasta que se derrita en una bola. Vuelva a encuadrar la bola brevemente, luego tóquela ligeramente en la superficie de los aros en un pozo de la placa de cultivo.

Esto creará una depresión poco profunda en la que se colocará el modelo X. Repita para cada pocillo en el plato. A continuación, llene cada pocillo de la placa de cultivo con un mililitro de un medio de cultivo estéril.

A continuación, llene la placa de disección con 0,1 XMBS para facilitar la separación del blaster. Una vez preparadas las placas de disección, transfiera los óvulos fertilizados sin las capas de gelatina a placas de Petri de 100 milímetros que contengan 0,5 x medio de cultivo. Las que no se utilizan inmediatamente se pueden cultivar a 14 grados centígrados, mientras que la primera placa se examina para dos embriones celulares.

Examine los embriones en la primera placa de Petri usando un microscopio de disección usando una pipeta de transferencia de plástico, transfiera aproximadamente 101 embriones de células y dos células a una placa separada llena de cultivo de 0,5x. Medio. Coloque la placa de Petri en una incubadora a 14 grados centígrados. La capacidad de este ensayo para evaluar con precisión el potencial de desarrollo de una célula se basa en la disección de la blasfemia correcta basada en mapas de destino.

Por lo tanto, es crucial elegir embriones con el patrón de pigmentación correcto en la etapa de dos células que, en consecuencia, se ajusten a los patrones de escisión regulares. Como se ilustra aquí. Los escisiones regulares a menudo ocurren solo en un lado del embrión.

Estos embriones aún se pueden usar como donantes si la célula del donante se origina del lado regular. Cuando los embriones alcancen la etapa de dos células, clasifique aquellos en los que el primer surco de escisión divide en dos el área ligeramente pigmentada en el hemisferio animal en un plato separado, clasifique aproximadamente cinco veces más embriones de los que se van a diseccionar. Estos serán los donantes para el explan.

Mantenga los dos embriones celulares restantes en un plato separado junto a los embriones del donante durante todo el procedimiento para que sirvan como controles entre hermanos para escenificar la exposición. Después de clasificar y diseccionar los embriones, regrese a los platos de la incubadora para encontrar más embriones de una célula y de dos células. Dado que los embriones de una célula tardan unos 90 minutos en dividirse, esto se puede hacer hasta dos horas después de la recolección de óvulos.

Para preparar el plan, coloque de cinco a 10 embriones en una placa de disección. A continuación, coloque el primer embrión de modo que la membrana transparente del vitel pueda ser agarrada con pinzas. Por lo general, no se puede ver, pero se puede agarrar en el polo del animal, donde está separado por un espacio peral claro sobre la superficie del embrión.

Con una pinza afilada en una mano, sujétela a una distancia del lanzador que se va a diseccionar para evitar dañarlo. Luego, con pinzas afiladas, en la otra mano, agarre la membrana cerca de la punta de las otras pinzas y tire suavemente en direcciones opuestas para despegar la membrana. El embrión se aplanará cuando se haya extirpado la membrana.

A continuación, agarre una celda vecina con las pinzas y use esta celda como mango para que la celda a diseccionar no se toque directamente con las pinzas en la otra mano, retire suavemente las celdas vecinas restantes de la blasfemia deseada. Si se seleccionan las celdas de la línea media que comparten el mismo destino, se pueden eliminar juntas como un par. Finalmente, diseccione la celda del mango.

Recoja el blasfemo o el par de amere con un vidrio estéril pasada por pipeta, evitando las burbujas de aire y la succión excesiva. Coloque la punta de la pipeta de pasto debajo de la superficie del medio de cultivo en un pocillo de la placa de cultivo X explan, y expulse suavemente el blaster. Debe deslizarse hacia la depresión poco profunda por gravedad.

Los blasfemos de más de un embrión pueden combinarse en un solo modelo depositándolos en la misma depresión de un cultivo. Bueno, repita este procedimiento con los embriones restantes en la placa de disección uno por uno. Después de unos 10 embriones, la placa de disección se llenará de restos celulares.

Cuando esto ocurra, cambie a la siguiente placa de disección. Después de que se hayan realizado todas las disecciones, verifique si los explanes están en las depresiones poco profundas. De lo contrario, se pueden empujar suavemente hacia la depresión con un lazo de cabello que haya sido esterilizado en etanol al 70% e implantes de incubación secados al aire a temperatura ambiente en el banco aproximadamente una hora después de la última disección.

Elimine los residuos que rodean el explan curado con un cultivo estéril de pipetas de vidrio para pastos. La placa de explan, a 14 a 20 grados centígrados, junto a la placa de Petri que contiene los embriones de control hermanos. Los embriones hermanos indicarán la etapa de desarrollo del explan.

Después de aproximadamente una o dos horas de cultivo, los blastómeros explantados se habrán dividido unas cuatro veces y se habrán desprendido de la mayoría de los restos que quedan de las células vecinas dañadas. Después de 20 horas, forman pequeñas bolas robustas de células. Cuando los hermanos alcancen la etapa de desarrollo deseada, coseche el explan.

Estos explan sobreviven bastante bien, incluso si algunas de las células se desintegran. Por lo tanto, si hay una masa turbia en el cultivo, explórela con un lazo para el cabello o pinzas para determinar si hay un explan saludable enterrado en su interior. Recoja el extracto en un pequeño volumen de solución de cultivo con un vaso más allá de la pipeta y expúselo suavemente en un fijador o tampón de lisis adecuado para el ensayo que se va a realizar.

Se diseccionaron dos blasfemos dorsales o dos blasfemos ventrales en la etapa de 16 células y se cultivaron en un XMBS a 14 grados Celsius hasta que los embriones hermanos alcanzaron las etapas tempranas de la placa neural. Cada muestra se analizó para determinar la expresión de una placa neural cigótica. Gene Sox dos por hibridación in situ, que se considera el producto de la reacción azul.

Los resultados de este ensayo demuestran que la mayoría de los blasfemos animales dorsales, que son precursores de la placa neural, pueden expresar SOX dos de forma autónoma. Es decir, sin señales adicionales de otras regiones del embrión. Aquellos explanes que no expresan SOX dos pueden haber sido identificados incorrectamente en el momento de la disección.

Por el contrario, ninguno de los blasfemos animales ventrales, que son precursores de la epidermis ventral, expresa SOX dos. Estos datos indican que los blasfemos animales dorsales tienen una capacidad intrínseca para formar tejido neural, mientras que los blasfemos animales ventrales no lo notan. Algunos de los explanados dorsales también han alargado una morfología indicativa de formación de mesodermo dorsal.

Estos blastómeros también se desvanecen para formar el Noor en el embrión intacto y un cultivo explan expresa una proteína marcador Noor para probar el efecto de la alteración de los niveles endógenos de un gen neural materno. Se inyectaron cinco ARNm de Fox D en los blasfemos precursores ventrales de ocho células. Como se muestra aquí, la mayoría de los implantes ventrales expresaron SOX dos.

Por el contrario, cuando el nivel endógeno de Fox D 5 se redujo mediante la inyección de oligonucleótidos morfo antisentido en los blasters precursores dorsales de ocho células, solo unos pocos explan dorsales expresaron SOX dos. Estos experimentos indican que la expresión materna de Fox D 5 desempeña un papel en la capacidad intrínseca de los blasfemos dorsales para adquirir un destino neuronal previo a este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la inyección en los Blair para ser diseccionados, ya sea ARNm para la ganancia de función o morfonucleótidos antisentido para la pérdida de función, para responder preguntas adicionales.

Por ejemplo, ¿qué genes están implicados en la capacidad intrínseca de las células para dar lugar a un destino específico del desarrollo? Además, se pueden probar factores de señalización conocidos agregando factores purificados al medio de cultivo. Este enfoque también se puede utilizar para trasplantar blasfemos individuales a lugares nuevos en el embrión intacto.

Esta prueba de si la célula trasplantada está comprometida con su destino de desarrollo original, esta información es crítica para definir los mecanismos celulares por los cuales una célula embrionaria pluripotente se compromete a convertirse en la precursora de un tejido definido.