Simultáneas registros de células de fotorreceptores y las neuronas de segundo orden en una rebanada preparación retina Anfibios

El objetivo general de este procedimiento es preparar cortes de tejido delgado de retina de salamandra tigre acuática y usarlos para registros simultáneos de pinza de voltaje de células completas de fotorreceptores y células horizontales y bipolares de segundo orden. Esto se logra diseccionando primero el ojo de una salamandra y aislando la retina en un trozo de membrana de nitrocelulosa. El segundo paso es cortar trozos finos de retina y colocarlos en la cámara de grabación.

A continuación, la cámara se coloca en un microscopio de platina fija vertical y se colocan pipetas de parche sobre los cortes de retina. El paso final es obtener grabaciones de células completas de una célula presináptica, fotorreceptora y postsináptica horizontal o bipolar. En última instancia, las grabaciones de células enteras emparejadas se pueden utilizar para manipular la liberación sináptica y estudiar las interacciones entre las células de la retina.

La preparación de corte de retina se desarrolló originalmente en los laboratorios de Frank Werblin y Sam Wu.A diferencia de las preparaciones de una sola célula, las preparaciones de corte mantuvieron intacto el contacto ntic, y a diferencia de las preparaciones de retina de montaje completo, el corte de la retina expone varias capas de retina, lo que permite un acceso rápido a todos los diferentes tipos de células. En la retina Slice. Las preparaciones se pueden utilizar para registros electrofisiológicos, incluido el registro simultáneo para múltiples células y para experimentos de imagen.

Esta preparación ha demostrado ser extremadamente valiosa para estudiar las interacciones sinápticas entre las neuronas de la retina. En este video, describimos la preparación de lonchas con retina de salamandra tigre y enfatizamos algunos de los pequeños detalles que pueden marcar la diferencia entre el éxito y el fracaso. Comience este procedimiento ensamblando la cámara.

Coloque dos gotas de grasa al vacío espaciadas entre ocho y 10 milímetros a lo largo de la cámara de grabación para formar un canal para la superfase e incrustar las rodajas de retinol en un segundo golpe de grasa, unos milímetros más allá de cada una de estas dos gotas de grasa para actuar como un gravamen para limitar el derrame. A continuación, coloque un pequeño trozo triangular de toallita Kim en el extremo de la cámara para asegurar el contacto del fluido con el electrodo de referencia. Después de eso, presione un trozo de membrana de nitrocelulosa contra el microscopio de vidrio.

Deslice sobre dos pequeñas gotas de grasa al vacío. Para preparar la cortadora de pañuelos. Rompe una hoja de afeitar de doble filo en cuatro pedazos.

A continuación, fije uno de ellos al brazo de corte. Asegúrese de que el filo de la hoja de afeitar quede plano contra la cámara de grabación cortando una rodaja fina de papel de filtro de nitrocelulosa. A continuación, después de sacrificar a una salamandra por decapitación, nuclear el ojo con un par de pequeñas tijeras de Venecia bajo el microscopio, cortar la piel que conecta el ojo con la órbita circundante.

A continuación, tire del ojo hacia delante y deslice las tijeras por debajo de él para cortar los músculos oculares y el nervio óptico. Después, coloque el ojo enucleado sobre un lecho de algodón sobre un bloque de linóleo. Ahora haga una pequeña incisión en el centro de la córnea con una cuchilla quirúrgica afilada.

Retire la córnea deslizando las finas tijeras Venice en la incisión y extendiendo el corte radialmente hacia el aura Serrata. A continuación, corte circunferencialmente alrededor del aura serrata girando el bloque de linóleo o el algodón entre los cortes. Después de cortar todo el contorno del ojo, retire la córnea y el cristalino tirando de ellos hacia afuera del costado de la copa del ojo.

Transfiera la copa ocular restante a una superficie dura del bloque de linóleo humedecida con solución salina de anfibios. Córtalo en tercios con una cuchilla de afeitar afilada con un movimiento de sierra fino para asegurarte de que corte todo el camino a través de la esclerótica. A continuación, coloque una o dos piezas de IUP en la membrana de nitrocelulosa con la superficie de la retina hacia abajo.

Sumerge las piezas restantes con solución salina adicional. Después de eso, colóquelos en un refrigerador en caso de que se corten rebanadas adicionales más tarde. Ahora, presione suavemente la pieza de IUP contra la membrana de nitrocelulosa con un par de pinzas finas.

Sumerge la membrana de nitrocelulosa y la pieza de IUP con varias gotas de solución salina fría de anfibios. A continuación, drene la solución salina tocando un trozo de toallita Kim en los bordes de la membrana de nitrocelulosa y el iup. Después de eso, sumerja el IUP en la membrana de nitrocelulosa con varias gotas de solución salina fría para anfibios.

De nuevo, posteriormente se despega el epitelio pigmentario de la retina coroidea de la esclerótica para aislar la retina. Si la retina no se ha adherido firmemente, drene la solución salina con una toallita kim. Para tirar de la retina más firmemente sobre la membrana de nitrocelulosa, reemplace la solución salina y repita el procedimiento si es necesario.

A continuación, llene la cámara con solución salina fría para anfibios. Transfiéralo a la etapa de la cortadora de pañuelos. A continuación, corte la retina y la membrana de nitrocelulosa en tiras finas de 125 micras presionando la hoja de afeitar suave pero firmemente a través de ellas.

Después de cortar toda la retina en rodajas, transfiera las rebanadas de retina una por una al canal principal de la cámara de grabación. Para transferir una rebanada, sostenga una tira de membrana en su lugar mientras desliza la cámara debajo de ella. Asegúrese de mantener la rebanada sumergida cuando esté por encima de la parte central de la cámara.

Incruste los bordes de la membrana de nitrocelulosa en las tiras de grasa al vacío y gírela 90 grados. Para ver las capas de la retina, presione la membrana de nitrocelulosa contra la superficie del vidrio, incluso si no hay retina en cada pieza. Coloque tiras de membrana de nitrocelulosa a intervalos regulares de aproximadamente milímetros para ayudar a romper la tensión superficial y, por lo tanto, mejorar el flujo de fluido.

Continúe transfiriendo las rodajas una por una hasta que las rodajas se hayan colocado a lo largo de toda la longitud del canal de perfusión. Una vez que se hayan transferido todos los cortes, mueva la cámara de registro a la etapa de un microscopio de etapa fija vertical. Conecte el cable del electrodo de referencia a un cable de tierra en la etapa del cabezal del amplificador.

Concéntrese en las rodajas utilizando un objetivo de inmersión en agua a larga distancia de trabajo de 40 a 60 veces. Siguiente súper. Fusionar las rodajas a una velocidad de un milímetro por minuto con solución salina de anfibios burbujeada con oxígeno.

Conecte la línea de succión a la línea de salida de la cámara. A continuación, ajuste el caudal de salida para equilibrar el caudal de entrada girando el extremo biselado de la aguja de succión o moviendo la toallita kim en el extremo de la cámara más cerca o más lejos de la abertura en la punta de la aguja de salida. Examine las rodajas bajo luz tenue o infrarroja.

A continuación, identifique un par de células, un fotorreceptor y una célula horizontal o bipolar cercana para su venta al por mayor. Grabación de la pipeta Philip preparada antes de los experimentos con la solución intracelular, móntela en el soporte de electrodos. A continuación, eleve ligeramente el objetivo del microscopio.

Coloque la pipeta fotorreceptora debajo del objetivo. A continuación, bájalo para que la punta quede justo encima de la rebanada y ajusta el enfoque simultáneamente. Para evitar ir demasiado lejos.

Repita este procedimiento con la segunda pipeta. A continuación, compruebe la resistencia de la pipeta con un pulso de despolarización de cinco a 10 milivoltios. Ajuste cualquier desplazamiento en el nivel de corriente de referencia en el amplificador.

Después de eso, aplique una ligera presión positiva y, mientras tanto, coloque la pipeta postsináptica de modo que entre en contacto con el cuerpo celular horizontal o bipolar. A continuación, coloque la pipeta presináptica de modo que entre en contacto con el cuerpo celular de un fotorreceptor de bastones o conos. Mientras monitorea la liberación de resistencia, la presión positiva en la pipeta postsináptica, a veces la liberación de presión positiva es suficiente para formar un sello de giga ohmios.

Después de que la resistencia de la punta haya aumentado a más de 100 mega ohmios, aplique un potencial de retención de menos 60 milivoltios. Luego, cuando se obtiene un sello giga om, cancele el transitorio de capacitancia de la pipeta. Usando el circuito de compensación de capacitancia del amplificador de abrazadera de parche, repita el procedimiento de techo con la pipeta fotorreceptora, aplicando un potencial de retención de menos 70 milivoltios y cancele la capacitancia de la pipeta.

Transitorio, luego rompa el parche aplicando succión a cada celda. La ruptura del parche es evidente por la aparición de transitorios de capacitancia de celda completa. Ahora, confirme la identidad fisiológica de la célula postsináptica aplicando un destello de luz y entregando una serie de pasos de voltaje de menos 120 a más 40 milivoltios en incrementos de 20 milivoltios.

Para evaluar si las celdas están conectadas sinápticamente, suministre un 60 milivoltio de 25 a 100 milisegundos. Despolarización escalonada al fotorreceptor y búsqueda de corrientes postsinápticas. En la neurona de segundo orden, aquí están los rastros representativos de las respuestas a la luz de las neuronas en cortes verticales de la retina de la salamandra.

La célula horizontal del cono y la célula bipolar apagada muestran una corriente hacia el exterior en respuesta al inicio de la luz. La prominente corriente interna que sigue al destello de luz en las grabaciones de células horizontales y bipolares aquí es causada por el aumento de la liberación de glutamato de los fotorreceptores a medida que se despolarizan al compensar la luz. La célula bipolar responde con una corriente hacia adentro al inicio de la luz, que resulta de una cascada de señalización del receptor de glutamato metabotrópico que invierte el signo y la activación de los canales tripm one.

Las celdas horizontales y las celdas bipolares se pueden distinguir entre sí por sus relaciones de voltaje de corriente. Las celdas horizontales suelen tener relaciones de voltaje de corriente lineales o rectificadoras hacia adentro con una resistencia de entrada inferior a 500 mega ohmios, las celdas bipolares tienen una relación de voltaje de corriente rectificadora hacia afuera y una resistencia de entrada más alta entre 0,5 y dos giga ohmios. Esta figura muestra los resultados representativos de los registros de un par de células horizontales de cono y un par de células bipolares de cono.

En cada caso, la despolarización del cono a menos 10 milivoltios desde un potencial de retención de menos 70 milivoltios evocó una corriente de calcio dependiente de voltaje en el cono y un rápido postsináptico hacia adentro. Corriente en la célula horizontal o bipolar Corte de retina. Las preparaciones se han utilizado en cientos de estudios sobre la anatomía y la fisiología de la retina.

Son particularmente ventajosos para examinar las respuestas de varias células simultáneamente, ya que facilitan el registro y la obtención de imágenes de varias células al mismo tiempo. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo diseccionar la retina, cortar cortes delgados de retina, colocarlos en la cámara de grabación y obtener grabaciones al por mayor de pares de seres conectados sinápticamente.