LeafJ: Un Plugin para ImageJ Semi-automático Medición Hoja Forma

El objetivo de este procedimiento es automatizar la medición de la forma de las hojas para experimentos de alto rendimiento. Esto se logra diseccionando primero las hojas y tomándolas con un escáner plano. El segundo paso del procedimiento es utilizar el plugin leaf J para detectar y medir las hojas.

El tercer paso es preparar las hojas para la microscopía y fotografiarlas con un microscopio compuesto. El paso final es trazar las líneas de venta en las imágenes adquiridas utilizando una tableta con pantalla táctil. En última instancia, los resultados pueden mostrar diferencias en la forma de la hoja, el tamaño de la célula y el número de células a través de esta combinación de análisis de imágenes.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es su rapidez. Es aproximadamente seis veces más rápido que la medición manual. Las personas sabían que este método puede tener dificultades porque la ubicación adecuada de las hojas es fundamental para el análisis posterior, y porque el montaje de las hojas en los portaobjetos puede ser técnicamente un desafío.

La primera vez que tuve la idea de este método fue cuando me di cuenta de que teníamos alrededor de 15.000 hojas para analizar, y hacerlo a mano llevaría muchos meses y sería increíblemente aburrido, demostrando que la técnica de disección de plantas estaría causando neuro zue. Un científico investigador de mi laboratorio Comience preparando hojas de transparencia de 8.5 por 11 pulgadas. Cada hoja debe dividirse en marcos rectangulares, lo suficientemente grandes como para acomodar las hojas de una planta, estrechar la segunda hoja de transparencia a la hoja impresa para que sirva como cubierta y evite que las hojas se sequen.

Etiqueta con la planta, genotipo y condición de crecimiento. Disecciona las hojas de las plantas del día 26. Coloque las hojas en la transparencia en orden táctico de menor a mayor.

Coloque las hojas verticalmente dentro del marco sin tocar el borde ni superponer otras hojas. De lo contrario, se producirán problemas Durante el análisis, es importante que las hojas orientales no se toquen verticalmente, enmarquen, no se superpongan con las hojas dispuestas. Colócalos con la segunda hoja de transparencia en blanco y una rejilla para mantener las hojas planas.

A continuación, genere una imagen con un escáner plano con una resolución de al menos 600 puntos por pulgada. Comience instalando el complemento. Descargue la imagen J y arrastre el archivo leaf jja a la carpeta de complementos de la imagen J.Cuando se use la imagen J, el complemento leaf J ahora estará disponible.

Proceda a abrir el archivo de imagen de hoja en la imagen J.Asegúrese de que la imagen J sea de la versión 1.45 s o posterior. Divida la imagen en tres canales de color, rojo, verde y azul, haciendo clic en los canales de división de color de la imagen. A continuación, aplique un umbral a la imagen en el canal azul.

Ahora seleccione todas las hojas de una planta usando la herramienta de selección rectangular y luego seleccione el complemento de hoja J. El plugin ahora abrirá una caja que permite establecer las diversas condiciones del experimento, como un grupo experimental y un genotipo. Antes de continuar, edite estas opciones y, a continuación, seleccione las condiciones para las hojas seleccionadas en la región de interés y proporcione un nombre descriptivo.

Presione continuar y la hoja J delineará automáticamente cada hoja con una imagen de ROI única. Las rutinas J encajan en elipse a la hoja y calculan los ejes mayor y menor de esa elipse si es necesario. Edite las líneas de trazado desde la ventana del administrador de ROI.

Una tableta con pantalla táctil conectada como monitor externo puede ser útil para este procedimiento. Con los límites correctamente definidos, ejecute el análisis pulsando. Bien, ahora la hoja J genera la longitud del pétalo y varias geometrías de la lámina de la hoja.

En última instancia, exporte los resultados de la medición y la información asociada a una hoja de cálculo. Después de escanear las hojas, fíjelas en F-A-A-F-A. Las hojas fijas se pueden almacenar a cuatro grados centígrados hasta por seis meses.

Avanzando una o dos horas antes de obtener imágenes de las hojas, despeje las hojas cambiando el fijador de FAA a una solución de clorhidrato. Una vez despejadas, monta las hojas en portaobjetos con los tricomas hacia arriba con un aumento de 40x en una imagen de microscopio compuesto, la capa de mesil del centro de cada hoja a cada lado de la vena principal, evitando las células cerca de los tricomas o las venas. Para evitar dificultades en el procesamiento de imágenes, es importante eliminar todas las burbujas de aire de las diapositivas al montar las hojas y también obtener imágenes enfocadas en el siguiente paso.

Después de recopilar las imágenes deseadas, abra una en la imagen J y trace los contornos de las celdas de la hoja con la herramienta de administrador de imágenes JROI con la ayuda de la tableta con pantalla táctil y un lápiz óptico. Esto no utiliza el complemento LEAF J. Antes de usar LEAF J para la experimentación, la precisión y la velocidad del complemento se compararon con las de un investigador experimentado. En general.

La hoja J terminó 5,7 más rápido que los cálculos manuales y la comparación de los datos de los dos métodos mostró que los resultados estaban estrechamente correlacionados para todos los parámetros medidos de los 3.532 comparados. Los puntos de datos 172 eran valores atípicos. De estos valores atípicos, 29 fueron causados por el complemento LEAF J, mucho menos que los 143 causados por errores humanos.

Durante la medición manual, la hoja J se ha actualizado desde entonces para reducir aún más el número de errores. Teniendo en cuenta las mediciones de LEAF J, se utilizó para analizar la evitación de la sombra utilizando un modelo de efectos mixtos. El tratamiento y el número de hojas fueron efectos fijos y la replicación fue como un efecto aleatorio.

Muchos parámetros se vieron afectados significativamente por el tratamiento de sombra. Alternativamente, algunos parámetros no se vieron afectados significativamente por la sombra. Utilizando un análisis de imagen asistido por tableta de los parámetros celulares, se examinaron 67 genotipos de Arabidopsis ANA con un total de 8.629 células de 877 hojas de 224 plantas.

A continuación, los genotipos se agruparon en seis clases. La mayoría de los genotipos tienen un tamaño y número de células normales. Sin embargo, varios tenían un tamaño de celda más grande con un número de celdas normal.

Si bien es importante intentar este procedimiento utilizar la aleatorización y el diseño experimental cuando cultive sus plantas, recuerde que trabajar con formaldehído y clorhidrato puede ser extremadamente peligroso. Por lo tanto, se deben tomar precauciones como usar guantes y trabajar en la campana extractora al realizar este procedimiento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un cribado de alto rendimiento de fenotipos de hojas y formas de células utilizando sus propias condiciones experimentales Siguiendo este procedimiento.

Se pueden utilizar métodos adicionales, como la secuenciación de ARN, para responder a preguntas como qué genes moldean eficazmente.