Name: La aplicación local de medicamentos para estudiar la función del receptor nicotínico de acetilcolina en rodajas de cerebro de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Aprende a aplicar fármacos localmente para estudiar receptores nicotínicos de acetilcolina en rodajas de cerebro de ratón adulto mediante técnicas de patch clamp. Este método permite caracterizar propiedades biofísicas de canales iónicos en neuronas vivas.

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Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de subvención DA030396. Gracias a los miembros del laboratorio drenan útil para el debate y la crítica del manuscrito. Un agradecimiento especial a Mi Ran Kim para la asistencia técnica y Jonathan Thomas Ting para el asesoramiento con respecto a las secciones de cerebro de ratón adulto.

1. Preparación de las soluciones para la preparación de cortes de cerebro y electrofisiología <ol><li> Soluciones para la preparación de secciones de cerebro se han descrito anteriormente 3, 4. Preparar N-metil-D-glucamina (NMDG)-basado de corte y solución de recuperación de la siguiente composición (en mM): 93 N-metil-D-glucamina, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 30 NaHCO 3, 20 HEPES, 25 glucosa, 5 ascorbato de Na +, 2 tiourea, 3 Na + piruvato, 10 MgSO 4 • 7H 2 O, 0,5 CaCl 2 • 2H 2 O. Ajuste a 300-310 mOsm con NMDG. Ajustar el pH a 7.3-7.4 con 10 N HCl. <ol class="lalpha"><li> Disolver MgSO 4 • 7H 2 O y CaCl 2 • 2H 2 O en agua Millipore para hacer 2 M soluciones madre de cada uno. </li><li> Pesar otros componentes en el orden indicado y añade a un matraz volumétrico de llenado parcialmente con agua Millipore mientras se agita para disolver. Una vez que todo se añade, llenarmatraz aforado con agua Millipore. </li><li> Medir el pH y ajustar con 10 N HCl. </li><li> Medir la osmolaridad y ajustar con NMDG si es necesario. </li></ol></li><li> Preparar HEPES holding líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) de la siguiente composición (en mM): 92 NaCl, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 30 NaHCO 3, 20 HEPES, 25 glucosa, 5 ascorbato Na +, 2 tiourea, 3 Na piruvato +, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. Ajuste a 300-310 mOsm con sacarosa. Ajustar el pH a 7.3-7.4 con 1 N HCl o NaOH. <ol class="lalpha"><li> Pesar los componentes en el orden indicado y añade a un matraz volumétrico de llenado parcialmente con agua Millipore mientras se agita para disolver. Una vez que todo se añade, llenar matraz aforado con agua Millipore. </li><li> Medir el pH y ajustar con NaOH o HCl si es necesario. </li><li> Medir la osmolaridad y ajustar con sacarosa, si es necesario. </li></ol></li><li> Preparar solución estándar de grabación LCRa de la siguiente composición (en mM): 124 NaCl, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 24 NaHCO 3, 12,5 glucosa, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. Ajuste a 300-310 mOsm con sacarosa. Ajustar el pH a 7.3-7.4 con 1 N HCl o NaOH. </li></ol> 2. Preparación de las rebanadas cerebral agudo <ol><li> Corte de cortes de cerebro y recuperación se realizan como se ha descrito anteriormente 3, 4. Burbuja de dos platos de cristal lleno de NMDG solución de recuperación con 95% de oxígeno / 5% de gas CO 2 (carbógeno), un plato sobre el hielo, y la otra a 33 º C. </li><li> Burbuja de un plato de cristal lleno con HEPES que sostienen LCRa con carbógeno a temperatura ambiente. </li><li> Se anestesia el ratón adulto (de 2 a 12 meses) con Na + pentobarbital (200 mg / kg, ip). Continúe con el procedimiento cuando el animal no responde a un dedo del pie-pinch. </li><li> Si es necesario, corte una muestra de tejido de la cola para su posterior genotypING del animal. </li><li> Abrir la cavidad torácica, exponer el corazón, y la abrazadera de la aorta descendente. Lacerar la aurícula derecha. </li><li> Transcardially perfundir los animales con 5-10 ml de 0-4 ° C NMDG solución de recuperación. </li><li> Decapitar a los animales, retire el cerebro y lo coloca en 4 ° C NMDG solución de recuperación de 1 min. </li><li> En una placa metálica enfriada con hielo, recorte el cerebro en la orientación deseada (coronal, parasagital, horizontal, etc) para incluir el área de interés. </li><li> Coloque el bloque de cerebro con pegamento a la superficie etapa seca de una máquina de cortar vibrante (DSK-Zero 1; Dosaka), sumergir el bloque cerebro en 4 ° C NMDG solución de recuperación y continuamente burbujas de la solución con carbógeno. </li><li> Cortar las rebanadas de la zona del cerebro de interés. Espesor de la rebanada es de 200-400 micras, dependiendo del área del cerebro específica de interés, la edad del animal, y experimento a realizar. </li><li> Inmediatamente después del corte, incube las rebanadas deseadas en carbogenated, 33 ° C NMDG de recuperación solutidurante exactamente 12 minutos, luego se transfieren a HEPES carbogenated, sala de temperatura de mantenimiento solución por un período inicial de 60 min. Después de esta incubación de 60 min, las rodajas se puede utilizar para la grabación. Las láminas se mantuvieron en solución de HEPES que sostienen todo el día hasta que se utilizan para la grabación. </li></ol> 3. Patch Clamp grabación de neuronas en rodajas de cerebro <ol><li> Tire una micropipeta estándar con un parche programable Flaming-Brown extractor (Sutter P-97 o extractor verticales equivalente). Pipetas que son óptimas para la formación de sello giga-ohmios típicamente tienen una resistencia de 4-6 mW </li><li> Transferir una rebanada a la cámara de grabación (RC-27L; Instrumentos Warner) en la etapa de un microscopio vertical (Nikon FN-1). Continuamente superfuse (1,5 - 2,0 ml / min) en el sector con carbogenated, grabación estándar LCRa calentado y mantenido a 32 ° C. Alternativamente, las rebanadas se puede mantener a temperatura ambiente. </li><li> Y centre el área cerebral de interés utilizandouno de los objetivos del aire 10 veces (Nikon Plan Fluor 10X; NA 0,3; WD: 16 mm). </li><li> Visualizar las neuronas individuales utilizando un 40X en el infrarrojo cercano (IR) objetivo de inmersión en agua (Nikon APO 40XW; NA: 0,80; WD: 3,5 mm) conectado a contraste de interferencia IR-diferencial (DIC) óptica y una velocidad alta de infrarrojo cercano dispositivo acoplado cargado (CCD) video cámara (Hamamatsu C-7500). Bajo IR-DIC observación, las neuronas sanas presentan una superficie lisa, de color gris claro membrana plasmática. </li><li> Llenar una micropipeta con una solución de registro intracelular adecuado. Para la mayoría de aplicaciones, se utiliza la siguiente solución (en mM): 135 gluconato de potasio, 5 EGTA, 0,5 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 2 Mg-ATP, GTP y 0,1 (pH se ajustó a 7,25 con Tris base, osmolaridad ajustado a 290 mOsm con sacarosa). Establecer una grabación de célula entera de una neurona visualizado. </li></ol> 4. La aplicación local de medicamentos a las neuronas en rodajas <ol><li> Tire una micropipeta de patch clamp estándar como se describe anteriormente. Usoun extractor de pipeta como una Sutter P-97 que produce dos hermanas &quot;idénticas&quot; consejos de la misma pieza de vidrio es ventajoso cuando las soluciones de fármacos múltiples se van a utilizar en la misma célula. Tamaños de la punta que tienen una resistencia de ~ 5 mW si se llenaron con la solución intracelular se ha descrito anteriormente es la óptima. </li><li> Relleno de la micropipeta con una solución de fármaco se diluyó en aCSF carbogenated, grabación estándar. Dirija la punta hacia abajo, y la película de la micropipeta relleno de fármaco para eliminar las burbujas de aire atrapadas en la columna de solución. </li><li> Montar la micropipeta relleno de fármaco en un soporte de pipetas conectado con un tubo a un sistema de presión de expulsión adecuado, tal como un Picospritzer III (General Valve Co.). El titular de la pipeta debe ser montado en un micromanipulador con la misma resolución que manipuladores comúnmente utilizado para la grabación de patch clamp (por ejemplo, Sutter MP-285). Adicionalmente, el manipulador debe permitir el movimiento diagonal dentro y fuera de la rebanada. Hombreexpulsar manualmente presión 3 a 4 veces en la micropipeta con el fin de acumular la presión adecuada detrás de la columna de fluido. </li><li> Uso de los controles micromanipulador, baje la pipeta fármaco en la porción mientras se visualiza la punta bajo IR-DIC óptica. Idealmente, se debe identificar visualmente y el centro de una neurona a grabarse, seguido por la colocación de la pipeta de drogas cerca de la célula antes de la reducción de la micropipeta grabación dentro de la rebanada. Colocación de la pipeta de drogas puede provocar el movimiento del tejido en la vecindad de la célula grabada que podría interrumpir la grabación si el fármaco pipeta se coloca en posición después de establecer un sello gigaohmio. </li><li> Utilización de vídeo de IR, la posición de la micropipeta fármaco en la superficie superior de la lámina de tejido. Ejecutar una presión de eyección y el monitor 1) la proximidad de la punta para el movimiento de los desechos en relación con la expulsión, y 2) la punta de la micropipeta para detectar cualquier signo de que la punta está tapada o bloqueada. Si la punta está obstruido / tapado, retraiga el pipeteee y reemplazarla con una nueva. </li><li> Enfoque de la célula grabada en diagonal desde la parte superior de la rebanada de tal manera que cuando está en posición final, la punta de la pipeta de relleno de fármaco es 1) en el mismo plano focal (o ligeramente por debajo) como la celda grabada y la punta del electrodo de registro , y 2) 10 a 40 micras de la célula registrada. Si la punta de pipeta relleno de fármaco está por encima de la celda grabada, la fuerza de la presión de eyección podría interrumpir el sello gigaohmio. </li><li> Registrar la respuesta celular deseada mientras mantiene la celda en modo de tensión de la abrazadera o el modo de abrazadera de corriente. En forma rutinaria grabar acetilcolina y / o la nicotina-suscitó corrientes celulares mientras mantiene las neuronas en el modo de fijación de voltaje. Aunque la presión de eyección puede ser activado manualmente cuando se utiliza un Picospritzer III, para obtener resultados más reproducibles se recomienda para activar la eyección de presión utilizando el sistema de adquisición (Axon Digidata 1440 y pClamp 10,3) con un pulso digital TTL. </li></ol> 5. ControladorLa micropipeta lleno de drogas con un traductor piezoeléctrico <ol><li> Si es posible, montar el soporte de pipetas relleno de fármaco a un traductor de una sola dimensión piezoeléctrico (por ejemplo Piezojena PA-100 o Burleigh PZM-150) que es capaz de aceptar una entrada de voltaje analógico (de nuevo, desde el sistema de adquisición), que es luego montado en el micromanipulador de alta precisión (Sutter MP-285). Un traductor piezoeléctrico es útil debido a que el movimiento de la pipeta relleno de fármaco dentro y fuera de la rodaja, incluyendo el tiempo y la velocidad de entrada / salida, puede ser más fácilmente controlados y reproducidos de experimento a experimento. Al estudiar los nAChR, los efectos desensibilizantes de fuga de la nicotina de la pipeta relleno de fármaco, si llegaran a ocurrir, se minimizan cuando la pipeta se mueve sólo cerca de la celda con un traductor piezoeléctrico para el momento de la presión de eyección. </li><li> A través del potenciómetro controlado manualmente en el amplificador de control de tensión piezoeléctrico, marque el voltajea su valor máximo. </li><li> Uso del micromanipulador, la posición de la pipeta relleno de fármaco en el segmento en el que la pipeta se expulsa su contenido sobre la celda grabada, y retraer manualmente la pipeta por la reducción de la tensión a cero del amplificador de tensión de control piezoeléctrica. </li><li> Uso de una señal de salida analógica desde el sistema de adquisición de grabación, mueva la pipeta relleno de fármaco en la rebanada durante un período de 250 mseg a partir de 300 mseg antes de la presión de eyección TTL pulso se produce. Retraer la pipeta durante un período de 250 ms, a partir de 50 mseg después del pulso TTL termina. </li></ol>

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El método presentado en este documento es en general útil para el estudio de ligando función del canal iónico en preparaciones de cortes de cerebro. Sin embargo, hay un número de factores que afecten significativamente a la calidad y reproducibilidad de los datos experimentales que resultan de la utilización de este método. Por ejemplo, las corrientes evocadas son muy sensibles al diámetro de la punta de la pipeta de relleno de fármaco. Pequeñas sugerencias causará dificultades con expulsar la solución de fármaco, y con...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Nombre del reactivo</strong</td&gt;<td<strong&gt; Empresa</strong</td&gt;<td<strong&gt; Número de catálogo</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; N-metil-D-glucamina</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; M2004</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; KCl</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P3911</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NaH<sub&gt; 2</sub&gt; PO<sub&gt; 4</sub</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; S9638</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NaHCO<sub&gt; 3</sub</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; S6014</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; HEPES</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; H3375</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glucosa</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; G5767</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Na<sup&gt; +</sup&gt; Ascorbato</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; A4034</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Tiourea</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; T8656</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Na<sup&gt; +</sup&gt; Piruvato</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P2256</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MgSO<sub&gt; 4</sub&gt; • 7H<sub&gt; 2</sub&gt; O</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; 230391</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; De CaCl<sub&gt; 2</sub&gt; • 2H<sub&gt; 2</sub&gt; 0</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; 223506</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NaCl</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; S9625</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Na<sup&gt; +</sup&gt; Pentobarbital</td&gt;<td&gt; Vortech Farmacia</td&gt;<td&gt; 76351315</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Gluconato de potasio</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; G4500</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EGTA</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; E3889</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Mg-ATP</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; A9187</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; GTP</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; G8877</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DSK-Zero 1 vibrante slicer</td&gt;<td&gt; Ted Pella, Inc.</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P-97 Flaming / Brown micropipeta extractor</td&gt;<td&gt; Sutter</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cámara RC-27 Grabación</td&gt;<td&gt; Warner</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TC-344B perfusión controlador calentador</td&gt;<td&gt; Warner</td&gt;<td&gt; 640101</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; SH-27B Solución calentador</td&gt;<td&gt; Warner</td&gt;<td&gt; 640102</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nikon FN-1</td&gt;<td&gt; Nikon</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; C-7500 CCD cámara de vídeo</td&gt;<td&gt; Hamamatsu</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Picospritzer III</td&gt;<td&gt; General Valve Co.</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MP-285 Micromanipulador</td&gt;<td&gt; Sutter</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PA-100 traductor piezoeléctrico</td&gt;<td&gt; Piezosystem jena, Inc.</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 12V40 piezo amplificador</td&gt;<td&gt; Piezosystem jena, Inc.</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axopatch 200B</td&gt;<td&gt; Molecular Devices Corp.</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Digidata 1440A</td&gt;<td&gt; Molecular Devices Corp.</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

la aplicación local de medicamentos para estudiar la función del receptor nicotínico de acetilcolina en rodajas de cerebro de ratón

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

El consumo de tabaco provoca numerosos problemas de salud, incluyendo cáncer, enfermedades del corazón, enfisema y derrame cerebral. La adicción a fumar cigarrillos es un trastorno neuropsiquiátrico frecuente que se deriva de las acciones biofísicos y celulares de la nicotina sobre los receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChR) en todo el sistema nervioso central. La comprensión de los diversos subtipos de nAChR que existen en las áreas cerebrales relacionadas con la adicción a la nicotina es una de las principales prioridades. Los experimentos que emplean técnicas tales como electrofisiología de pinzamiento zonal de célula completa o de dos electrodos grabaciones de tensión de la abrazadera son útiles para la caracterización farmacológica de nAChR de interés. NAChRs expresan las células, tales como células de cultivo de tejidos de mamífero u oocitos de Xenopus laevis, están físicamente aisladas y por lo tanto fácil de estudiar usando las herramientas de la farmacología moderna. Mucho se ha hecho uso de estas técnicas, en particular cuando el receptor diana ya se conocía unnd expresión ectópica se logró fácilmente. A menudo, sin embargo, es necesario estudiar nAChRs en su ambiente nativo: en neuronas dentro de las secciones de cerebro agudamente recogidas de ratones o ratas de laboratorio. Por ejemplo, ratones que expresan &quot;hipersensibles&quot; subunidades de nAChR tales como ratones α4 L9&#39;A 1 y ratones α6 L9 2, permiten la identificación inequívoca de las neuronas en base a su expresión funcional de una subunidad de nAChR específico. Aunque conjunto de células grabaciones patch clamp de neuronas en rodajas de cerebro se realiza rutinariamente por el electrofisiólogo experto, es difícil de aplicar localmente fármacos tales como la acetilcolina o la nicotina a la célula grabada dentro de un corte de cerebro. La dilución de la droga en el superfusato (baño de aplicación) no es rápidamente reversible, y tubo en U sistemas no se adaptan fácilmente para trabajar con secciones de cerebro. En este trabajo se describe un método para la rápida aplicación de activación de nAChR medicamentos a las neuronas registradas en adultos mOuse rodajas de cerebro. Estándar conjunto de células grabaciones están hechos de neuronas en rodajas, y una micropipeta segunda llena de un fármaco de interés es maniobrado en posición cerca de la célula registrada. Una inyección de aire a presión o nitrógeno inerte en la pipeta relleno de fármaco provoca una pequeña cantidad de solución de fármaco para ser expulsado de la pipeta sobre la celda de grabado. Usando este método, nAChR mediada por las corrientes son capaces de resolver con precisión de milisegundos. Tiempos de solicitud de medicamentos puede variarse fácilmente, y la pipeta de relleno de fármaco puede ser retraído y se reemplaza con una nueva pipeta, permitiendo curvas concentración-respuesta a crear para una sola neurona. Aunque se ha descrito en el contexto de nAChR neurobiología, esta técnica debe ser útil para el estudio de muchos tipos de canales iónicos activados por ligando o los receptores en las neuronas de rodajas de cerebro.

En nuestros experimentos, de manera rutinaria grabar de dopamina (DA)-producción de neuronas del área tegmental ventral (VTA) y la sustancia negra pars compacta (SNc). En el modo de fijación de voltaje, presión de aplicación de la acetilcolina o la nicotina a estas células normalmente se traducirá en una corriente rápida, catión hacia dentro que alcanza pico dentro de 100-200 ms (Figura 1A-B). Decaimiento de la corriente es dictada en gran medida por la difusión del fármaco desde el sitio de acción, y s...

En este artículo, se describe un método útil para estudiar ligandos función del canal iónico en las neuronas de rodajas de cerebro agudamente aisladas. Este método implica el uso de una micropipeta de relleno de fármaco para aplicación local de medicamentos a las neuronas registradas utilizando técnicas estándar de patch clamp.

La aplicación local de medicamentos para estudiar la función del receptor nicotínico de acetilcolina en rodajas de cerebro de ratón

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

El objetivo general de este procedimiento es estudiar la función del canal iónico activado por ligando en las neuronas a partir de cortes de cerebro preparados de forma aguda derivados de ratones adultos. Esto se logra extrayendo primero un cerebro intacto de un ratón adulto que ha sido trans Cardi perfundido con líquido cefalorraquídeo artificial especializado. El segundo paso es preparar cortes de cerebro de la región del cerebro de interés en la orientación deseada.A continuación, se identifican un trozo de cerebro individual colocado en una cámara de grabación bajo el microscopio y se identifican las neuronas individuales dentro del corte para su registro. El paso final es el registro de una neurona mediante pinza de parche de célula completa, seguido de la aplicación local de fármacos para activar los canales iónicos activados por el ligando utilizando una segunda micropipeta de vidrio. En última instancia, este método de estudio de los canales iónicos activados por ligandos se utiliza para mostrar las propiedades biofísicas de los receptores nativos en las neuronas vivas.La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la aplicación de baño o la administración de fármacos en YouTube, es que la entrega de fármacos a la neurona grabada es muy rápida y localizada. Se pueden administrar pequeñas cantidades de fármaco y se pueden estudiar múltiples neuronas a partir de un solo corte. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los receptores nicotínicos de acetilcolina, como la determinación de los receptores nicotínicos nativos involucrados en las respuestas biofísicas de la célula, biológicas y conductuales a la nicotina.En este procedimiento, después de sacrificar un ratón adulto y obtener el cerebro, recorte el cerebro en la orientación deseada para incluir el área de interés en una placa de metal enfriada con hielo. A continuación, fije el bloque de cerebro con superpegamento a la superficie de la etapa seca de una cortadora vibratoria. A continuación, sumerja el bloque cerebral en una solución de recuperación NMDG a cuatro grados centígrados y burbujee continuamente la solución con carbógeno.Posteriormente, corte las rodajas de 250 micras de grosor cada una del área del cerebro de interés. A continuación, extraiga una micropipeta de parche estándar con una resistencia de cuatro a seis mega ohmios utilizando el extractor marrón en llamas programable. Llene la micropipeta con una solución de registro intracelular adecuada.A continuación, transfiera un corte a la cámara de registro en la platina de un microscopio vertical y superfusione continuamente el corte con un LCR estándar de registro A carbonatado de 32 grados Celsius a 1,5 a 2,0 mililitros por minuto. Bajo el microscopio, localice y centre el área de interés del cerebro utilizando un objetivo de aire de 10 x. Después de eso, visualice las neuronas individuales utilizando un objetivo de inmersión en agua de infrarrojo cercano de 40x conectado a la óptica de contraste de interferencia diferencial IR y un dispositivo acoplado cargado de infrarrojo cercano de alta velocidad o una cámara de video CCD Bajo observación IR DIC, las neuronas sanas exhiben una membrana plasmática lisa de color gris claro después de la visualización celular.Realice el registro de células completas utilizando técnicas convencionales. Ahora tire de otra micropipeta de abrazadera de parche estándar como antes para producir dos puntas hermanas idénticas de la misma pieza de vidrio con una resistencia óptima de aproximadamente cinco mega ohmios. Rellene una de las micropipetas con la solución de fármaco diluida en un líquido carbonatado de grabación estándar Un LCR apunte la punta hacia abajo y agite la micropipeta llena de fármaco para eliminar las burbujas de aire atrapadas en la micropipeta.A continuación, monte la micropipeta llena de fármaco en un soporte de pipeta conectado al manipulador de microm. El soporte de pipeta debe estar conectado con el tubo a un sistema de expulsión de presión adecuado. Expulse manualmente la presión de tres a cuatro veces a la micropipeta para acumular la presión adecuada detrás de la columna de fluido.A continuación, baje la pipeta de fármaco en la rebanada utilizando el manipulador de micrómicos con I-R-D-I-C. Observación. Coloque la micropipeta de fármaco en la superficie del corte de tejido. Ejecute una expulsión de presión y controle las proximidades de la punta para detectar el movimiento de residuos relacionados con la expulsión y la punta de la micropipeta.Si hay signos de que la punta está obstruida o bloqueada, si la punta está obstruida, retraiga la pipeta y reemplácela por una nueva. Acérquese a la celda grabada en diagonal desde la parte superior de la rebanada. Cuando está en la posición final, la punta de la pipeta llena de fármaco está en el mismo plano focal que la célula registrada y la punta del electrodo registrador, y está a una distancia aproximada de 10 a 40 micras de la célula registrada.Si la punta de la pipeta llena de fármaco está por encima de la célula registrada, la fuerza de la eyección de presión podría interrumpir el sello giga de la célula y, a continuación, registrar las corrientes celulares provocadas por la acetilcolina o la nicotina mientras mantiene las neuronas en modo de pinza de voltaje. Aunque el rechazo de presión se puede activar manualmente cuando se utiliza un pico spritzer tres para obtener resultados más reproducibles, es aconsejable activar el rechazo de presión utilizando el sistema de adquisición y un pulso TTL digital. Para mejorar el experimento, el soporte de pipeta lleno de fármaco se puede montar en un traductor eléctrico pizo de una sola dimensión que es capaz de aceptar una entrada de voltaje analógico, que luego se monta en el micromanipulador de alta precisión.Un traductor eléctrico de pizo es útil porque el movimiento de la pipeta llena de fármaco dentro y fuera de la rebanada, incluido el tiempo y la velocidad de entrada y salida, se puede controlar y reproducir más fácilmente de un experimento a otro. A continuación, ajuste el voltaje a su valor máximo con el potenciómetro controlado manualmente en el amplificador controlado por voltaje eléctrico pizo. Utilice el micromanipulador para colocar la pipeta llena de fármaco en la rebanada.Retraiga la pipeta reduciendo manualmente la tensión a cero en el amplificador controlado por tensión eléctrica pazo utilizando una señal de salida analógica del sistema de adquisición de grabaciones. Mueva la pipeta llena de fármaco en el corte antes de que se produzca el pulso TTL de eyección de presión. Después de que se produzca el pulso, retraiga la pipeta.Esta figura muestra la respuesta representativa de una neurona dopaminérgica a 100 micromolares de acetilcolina aplicada localmente, y esta figura muestra la respuesta representativa de otra neurona dopaminérgica a 100 micromolares de nicotina aplicada localmente. Aquí están los potenciales de acción espontánea de una neurona de dopamina en un corte de cerebro de ratón Alpha six L nine prime S que se mantiene en modo de pinza de corriente. La aplicación de un micromolar de nicotina utilizando un rechazo de presión de 250 milisegundos indujo cambios en la acción, la velocidad de disparo potencial y el potencial de membrana en reposo.Utilizando la búsqueda de umbrales en el software P clamp, se derivó la tasa de disparo instantáneo para clasificar las neuronas según los tipos de respuesta a la acetilcolina neuronas colustres superiores individuales. En un corte de cerebro de ratón Alpha six L nine prims se fijó el voltaje seguido de la aplicación local de nicotina de un micromolar a través de la eyección de presión, las neuronas de tipo uno exhibieron un aumento de los IPC. Después de la aplicación de nicotina, las neuronas de tipo dos exhibieron grandes corrientes internas y aumentaron las EPC en respuesta a la aplicación de nicotina.El traductor eléctrico Pizo ofrece consistencia y protege de las fugas de medicamentos. Una neurona de dopamina VTA en un corte de cerebro de un ratón Alpha six L nine prime S se registró en modo de aplauso de voltaje. Durante la aplicación de un micromolar de nicotina, la pipeta llena de nicotina se maniobró hasta la posición final antes de la eyección a presión y se retrajo después de la expulsión mediante un traductor eléctrico de pazo.Se registró una segunda respuesta dos minutos después de la primera para demostrar que no se había producido ninguna desensibilización N-A-C-H-R. Los experimentos se repitieron con la aplicación de nicotina de 10 micromolares. Una vez más, no se observó desensibilización en la segunda respuesta en comparación con la primera.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tan solo tres horas si se hace correctamente. En algunos casos, se pueden estudiar de 10 a 15 neuronas de un solo trozo de cerebro en un día Al intentar este procedimiento, es importante recordar colocar con precisión la pipeta llena de fármaco para mantener un equilibrio entre la activación completa de los receptores nicotínicos de superficie y la integridad del sello giga.

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Research

Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

Hemos desarrollado una nueva técnica para cuantificar los cambios de los receptores nicotínicos de acetilcolina en las regiones subcelulares de los subtipos específicos de neuronas del sistema nervioso central para comprender mejor los mecanismos de la adicción a la nicotina mediante el uso de una combinación de enfoques que incluyen el etiquetado proteína fluorescente del receptor con el golpe-en el enfoque y espectral imagen confocal.

Imagen confocal espectral de marcado con fluorescencia receptores nicotínicos en Knock-en ratones con administración crónica de nicotina

El tráfico de membrana neuronal controla dinámicamente la membrana plasmática y la disponibilidad de proteína significativamente impactos neurotransmisión. Hasta la fecha, ha sido un desafío para medir el tráfico endocítica neuronal en las neuronas adultas. Aquí se describe un método altamente efectivo, cuantitativa para medir los cambios rápidos en la superficie de la proteína expresión ex vivo en rodajas de cerebro agudas.

Cerebro Slice Biotinilación: Una<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Enfoque medir tráfico de proteínas específicas Región membrana plasmática en adultos las neuronas

Desarrollamos una preparación génica-quimérica del circuito ventral hipocampo-accumbens in vitro que permite obtener imágenes directas en vivo para analizar los mecanismos presinápticos de la transmisión sináptica mediada por los receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs). Esta preparación también proporciona un enfoque informativo para estudiar los mecanismos pre y postsinápticos de la plasticidad sináptica.

Imágenes en vivo de nicotina señalización de calcio inducido y neurotransmisor lanzamiento Junto ventrales hipocampo axones

Este protocolo muestra la implementación de un optimizado N-metil-D-glucamine (NMDG) método de protección recuperación de preparación de corte de cerebro. Una formulación de medios de comunicación solo se utiliza para obtener confiablemente rebanadas de cerebro sano de animales de cualquier edad y para diversas aplicaciones experimentales.

Preparación de rebanadas cerebrales agudas mediante un optimizado N-metil-D-glucamine recuperación protección método

Usa una batería computarizada validada de pruebas neuropsicológicas y neurofisiológicas para el estudio de efectos farmacodinámicos en el sistema nervioso central de drogas desarrollados recientemente en el desarrollo de la fase temprana. Para demostrar la batería, se describen los efectos agudos de la mecamilamina y la reversión de estos efectos por dos fármacos agonistas.

Una batería de pruebas computarizadas para el estudio de efectos farmacodinámicos en el sistema nervioso Central de los fármacos colinérgicos en fase temprana desarrollo de fármacos

Se presenta un método que puede proporcionar más información sobre los eventos principios subyacentes a la neurodegeneración y basado en la técnica de cerebro establecido ex vivo , combinando las ventajas de los experimentos en vivo y en vitro . Además, representa una oportunidad única para comparación directa del grupo tratado y no tratado en el mismo plano anatómico.

Un enfoque alternativo para estudiar acontecimientos primarios en neurodegeneración con rodajas de cerebro de rata Ex Vivo

Microglia, las células inmunes residentes del cerebro, responde rápidamente con cambios morfológicos a modificaciones de su entorno. Este protocolo describe cómo usar microscopía de dos fotones para estudiar la atracción de procesos de microglial hacia serotonina o ATP en rebanadas de cerebro agudo de ratones.

Proyección de imagen de dos fotones de atracción Microglial procesos hacia ATP o serotonina en rebanadas de cerebro agudo

Este artículo presenta un método para el estudio de los receptores acetilcolina nicotínicos (nAChRs) en rebanadas de cerebro de ratón por uncaging de nicotina. Cuando se combina con revisión simultánea abrazadera grabación y láser de 2 fotones microscopía, nicotina uncaging conecta función del receptor nicotínico con morfología celular, proporcionando una comprensión más profunda de la neurobiología colinérgico.

Sondeo de la función de Receptor nicotínico de la acetilcolina en rebanadas de cerebro de ratón mediante fotólisis de destello láser de la nicotina Photoactivatable

Presentamos un protocolo para evaluar el equilibrio entre la liberación de glutamato y el aclaramiento en sinapsis glutamatérgicas corticostriatales en rodajas agudas de ratones adultos. Este protocolo utiliza el sensor fluorescente iGluu para la detección de glutamato, una cámara sCMOS para la adquisición de señal y un dispositivo para la iluminación láser focal.

Indicadores de sinapsis únicas de liberación y aceptación de glutamato en rebanadas cerebrales agudas de ratones normales y Huntington

Este método introduce una técnica simple para la detección de la liberación endógena de monoamina utilizando cortes cerebrales agudos. La configuración utiliza una placa de 48 pocillos que contiene un soporte de tejido para la liberación de monoamina. La monoamina liberada se analiza mediante HPLC junto con la detección electroquímica. Además, esta técnica proporciona un método de detección para el descubrimiento de fármacos.

Un ensayo basado en placas para la medición de la liberación endógena de monoamina en cortes cerebrales agudos

Este protocolo describe la expresión y cuantificación de las subunidades neuronales de los receptores nicotínicos de acetilcolina utilizando la línea celular Neuro-2a de mamíferos. Las etiquetas fluorescentes sensibles al pH y la microscopía confocal permiten una evaluación precisa de la localización de receptores en la membrana plasmática frente a las expresadas en compartimentos intracelulares neutros en pH, facilitando el estudio del tráfico y la modulación farmacológica de nAChR.

Localización de la membrana plasmática y receptores de acetilcolina nicotínica intracelular neuronal mediante imagen cuantitativa en células de mamíferos

Aprende a aplicar fármacos localmente para estudiar receptores nicotínicos de acetilcolina en rodajas de cerebro de ratón adulto mediante técnicas de patch clamp. Este método permite caracterizar propiedades biofísicas de canales iónicos en neuronas vivas.

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La aplicación local de medicamentos para estudiar la función del receptor nicotínico de acetilcolina en rodajas de cerebro de ratón

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