Capilar Fuerza Litografía Cardiaca de Ingeniería de Tejidos
June 10th, 2014
En este protocolo, demostramos la fabricación de sustratos biomiméticos de cultivo de células cardíacas hechos de dos materiales poliméricos distintos utilizando litografía de fuerza capilar. Los métodos descritos proporcionan una técnica escalable y rentable para diseñar la estructura y función de los tejidos cardíacos macroscópicos para aplicaciones in vitro e in vivo.
El objetivo general de este procedimiento es producir sustratos de cultivo celular biomimético para diseñar la estructura y función de los tejidos cardíacos macroscópicos. Esto se logra fabricando primero un maestro de silicona con la arquitectura topográfica deseada mediante grabado iónico reactivo profundo. El segundo paso es transferir el patrón topográfico deseado del maestro de silicio a un molde de PUA utilizando litografía de fuerza capilar asistida por UV.
A continuación, el molde de PUA se utiliza como plantilla para fabricar sustratos de cultivo celular a partir de diversos materiales poliméricos en función de la aplicación deseada mediante litografía de fuerza capilar asistida por UV o mediada por disolventes. El paso final es colocar cardiomiocitos primarios o derivados de células madre en los sustratos de cultivo celular de patrón nanométrico para su posterior análisis. En última instancia, la microscopía de campo claro y la inmunofluorescencia se utilizan para mostrar los cambios en la morfología celular y la disposición contractual de las proteínas dentro de los cardiomiocitos.
La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la impresión por microcontacto, es que la litografía de fuerza capilar produce sustratos de cultivo celular de nanopatrones que pueden inducir la alineación estructural de las monocapas de tejido cardíaco sin depender de la proliferación o migración celular. Aunque este método se puede utilizar para proporcionar información sobre la relación estructura-función de los tejidos cardíacos, también se puede aplicar a otros sistemas, como la mecanobiología del cáncer. Para estudiar el impacto de la topografía de la matriz en la migración celular de Be, comience este procedimiento limpiando la superficie maestra de silicio con etanol o xileno al 100% y secando bajo gas nitrógeno oxígeno.
A continuación, coloque el patrón maestro de silicio con el lado hacia arriba en una placa de Petri para un maestro de silicio con una pipeta de patrón de superficie de dos centímetros por dos centímetros de 40 microlitros de PUA. Luego, coloque una lámina de película de poliéster transparente de cuatro centímetros por cuatro centímetros sobre el PUA, presione hacia abajo sobre la lámina de PET y extienda el PUA, debajo de la lámina, a través de la cara del patrón, usando un rodillo o una superficie de borde plano para que todo el patrón quede cubierto por el prepolímero PUA. A continuación, coloque el prepolímero maestro de silicona y el PET aproximadamente 10 centímetros por debajo de una luz ultravioleta de 20 vatios durante 50 segundos.
Después del curado, retire la película de PET lentamente con pinzas. El PUA debe adherirse a la película de PET con un negativo del patrón nano Silicon Master. Posteriormente, cure los nano patrones P-U-A-P-E-T bajo rayos UV durante al menos 12 horas antes de su uso.
Para limpiar los maestros de silicona, coloque otra película de PET encima del maestro sin la adición de PUA. Exponerlo a la luz ultravioleta durante 50 segundos y retirar la película de PET. A continuación, enjuague el maestro de silicio con etanol al 100% o xileno y séquelo con gas nitrógeno y oxígeno.
En este procedimiento, trate portaobjetos circulares de vidrio de 18 milímetros de diámetro colocándolos en una cámara de ozono durante 10 minutos. A continuación, coloque las correderas en bloques de PDMS para asegurarlas temporalmente y facilitar su manejo. A continuación, aplique una capa de imprimación para vidrio a la superficie del portaobjetos de vidrio.
Deje que la imprimación se seque al aire durante 30 minutos. Ahora coloque las diapositivas de vidrio en un trozo de papel de impresora. Deje caer 10 microlitros de prepolímero de poliuretano en el centro de cada portaobjetos de vidrio y asegúrese de que no se generen burbujas.
Luego, coloque el patrón de molde de PUA boca abajo sobre el portaobjetos de vidrio, disperse el prepolímero de PU uniformemente por la superficie del portaobjetos de vidrio haciendo rodar un rodillo cilíndrico de goma a lo largo del molde de PUA. El papel de la impresora absorberá el desbordamiento de polímero y luego los curará con rayos UV durante 60 segundos bajo una lámpara UV de 20 vatios. Posteriormente, retire la muestra de la fuente de luz ultravioleta y retire con cuidado el molde de PUA del portaobjetos de vidrio recubierto de PU, la polimerización del PU se considera completa.
Cuando el molde de PUA, se despega limpiamente de la muestra y el portaobjetos de vidrio de PU tiene una apariencia iridiscente, coloque las muestras en un desecado para almacenarlas durante un mes. Ahora conecte los cubreobjetos A NFS a una pipeta de plato de poliestireno para cultivo de tejidos de 35 milímetros 20 microlitros de NOA en el fondo de la placa. Coloque suavemente el cubreobjetos de NPPU encima del NOA y deje que el pegamento se extienda y cubra todo el fondo del cubreobjetos después de curar el NOA exponiendo el plato a los rayos UV durante 10 minutos.
A continuación, esterilice el NP SUBSTRATA enjuagándolo dos veces con dos mililitros de solución acuosa de etanol al 70% cada uno durante cinco minutos. Extraer el etanol por aspiración. Deje que el A NFS se seque completamente al aire durante aproximadamente una hora bajo la lámpara de esterilización UV en el gabinete de seguridad biológica.
Para mejorar la adhesión celular, recubra el A NFS con fibronectina durante la noche diluyendo primero la fibronectina en agua di a cinco microgramos por mililitro. A continuación, pipetee dos mililitros de solución de fibronectina en una placa. A continuación, coloque el A NFS en la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante la noche.
Obtenga NR VM, HESC CMS u otras células cardíacas de interés, centrifugar la muestra de células a 1000 RPM durante tres minutos para granular las células. Retire con cuidado el sobrenadante por aspiración y asegúrese de no alterar el pellet. Después de eso, vuelva a suspender las células en el medio de cultivo a una concentración de 4,6 veces 10 a las seis células por mililitro.
Pipetee con cuidado 200 microlitros de suspensión celular en el A NFS esterilizado y asegúrese de que la suspensión celular permanezca en el cubreobjetos. A continuación, coloque las células en la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante cuatro horas para permitir que las células se adhieran al NFS A. A continuación, añada dos mililitros de medios de cultivo calientes adicionales a la placa y vuelva a colocar las células en la incubadora en las mismas condiciones.
Después de 24 horas, retire el medio y lave con dos mililitros de DPBS dos veces para eliminar el exceso de células. Después de eso, agregue dos mililitros de medio de cultivo tibio al plato. Colocar las células en una incubadora en las mismas condiciones y cultivo.
Las células a la confluencia reemplazan los medios cada dos días. Esta figura muestra las imágenes representativas de campo claro de las VM NR después de siete días de cultivo y HESC cms. Después de 48 horas de cultivo, las VMs NR y los CMS HESC en las superficies NP muestran una anisotropía estructural y una alineación evidentes, mientras que los cardiomiocitos en las superficies del patrón UN están orientados aleatoriamente.
El análisis inmunohistoquímico destaca el impacto de la nanotopografía en la alineación del citoesqueleto celular, los microfilamentos de actina y la actina alfa sarcomérica en células cultivadas en el NFS A se alinean a lo largo de las nanocrestas, pero permanecen distribuidas aleatoriamente en las células en sustratos sin patrón. Al intentar este procedimiento, es importante recordar esterilizar los sustratos antes de asentarse en las células, ya que la contaminación puede ser un gran problema después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en biología cardiovascular exploraran la maduración cardíaca y los cardiomiocitos derivados de células madre.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo producir un sustrato de cultivo celular biomimético a través de litografía de fuerza capilar para aplicaciones de ingeniería de tejidos cardíacos.
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Visión general
Este protocolo demuestra la fabricación de sustratos de cultivo de células cardíacas biomiméticas utilizando litografía por fuerza capilar. Los métodos descritos proporcionan un enfoque escalable y rentable para diseñar tejidos cardíacos macroscópicos para diversas aplicaciones.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Ingeniería de tejidos cardíacos
- Técnicas de cultivo celular
- Materiales poliméricos
Antecedentes
- Los sustratos biomiméticos son esenciales para estudiar células cardíacas.
- La litografía por fuerza capilar permite un patrón preciso.
- La ingeniería de tejidos cardíacos puede mejorar los estudios in vitro e in vivo.
- El uso de diferentes materiales poliméricos puede adaptar las aplicaciones.
Propósito del estudio
- Producir sustratos de cultivo celular biomiméticos.
- Ingeniar la estructura y función de los tejidos cardíacos.
- Facilitar el análisis del comportamiento de los cardiomiocitos.
Métodos utilizados
- Fabricación de un maestro de silicona mediante grabado iónico reactivo profundo.
- Transferencia de patrones topográficos a un molde PUA mediante litografía por fuerza capilar asistida por UV.
- Fabricación de sustratos de cultivo celular a partir de varios materiales poliméricos.
- Cultivo de cardiomiocitos para análisis mediante técnicas de microscopía.
Principales resultados
- Transferencia exitosa de patrones topográficos a sustratos de cultivo celular.
- Observación de cambios en la morfología celular.
- Análisis de la disposición de proteínas contráctiles en cardiomiocitos.
- Demostración de la efectividad de los sustratos biomiméticos.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método confiable para crear sustratos biomiméticos.
- La litografía por fuerza capilar es una técnica versátil para la ingeniería de tejidos.
- Estudios adicionales pueden mejorar la comprensión del comportamiento de las células cardíacas.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Capillary force lithography enables scalable fabrication of biomimetic substrata that replicate nanoscale extracellular matrix cues critical for cardiac tissue maturation. This approach supports predictive modeling of cardiomyocyte structure-function relationships, reducing reliance on empirical screening in early discovery. By providing reproducible, alignment-inducing platforms, the method enhances target validation confidence and translational continuity in cardiovascular R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of nanotopography effects on cardiomyocyte alignment and contractile protein organization.
- Operational Value: Provides cost-effective, scalable substrates for high-throughput assessment of matrix-mediated cellular responses.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by isolating topographic variables in cardiac maturation pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable morphological and cytoskeletal readouts via brightfield and immunofluorescence microscopy.
- Operational Value: Delivers reproducible nanopatterned surfaces compatible with primary and stem cell-derived cardiomyocytes.
- Assay Readiness: Facilitates standardized evaluation of compound effects on tissue-level electromechanical coupling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges nanoscale ECM mimicry to functional tissue phenotypes relevant to disease modeling.
- Preclinical Utility: Enables risk-adjusted assessment of regenerative candidates using aligned cardiomyocyte monolayers.
- Mechanistic Insight: Clarifies structure-function relationships without confounding effects from cell proliferation or migration.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery workflows by enabling hypothesis-driven evaluation of matrix topography effects prior to lead optimization stages.
- Discovery Biology: Supports functional target validation through controlled nanotopography-induced phenotypic modulation.
- Screening: Delivers standardized, alignment-inducing substrata for consistent compound screening in cardiac assays.
- Analytics: Provides quantitative imaging-based readouts for assessing cytoskeletal alignment and sarcomeric organization.
- Translational Research: Connects nanoscale substrate design to preclinical-relevant tissue maturation endpoints.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for cardiovascular target validation across multiple therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in cardiac tissue engineering by decoupling topographic cues from biochemical signals.
- Operational Value: Ensures batch-to-batch reproducibility via UV-assisted and solvent-mediated capillary force lithography processes.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by providing predictive, human-relevant in vitro models.
- Portfolio Impact: Enables risk-stratified advancement of cardiac regenerative candidates based on functional tissue metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanofabrication, polymer chemistry, and cell culture techniques.
- Depends on UV curing equipment, precision molding tools, and sterile tissue culture infrastructure.
- Necessitates standardization of fibronectin coating and sterilization protocols across teams.
- Involves adaptation considerations when extending to non-cardiac cell types or disease models.
- Limited by the need for specialized masters and molds, though scalable via replication.
